改良碱性磷酸酶染色法[日期：2008-08-11] 来源： 作者：乔海兵，邢开宇 【关键词】 碱性磷酸酶染色法 1939年Gomori首次提出碱性磷酸酶组织化学染色法用于哺乳动物神经系统血管内皮，1951年Gomori修改了自已的 方法 ，并称为“钙钴法”。1984年Bell在Gomori碱性磷酸酶染色法的基础上进行了改良，用于人脑海马和距状裂区的毛细血管取得成功〔1〕。本文以Bell法为基础，对其法的某些步骤进行了简化和改良， 应用 于脑微血管的 研究 ，同时可以显示出脑微动脉、微静脉。现将此法介绍如下。 1 原理 此方法为金属阳离子沉淀法。以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，光镜下呈黑色〔2〕。 2 方法 取材 标本在24 h内取出,切成2 cm×2 cm×2 cm的组织块，放入4 ℃冰箱中保存。尽快放入固定液中固定24 h以上。 新鲜固定液的配制：无水氯化钙 5 g；巴比妥纳 g；纯甲醛液 5 ml；蒸馏水 488 ml。 脱水 组织固定好之后，移入70％的酒精24 h，依次移入85％酒精4 h，无水酒精，丙酮(1∶1)溶液4 h，无水酒精,乙醚(1∶1)溶液中4 h。 包埋 将脱水之后的组织块修整，移入5％的火棉胶溶液中浸泡包埋，放入4 ℃冰箱中，1周后可成块。 切片 切片厚度在60 μm左右，置入75％酒精中。 孵化 将切片放入孵化液中，在37 ℃恒温箱内孵化2 h～4 h。孵化液的配制：β甘油磷酸钠 g;无水氯化钙 g;巴比妥钠1 g;蒸馏水200 ml。 染色 将孵化好的切片快速更换3次蒸馏水，马上置入％硝酸铅溶液中5 min，快速更换3次蒸馏水，然后放入2％硫化铵溶液中3 min，再快速更换3次蒸馏水。 裱片、脱水、封片 裱片后脱水，二甲苯透明封片。 3 改良措施 取材要新鲜，以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。固定液和孵化液配好之后，可不调其pH值，只需用pH试纸测试固定液呈弱酸性，孵化液呈弱酸性即可。包埋过程中 应用 梯度包埋法，火棉胶浓度最高不能超过10％。先将组织块放入5％的火棉胶溶液中，留一小开口，置入4 ℃冰箱中，以利于酒精挥发，每天给容器加满火棉胶。2 d～3 d后改换10％的火棉胶，直至包埋好为止。包埋好的组织块应硬度适宜，用手指轻按可留有指纹，但不易碎。孵化过程适当延长，以利于内皮细胞碱性磷酸酶与孵化液充分反应。在裱片过程中由于切片较厚，切片很容易脱落。可采用先透明后封片的办法，既不 影响 切片的透明度，片子也不容易脱落。 4 讨论 碱性磷酸酶染色属于组化呈色法，由于此法对微血管显色均匀、充分，并可较好的反映正常微血管的 自然 扩张状态，有效地避免了血管灌注法的种种缺憾，而且此法经多次改良，使操作 方法 更为简单，呈色时间缩短，因而成为 目前 较为流行的一种微血管形态学的 研究 方法〔3〕。但Hunzlker等认为，由于小静脉内皮细胞碱性磷酸酶分布不集中，活性较低，因而微静脉难以显示。我们在研究过程中对碱性磷酸酶法进一步改良之后，可显示大量的带有三角形膨大的血管(见图1)，而这一特点正是微静脉所特有的，所以我们认为，并非微静脉用此法不能显示，而是在实验过程中pH值、温度掌握不准所致。 参考 文献 ： 〔1〕王有伟，陈以慈.碱性磷酸酶染色法(钙铅法)在研究人脑和心脏微血管方面的应用〔J〕.解剖学杂志，9(3)：227. 〔2〕杜卓民．实用组织学技术〔M〕.北京：人民卫生版社，1982：309. 〔3〕张为龙.脑血管研究近况〔J〕.临床解剖学杂志，1986，4：118.
生化酶类项目室内及室间质控评价与分析目前，随着《医疗事故处理条例》举证颠倒的需要，医学检验质量控制工作显得尤其重要，检验质量的科学治理受到广泛重视。我科在做好室内质控的同时，参加了历年来生化室间质控活动。本文主要对我科生化酶类项目室内、室间质控结果进行了评价和分析。1 材料、方法及项目1．1 质控血清 室内进口液体质控血清BackmanLevel 1(L1)和Level 3(L3)两个浓度水平，由金坛试剂站提供。室间质控血清由省临检中心提供。1．2 试剂、仪器及方法学分类 使用上海复旦张江公司的酶类生化试剂，并在岛津CL-7200全自动生化分析仪上按使用说明优化编程测定。1．3 测定时间、方式 2个批号的室内质控血清天天上午随机顺序上机丈量，天天丈量一次。室间质控血清按临床中心要求进行。酶类项目反应温度是37℃ ，每月均对结果进行统计处理，并在每季度28日前寄回省临床中心。我室对22项进行了测定评价，其中酶类项目7项，分别是ALT、AST、ALP、GGT 、CK 、LDH—L、AM Y。1．4 评价方式 靶值；标准差(S)；变异系数(CV)；均匀误差；组内室间质评靶值，标准差，变异系数。2 结果7种酶类项Et室内质控评价结果见表1，室间质控评价见表2，均匀误差见表3。室内质评7种酶类项目S、RCV均小于组内相同条件实验室均匀水平，室间质评按PT评价方案均符合，各项得分均为100分。3 讨论近年来，随着省临检中心同一订购室内质控品，我科完善了室内质量控制制度，并对工作职员进行了质控专题培训，为进步生化检验质量建立了良好的基础。采用了室内质控CV和室间质控cV同步评价方式，及时了解和把握了我科结果正确与否以及在全省质量控制活动中出现的题目，查找和分析结果出现误差的原因，寻求解决的方法，进步了我科生化质量治理水平。室内质控两个批号血清的均匀值，从表3统计来看，我室ALT、AST、ALP、CK、AMY 质控血清L1均匀误差为，GGT均匀误差为，室间质控各项结果在 之间。分析原因可能由于仪器试剂冷躲室故障使试剂质量受到影响，同时省中心质控尚有特殊对待可能。通过使用“同一”浓度质控物做室内质控，使得各参评单位有了一个相对恒定的“标准”，可利用“中心”的反馈信息，经常性校对本实验室的测定结果，以求得与其他实验室结果的一致。可见使用全省相同浓度的质控血清且认真测定，按时回报室内质控结果，对进步室间质评成绩的意义很大。
又称酵素。电话细胞产生的具有催化功能的蛋白质。目前已发现2000多种。分子量在数万至数十万之间。生物体内的含量一般极少，能参与生物体的各种生理生化活动，起催化剂的作用。酶不同于一般的催化剂，它有特殊的催化能力，在常温和常压下其催化效率比一般催化剂高10的7次方~10的13次方倍，如一个过氧化氢酶分子在一分钟内能使500万个过氧化氢分子分解为水和氢，比铁离子的催化效率高10的9次方倍。酶还有严格的专一性，一种酶一般只能专一地催化某一种或某一类化学反应。其缺点是不稳定，易受外界条件（如酸、碱和热等因素）的影响而变性失活。工业上主要利用微生物发酵法生产各种酶制剂，其中应用最多的是淀粉酶制剂和蛋白酶制剂
又称酵素。电话细胞产生的具有催化功能的蛋白质。目前已发现2000多种。分子量在数万至数十万之间。生物体内的含量一般极少，能参与生物体的各种生理生化活动，起催化剂的作用。酶不同于一般的催化剂，它有特殊的催化能力，在常温和常压下其催化效率比一般催化剂高10的7次方~10的13次方倍，如一个过氧化氢酶分子在一分钟内能使500万个过氧化氢分子分解为水和氢，比铁离子的催化效率高10的9次方倍。酶还有严格的专一性，一种酶一般只能专一地催化某一种或某一类化学反应。其缺点是不稳定，易受外界条件（如酸、碱和热等因素）的影响而变性失活。 工业上主要利用微生物发酵法生产各种酶制剂，其中应用最多的是淀粉酶制剂和蛋白酶制剂。淀粉酶主要用于纺织业进行棉布退浆，食品工业上使淀粉水解生成葡萄糖。蛋白酶大量用于皮革脱毛、蚕丝脱胶等。酶可作药物用于治病，如多酶片和胃蛋白酶是常用的助消化药。尿激酶可溶解血栓，是心肌梗死的急救药物。胰蛋白酶、糜蛋白酶等用于外科清创、化脓、腹腔浆膜粘连等的治疗。天门冬酰胺酶可使某种类型的白血病缓解。在分析和化验中使用酶，发展了许多快速、灵敏、专一的新方法，如在电极外包一层含葡萄糖氧化酶的薄膜，制成酶电极，用于测定血糖浓度，1分钟就可测1个样品，使化验速度显著加快。在饲料中添加一定量纤维素酶可使饲料中的纤维素水解生成葡萄糖，提高饲料的营养价值。
一、基因疫苗的诞生自1796年英国医生琴娜(Jener)首次采用牛痘苗以来,疫苗已在世界范围内被广泛应用,200多年来各种疫苗已经帮助人类战胜了包括天花在内的多种传染病.然而,现有的疫苗主要有两种：第一种疫苗是传统疫苗，即弱毒活苗和灭活苗，如鸡新城疫弱毒苗，猪瘟灭活苗，它是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防疾病的发生；第二种疫苗是基因工程苗，它是通过基因工程，先分离得到具有强烈免疫原性但无毒性的抗原蛋白的编码基因，然后导入表达载体中，再在宿主细胞表达出重组抗原蛋白，经分离纯化后的重组抗原蛋白作为疫苗接种如重组乙肝疫苗。但它存在一些不可忽视的缺陷如:灭活疫苗难以诱发细胞免疫,需多次免疫注射;亚单位疫苗免疫原性差;减毒活疫茵存在毒性回升的危险等问题.因此,现在对一些传染病仍缺乏相应的安全有效的疫苗. 第三代疫苗基因疫苗的问世,为解决这些难题带来了希望.基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因治疗（genetic therapy）技术的基础上发展而来的。基因治疗是从20世纪80年代发展起来用于预防和治疗疾病的最具革命性的生物医学医疗技术，其原理是将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。1990年Wolff JA等在进行基因治疗试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang 、 DC等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。（注：1）概括起来，基因疫苗就是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。二、核酸免疫的作用机理目前对核酸免疫作用机理的认识主要还仅限于理论推测，且多数资料来自基因治疗试验，二者在作用机理上很相似。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的呈递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动子作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，最终在细胞膜表面被CDS十细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与（MHC）Ⅱ分子结合，运到细胞表面被 CD4＋细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞，产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进入组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4＋和CD8＋细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。 CorrM等（1996）的研究表明，从转染DNA得肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达， I类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。 三、基因疫苗质粒载体的构建获得准确的抗原编码基因并将它插入到合适的载体DNA上，是发展基因疫苗的主要工作。1、编码抗原蛋白基因的分离制备DNA疫苗首先要获得编码抗原的基因，一般选择编码病原体表面糖蛋白的基因。抗原蛋白产生后可在宿主体内正确糖基化，从而诱导对病原体的免疫应答反应；对于易变异的病原体，最好选择各种变型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，这样可对各种变异的病原体产生免疫应答反应，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。2 目的基因质粒的载体构建基因疫苗大多采用质粒作载体。一般说来，基因疫苗质粒载体至少包括5个主要的部件：（1）细菌复制子，以便质粒DNA在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝，但不能在宿主细胞（真核细胞）中复制；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆（菌株）；（3）真核生物的启动子、增强子、终止子、内含子等转录调控元件；（4）编码抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信号序列，以保证mRNA翻译时适时终止。另外，基因疫苗质粒载体通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1细胞的免疫活性。四、严重创伤后全身性炎症反应综合征及免疫调节治疗严重创伤后机体免疫功能表现为双向性改变。一方面表现为以吞噬功能和白细胞介素-2（IL- 2）等产生降低为代表的免疫受抑状态；另一方面表现出以全身性炎症反应综合征为特征的过 度炎症反应。正是这二方面共同作用构成了创伤后机体免疫功能紊乱，诱发多器官功能不全综合症（Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS）。下面就全身性炎症反应综合征和免疫调节治疗作一综述。
免疫学的发展 摘 要：免疫学发展历史可分为： 经典免疫学时期:从18世纪末至20世纪中叶，人们对免疫功能的认识从人体现象的观察进入了科学实验时期。 近代免疫学时期:20世纪中叶—60年代，否定了长期以来机体免疫反应是对外源抗原的特有反应，认为免疫反应是机体识别“自己”和“非己”的普遍生物学现象。现代免疫学时期:阐明了免疫球蛋白的分子结构与功能，从器官，细胞和分子水平揭示了机体另一重要生理系统，即免疫系统的存在。自此，免疫学已发展成为一门独立的生物学科。 1.免疫学开创阶段 早在我国南宋时期，公元11世纪时，我国创造性地发明了人痘苗，即用人工轻度感染的方法，达到预防天花的目的。这实际上是免疫学的开端。至17世纪时，不但在我国已普遍实行以人痘苗接种预防天花，而且也引起邻近国家的注意，人痘法已传入朝鲜、日本及俄国，并由俄国传入士耳其，后经中东再传入欧洲。1721年英国驻土耳其公使夫人Montagu将人痘法传入英国，在英国曾进行了人体实验；把接种人痘者移居至天花流行区，结果发现接种者均获得免疫力。 2.免疫学的兴建阶段 继人痘苗以后，免疫学上的一个重要的发展是Jenner首创的牛痘苗。他观察到挤牛奶女工得过牛痘以后，就不再得天花的事实，通过长期的研究，证实牛痘苗可以预防天花。牛痘给人接种后，只引起局部反应，对人的毒力并不增加。因牛痘苗对于人体无害，以后它就完全代替了人痘苗。 自Jenner发明牛痘苗后，免疫学的发展停滞了将近一个世纪。到19世纪末，由于微生物学的发展，相继地发现了许多病原微生物，免疫学也随之迅速发展。其中Pasteur受到人痘和牛痘苗的影响，通过系统研究，找到用理化和生物学方法，使微生物的毒力减低，以减毒株制备菌苗或疫苗，如炭疽菌苗、狂犬病疫苗等。Pasteur减毒苗的发明，不但为实验免疫学建立了基础，也为疫苗的发展开辟了前景。 随着研究的进展，免疫现象所涉及的本质问题就必然要被提出来。19世纪末对于抗体免疫机理的认识，存在着两种不同的学术观点。 Ehrlich提出免疫反应必须具有其化学反应基础，血清中的抗体是抗感染免疫的重要因素，即体液免疫学说。1904年Arrheniius在研究抗原一抗体反应时提出免疫化学概念。免疫化 学研究首先从Landsteiner用偶氮蛋白人工抗原研究抗原－抗体反应的特异性问题开始。Haurowitz、Breinl及Marrack等在此领域内丰富了研究的成果。Mitchnikoff所提出的细胞免疫学说认为免疫由体内的吞噬细胞所决定。体液免疫和细胞免疫学说两种理论在当时曾有着不同程度的争论，然而它们只是说明了复杂免疫机理的一面，本身都存在着一定的片面性。 3.现代免疫学 20世纪的60年代，免疫学有了迅速进展，最大的突破是对体内淋巴细胞的种类和功能有了进一步的认识。Glick发现早期摘除鸡的腔上囊可影响抗体的产生。Miller在新生期小鼠中进行胸腺摘除实验，发现此种动物不能排除同种异体植皮，证明了胸腺在多数淋巴样组织的发生以及维持免疫应答的完整性上是必需的。Claman，Miller，Mitchel1，Davies等提出了T淋巴细胞和B淋巴细胞的概念。Good等对临床上免疫缺陷症病人进行观察，从先天性无胸腺Di-George综合征和先天性无丙种球蛋白血症病人中也证实了胸腺的免疫功能和存在两类淋巴细胞。由于这些研究成果，使视机体免疫应答过程为单纯化学反应的片面看法得到了纠正，并转向以生物学观点来看待免疫学。使人们逐渐考虑到免疫应答是机体对“自身” 和”异己”的识别与反应的生物学现象。 免疫学发展现状 在组织学、细胞学研究的基础上，在医学和临床医学的推动下，免疫学研究采用生物化学、分子生物学的理论、方法和技术，呈现出五彩缤纷，迅速发展的景象。 在生物膜研究方面，由于利用荧光抗体技术，改变了在膜研究中所谓“单位膜”结构的错误观念，提出了“流动嵌镶”学说。观念的改变，大大地推动了膜的研究，现在了解到生物分子与膜上相应受体结合而发出信号，进而传递到细胞质和细胞核内，使一些酶被激活，进而使一些基因启动。这些研究成果应用于免疫学的研究方法，并得到了进一步的发展。例如抗原传递细胞所传递的抗原与T细胞受体结合，导致T细胞的激活。激活的T细胞释放细胞因子与B细胞和巨噬细胞膜上受体结合，使B细胞分化增殖，形成抗体分泌细胞并释放大量抗体分子，使巨噬细胞吞噬和消化能力大大加强。 于是通过以膜介导的细胞之间的识别、信息传递、细胞激活以及出现的继发效应：酶的激活、基因开关的启动、抗体和细胞因子的释放等等，成为目前免疫学研究的热点。 在生物化学、分子遗传学和分子生物学方面，抗体的分子结构是用生物化学分离分析技术，对多发性骨髓瘤蛋白进行研究的基础上搞清楚的。它是免疫球蛋白分子的结构与功能关系的一个突破口。 这对免疫学研究中抗原抗体结合（包括沉淀、凝集、中和毒素、中和病毒等）、提供抗体多样性的基因重排、抗原-抗体复合物激活补体系统、IgE抗体诱发的变 态反应等等分子基础的研究，提供了有力的依据，并推向一个新的高度。 4. 21世纪的免疫学及其展望 1990年启动人类基因组计划，于2003年4月人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划全部完成。生命科学的研究开始转入后基因组学时代，即蛋白组研究时代，其研究结果将会极大地推动免疫学的发展。 21世纪免疫学的研究未来可能会注重以下几个方面的研究： 1．基因表达调控、顺序及其表达产物功能的研究 2．更重视整体水平免疫机理的研究 3．防治及诊断疾病方面的研究 4．免疫系统及功能的生物进化方面的研究 免疫学已成为生命科学的的领头学科之一，免疫学在今天的地位是极高的，对人类的健康上贡献也极为重要，随着技术理论的日益成熟，相信会带来更为好的成果。 参考文献： [1]孙泉, 佘锐萍, 王德成等. 肥大细胞在机体防御反应中的作用. 动物医学进展. 2007,28(8):83-86. [2] Martin Metz, Marcus Maurer. Mast cells-key effector cells inimmune responses. TRENDS in Immunology. 2008,5(11). [3] 杨 莉, 刘 莉, 黄 亮, 等. 疾病或被改变中的生命史诺贝尔生理学或医学奖获得者100年图说［M］. 重庆: 重庆出版社, 2006: 1-505. [4] 王秀芬. 战胜瘟疫: 从诺贝尔医学奖看20世纪免疫学进展［J］. 自然辩证法研究, 2003, 19(10): 67-71.
改良碱性磷酸酶染色法[日期：2008-08-11] 来源： 作者：乔海兵，邢开宇 【关键词】 碱性磷酸酶染色法 1939年Gomori首次提出碱性磷酸酶组织化学染色法用于哺乳动物神经系统血管内皮，1951年Gomori修改了自已的 方法 ，并称为“钙钴法”。1984年Bell在Gomori碱性磷酸酶染色法的基础上进行了改良，用于人脑海马和距状裂区的毛细血管取得成功〔1〕。本文以Bell法为基础，对其法的某些步骤进行了简化和改良， 应用 于脑微血管的 研究 ，同时可以显示出脑微动脉、微静脉。现将此法介绍如下。 1 原理 此方法为金属阳离子沉淀法。以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，光镜下呈黑色〔2〕。 2 方法 取材 标本在24 h内取出,切成2 cm×2 cm×2 cm的组织块，放入4 ℃冰箱中保存。尽快放入固定液中固定24 h以上。 新鲜固定液的配制：无水氯化钙 5 g；巴比妥纳 g；纯甲醛液 5 ml；蒸馏水 488 ml。 脱水 组织固定好之后，移入70％的酒精24 h，依次移入85％酒精4 h，无水酒精，丙酮(1∶1)溶液4 h，无水酒精,乙醚(1∶1)溶液中4 h。 包埋 将脱水之后的组织块修整，移入5％的火棉胶溶液中浸泡包埋，放入4 ℃冰箱中，1周后可成块。 切片 切片厚度在60 μm左右，置入75％酒精中。 孵化 将切片放入孵化液中，在37 ℃恒温箱内孵化2 h～4 h。孵化液的配制：β甘油磷酸钠 g;无水氯化钙 g;巴比妥钠1 g;蒸馏水200 ml。 染色 将孵化好的切片快速更换3次蒸馏水，马上置入％硝酸铅溶液中5 min，快速更换3次蒸馏水，然后放入2％硫化铵溶液中3 min，再快速更换3次蒸馏水。 裱片、脱水、封片 裱片后脱水，二甲苯透明封片。 3 改良措施 取材要新鲜，以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。固定液和孵化液配好之后，可不调其pH值，只需用pH试纸测试固定液呈弱酸性，孵化液呈弱酸性即可。包埋过程中 应用 梯度包埋法，火棉胶浓度最高不能超过10％。先将组织块放入5％的火棉胶溶液中，留一小开口，置入4 ℃冰箱中，以利于酒精挥发，每天给容器加满火棉胶。2 d～3 d后改换10％的火棉胶，直至包埋好为止。包埋好的组织块应硬度适宜，用手指轻按可留有指纹，但不易碎。孵化过程适当延长，以利于内皮细胞碱性磷酸酶与孵化液充分反应。在裱片过程中由于切片较厚，切片很容易脱落。可采用先透明后封片的办法，既不 影响 切片的透明度，片子也不容易脱落。 4 讨论 碱性磷酸酶染色属于组化呈色法，由于此法对微血管显色均匀、充分，并可较好的反映正常微血管的 自然 扩张状态，有效地避免了血管灌注法的种种缺憾，而且此法经多次改良，使操作 方法 更为简单，呈色时间缩短，因而成为 目前 较为流行的一种微血管形态学的 研究 方法〔3〕。但Hunzlker等认为，由于小静脉内皮细胞碱性磷酸酶分布不集中，活性较低，因而微静脉难以显示。我们在研究过程中对碱性磷酸酶法进一步改良之后，可显示大量的带有三角形膨大的血管(见图1)，而这一特点正是微静脉所特有的，所以我们认为，并非微静脉用此法不能显示，而是在实验过程中pH值、温度掌握不准所致。 参考 文献 ： 〔1〕王有伟，陈以慈.碱性磷酸酶染色法(钙铅法)在研究人脑和心脏微血管方面的应用〔J〕.解剖学杂志，9(3)：227. 〔2〕杜卓民．实用组织学技术〔M〕.北京：人民卫生版社，1982：309. 〔3〕张为龙.脑血管研究近况〔J〕.临床解剖学杂志，1986，4：118.
生化酶类项目室内及室间质控评价与分析目前，随着《医疗事故处理条例》举证颠倒的需要，医学检验质量控制工作显得尤其重要，检验质量的科学治理受到广泛重视。我科在做好室内质控的同时，参加了历年来生化室间质控活动。本文主要对我科生化酶类项目室内、室间质控结果进行了评价和分析。1 材料、方法及项目1．1 质控血清 室内进口液体质控血清BackmanLevel 1(L1)和Level 3(L3)两个浓度水平，由金坛试剂站提供。室间质控血清由省临检中心提供。1．2 试剂、仪器及方法学分类 使用上海复旦张江公司的酶类生化试剂，并在岛津CL-7200全自动生化分析仪上按使用说明优化编程测定。1．3 测定时间、方式 2个批号的室内质控血清天天上午随机顺序上机丈量，天天丈量一次。室间质控血清按临床中心要求进行。酶类项目反应温度是37℃ ，每月均对结果进行统计处理，并在每季度28日前寄回省临床中心。我室对22项进行了测定评价，其中酶类项目7项，分别是ALT、AST、ALP、GGT 、CK 、LDH—L、AM Y。1．4 评价方式 靶值；标准差(S)；变异系数(CV)；均匀误差；组内室间质评靶值，标准差，变异系数。2 结果7种酶类项Et室内质控评价结果见表1，室间质控评价见表2，均匀误差见表3。室内质评7种酶类项目S、RCV均小于组内相同条件实验室均匀水平，室间质评按PT评价方案均符合，各项得分均为100分。3 讨论近年来，随着省临检中心同一订购室内质控品，我科完善了室内质量控制制度，并对工作职员进行了质控专题培训，为进步生化检验质量建立了良好的基础。采用了室内质控CV和室间质控cV同步评价方式，及时了解和把握了我科结果正确与否以及在全省质量控制活动中出现的题目，查找和分析结果出现误差的原因，寻求解决的方法，进步了我科生化质量治理水平。室内质控两个批号血清的均匀值，从表3统计来看，我室ALT、AST、ALP、CK、AMY 质控血清L1均匀误差为，GGT均匀误差为，室间质控各项结果在 之间。分析原因可能由于仪器试剂冷躲室故障使试剂质量受到影响，同时省中心质控尚有特殊对待可能。通过使用“同一”浓度质控物做室内质控，使得各参评单位有了一个相对恒定的“标准”，可利用“中心”的反馈信息，经常性校对本实验室的测定结果，以求得与其他实验室结果的一致。可见使用全省相同浓度的质控血清且认真测定，按时回报室内质控结果，对进步室间质评成绩的意义很大。
又称酵素。电话细胞产生的具有催化功能的蛋白质。目前已发现2000多种。分子量在数万至数十万之间。生物体内的含量一般极少，能参与生物体的各种生理生化活动，起催化剂的作用。酶不同于一般的催化剂，它有特殊的催化能力，在常温和常压下其催化效率比一般催化剂高10的7次方~10的13次方倍，如一个过氧化氢酶分子在一分钟内能使500万个过氧化氢分子分解为水和氢，比铁离子的催化效率高10的9次方倍。酶还有严格的专一性，一种酶一般只能专一地催化某一种或某一类化学反应。其缺点是不稳定，易受外界条件（如酸、碱和热等因素）的影响而变性失活。工业上主要利用微生物发酵法生产各种酶制剂，其中应用最多的是淀粉酶制剂和蛋白酶制剂
又称酵素。电话细胞产生的具有催化功能的蛋白质。目前已发现2000多种。分子量在数万至数十万之间。生物体内的含量一般极少，能参与生物体的各种生理生化活动，起催化剂的作用。酶不同于一般的催化剂，它有特殊的催化能力，在常温和常压下其催化效率比一般催化剂高10的7次方~10的13次方倍，如一个过氧化氢酶分子在一分钟内能使500万个过氧化氢分子分解为水和氢，比铁离子的催化效率高10的9次方倍。酶还有严格的专一性，一种酶一般只能专一地催化某一种或某一类化学反应。其缺点是不稳定，易受外界条件（如酸、碱和热等因素）的影响而变性失活。 工业上主要利用微生物发酵法生产各种酶制剂，其中应用最多的是淀粉酶制剂和蛋白酶制剂。淀粉酶主要用于纺织业进行棉布退浆，食品工业上使淀粉水解生成葡萄糖。蛋白酶大量用于皮革脱毛、蚕丝脱胶等。酶可作药物用于治病，如多酶片和胃蛋白酶是常用的助消化药。尿激酶可溶解血栓，是心肌梗死的急救药物。胰蛋白酶、糜蛋白酶等用于外科清创、化脓、腹腔浆膜粘连等的治疗。天门冬酰胺酶可使某种类型的白血病缓解。在分析和化验中使用酶，发展了许多快速、灵敏、专一的新方法，如在电极外包一层含葡萄糖氧化酶的薄膜，制成酶电极，用于测定血糖浓度，1分钟就可测1个样品，使化验速度显著加快。在饲料中添加一定量纤维素酶可使饲料中的纤维素水解生成葡萄糖，提高饲料的营养价值。
怎样写生物小论文1、 在中小学课外科技活动，对生物学科的某一专题是某一现象进行探索研究，把研究过程中枢观察纪录的资料，加工整理，综合分析，去会有共，并指出自己的观点。把上述的工作用文字系统全面的表达出来，这就是生物科学小论文。 2、 学生论文的特点 课题应具体，题目不应过大。因为基础知识薄弱，研究深度浅。生物科技小论文是学生进行生物科技活动的总结，这对扩大学生知识领域、培养能力、发展创造力，都有重要的实践意义。 完成生物小论文课题的方法 小论文课题确定后，怎样去完成研究课题呢？下面分别作些介绍。 （一） 考察法 即调查某一区域内的某些生物种类组成、数目和分布的规性等。如某的去昆虫种类及数目变化;环境宝物种的各种动物吹气候变化的调变，等等。这种研究犯法化钱少，不需要复杂的仪器和设备一般的中小学都可进行。但指导教师事前应适当扑导，让学生与县长掌握一定的动物分类知识，并且事先订好固定的考察计划。 （二） 观察法：就是对某种动植物的个体进行仔细的观察，以了解掌握其生活习性和生长发育的规定性。佩观察的对象必须要有一定的数目，因为只对一个个体进行观察，其必然性的因素太大，回引响研究的结论。观察的同时，应随时注意收集实物资料，使证据更完全，效果更好。 （三） 实验法 在人物改变某个环境因素条件下（如营养、温度、光照等），观察在某一特定环境下，环境对生物产生的引响，找出其中的规定性的研究方法。注意点：1：要有对照组 2:研究的对象要有一定的数目。 例："营养对青蛙蝌蚪发育的影响"。 实验时，分天然水和坦然谁加少是农家肥，两族作对照。试验过程中，除了营养条件不同外，其他条件如蝌蚪的来源、大小、水温、光照等都要尽权，一免其他因素影响了实验。 以上三种方法在实验研究中常有的，以那一中为止，以课题内容、性质而定。但不要用那种方法，都要引导学生进行仔细的观察，特别是在变化过程，要做好计数和测量，记录下来，然后用统计学得出正确的结论
这是姐初一时的日记节选，替你重编了一哈。 为了观察小鱼尾鳍内血液的流动情况，我特意到鱼市买回两条尾鳍色素少俗称玻璃鱼的小鱼。回家后我马上把以前用过的小鱼缸翻出来并且刷干净，然后轻轻将小鱼顺水倒进透明的天蓝鱼缸里。 起先，这两条小鱼很不安定，一直在鱼缸里横冲直撞，大概是由于换了个新环境不适应吧。过了一会儿，小鱼们总算是平静下来了。我透过玻璃看到他们是那么美丽：水晶般通透的身体，小巧的鱼头两侧分别镶嵌着一颗明亮的骨碌碌直转的眼睛，从腮部倒胃根都闪着迷人的蓝绿色的银光，而尾巴却是淡红色的。我猜想这种小鱼的尾巴之所以是红色的可能是因为有血管。 良久，我觉得是时候给小鱼开饭了，就用牙签挑了几条线虫播进鱼缸。可是小鱼没有吃，“也许他们还不饿，也许有人看着他们时他们不敢吃”，我想了想，把鱼缸放在窗台上便去写作业。 晚上六点多，我又去看小鱼，令我出乎意料的是小鱼竟没有吃掉那几条线虫。怎么会这样呢？我冥思苦想，后来觉得小鱼不吃是由于那几条线虫太长太粗了。所以我找出一条又短又细的线虫，用牙签送到小鱼嘴边，果然，小鱼一吸就把虫子吃进肚子里了。谁知小鱼竟然又把虫子吐了出来！难道不是这个原因，而是小鱼根本吃不了线虫？我越来越着急，怕小鱼挨饿，就用我用肉眼能看清的最小的面包屑喂小鱼，小鱼尝了尝又吐了出来。看样子他们是真饿了。我更加着急，最后稀里糊涂地把一条线虫切成很小很小的段儿喂鱼，不料刚好歪打正着，小鱼吃了！我不停地喂他们，直到他们看到牙签上的虫子便扭头游走。 小鱼啊小鱼，你们千万不能有个三长两短呐！（希望能帮到你）
补充蛋白类和维生素类食物。异染性脑白质营养不良是脑白质营养不良一类疾病中最常见的一型。是芳基硫酸酯酶A的活性缺乏，引起脑硫脂沉积于体内，导致中枢神经系统广泛脱髓鞘，以脑白质受影响最重。用甲苯胺蓝染色可见颗粒状的红黄色异染物质沉积在神经元、胶质细胞和巨噬细胞内，也散见于脑白质各处及末梢神经中。肝、肾同时有异染物沉积。本病在大脑中枢神经系统引起的病变是髓鞘几乎完全消失，出现严重的胶质细胞增生，脑白质及其血管周围和末梢神经脱髓鞘区可以见到球形的含半乳糖苷脂的细胞，也可见于淋巴结、脾脏和肺组织中。球形细胞脑白质营养不良发病较早，在出生后4个月即开始出现症状。早期症状表现有易受刺激、肌肉张力减低。病情进行性加重时，可出现肌肉张力增高、四肢伸直、智力很快减退、常有全身性癫痫样发作、快速眼球震颤、体温不稳定、不明原因的持续性体温升高。本病病程较短，多于10个月死亡。脑电图、肌电图、脑脊液检查均有异常。测定白细胞和培养皮肤成纤维细胞内半乳糖脑苷脂酶的活性可以确诊。
一、概述 脑白质营养不良在儿科学领域系一相对较陌生的临床问题，多数儿科医师对这一问题缺乏系统了解。笔者也常常被问及对此类疾患的诊断、治疗问题。带着这些问题和自己临床工作中的诸多疑问，作者查阅了相关文献，特别是我国著名小儿神经病学家左启华教授、吴希如教授新近的著作，结合自己肤浅的临床体会，不揣冒昧，录下拙文，供同道们参考。不当之处，还望大家批评。 脑白质营养不良(leukodystrophy)是指遗传因素所致的中枢神经系统正常髓鞘生长受累的疾病。包括多种遗传病所引起的脑白质髓鞘异常，例如：溶酶体病（异染性脑白质营养不良－MLD等），过氧化物体病（肾上腺脑白质营养不良－ALD等），线粒体病（脑神经肌胃肠病－MNGIE等），髓鞘蛋白编码基因缺陷（Pelizaeus-Merzbacher病），氨基酸、有机酸病（PKU、丙酸血症等），以及其他不明原因的脑白质病（Alexander病等）。随着MRI技术在小儿神经临床的应用越来越多，脑白质病变的诊断明显增多。其中有些属于已知遗传或生化机制的脑白质病，属脑白质营养不良范畴；有些则属于未知病因的脑白质病，其中部分是遗传病，也属于脑白质营养不良，其遗传及生化基础尚待探讨；而另一些则由于免疫、炎症、环境等非遗传性获得性因素所致，属于脑白质脱髓鞘病变。 近年由于医学分子生物的快速进展，一些既往较少认识的脑白质营养不良的基因已经定位克隆，其基因产物的性质已经明确。对这些疾病的临床生化诊断、产前诊断，携带者检出及遗传咨询等，在不少发达国家中均已可进行。临床相对常见的部分脑白质营养不良见表1。神经病理研究证实该组疾病多数属于髓鞘形成障碍疾病(dysmyelinating disease)但其中肾上腺脑白质营养不良兼有脱髓鞘病(demyelinating disease)特点：Canavan病则为髓鞘破坏(myelinolytic)疾病，海棉样变不只累及白质，也累及灰质。 脑白质营养不良的临床表现以逐步进展为特点，早期症状往往易被忽视。原本正常的婴儿或儿童，可逐渐发生肌张力、姿势、运动、步态、语言、进食动作、视觉、记忆学习、行为思考能力等方面的改变。这些征候可逐渐加重，病情进展速度在小儿时期发病者较快。 诊断主要依据：1.临床特点；2.阳性家族史；3.特异性生化检查；4.神经影像学检查。一些发达国家对小儿脑白质营养不良的临床生化与病理形态学诊断途径分几个层次进行：1.一线生化检查有CSF、皮质醇 ACTH实验；2.一线形态学检查有外周淋巴细胞(或脑活体组织)中沉积物；3.二线生化检查有血浆中极长链脂肪酸(VLCFA)，尿中硫脂，白细胞溶酶等；4.二线形态检查有皮肤、神经、肌肉或脑活体标本等；5.三线生化检查为分子遗传学方法。 二、常见脑白质营养不良的诊断与治疗 （一）异染性脑白质营养不良（metachromatic leukodystrophy，MLD）MLD又称为脑硫脂沉积病（sulfatidosis），常染色体隐性遗传，是芳基硫酸脂酶A缺陷所致的髓鞘形成不良。由于编码溶酶体芳基硫酸脂酶A（arylsulfatase A，ASA）的基因MLD突变所引致，MLD位于，其突变种类较多；大致可分为两组：I型突变的患者不能产生具有活力的ASA，其培养细胞中无ASA活性可测得；A型突变患者则可合成少量具有活力的ASA。患者的表型取决于其基因突变的种类：I型突变的纯合子或具2个不同I型突变者在临床上表现为晚期婴儿型；具有I型和A型突变各一者为青、少年型；而2个突变均为A型时，则呈现为成年型。少数本病患者，特别是青少年型的发病不是由于MLD突变所致，其ASA活力正常，这是由于患者缺少一种溶酶体蛋白，硫酸脑苷酯激活因子（SAP1）所造成的。这类患者亦称为"激活因子缺乏性异染性脑白质营养不良"。 按起病年龄及临床征象， MLD可分为晚婴型、幼年型和成年型3型。 晚婴型最多见，占全部病例的60%～70%，其发病率约为1/4万，初生时正常，85%发病前已能正常行走。多在2岁左右起病。早期步态异常，共济失调，斜视，肌张力低下，自主运动减少，腱反射引不出，神经传导速度减慢。后者是由于末梢神经受累之故。中期智力减退、反应减少、语言消失、病理反射阳性、不注视、瞳孔对光反应迟钝、可有视神经萎缩。晚期呈去大脑强直体位，偶有抽搐发作。有球麻痹征。病程持续进展，多在4～8岁间死于间发感染。
楼主是BIT的吗
药剂学的毕业论文
一段充实而忙碌的大学生活即将结束，我们都知道毕业前要通过毕业论文，毕业论文是一种有准备、有计划的检验大学学习成果的形式，写毕业论文需要注意哪些格式呢？下面是我收集整理的药剂学的毕业论文，仅供参考，大家一起来看看吧。
[摘要]
近年来，微生物在药学研究中被广泛应用，展现出良好的发展前景。通过查阅相关的医学文献资料，了解到微生物与药学之间有密切的关系，通过对微生物进行转化和发酵，将其应用到药学研究及生产工作中，展现出微生物在药学中的应用价值及广阔的发展前景。
[关键词]
微生物；药学；发酵
一、微生物与药学的关系
（1）微生物与药学存在着密切的关系，许多抗生素是微生物的代谢产物或合成的类似物，在小剂量情况下，能够有效抑制微生物的存活及生长，不会对宿主产生严重的毒性。在临床应用过程中，抗生素起到了抑制病原菌生长的目的，被广泛应用于细菌感染性疾病的治疗中。除了具备抗感染作用外，一些抗生素自身还具备较强的抗肿瘤活性，被应用于肿瘤化学治疗中。
（2）微生物在医药卫生方面被广泛应用，维生素及辅酶被大量应用。
（3）近年来，人们在微生物学检验的.基础上加大了对药品卫生行业的
关注力量，加大对药品卫生质量进行控制。
（4）药品及生物制剂被广泛应用于生物工程技术生产中，采用工程菌生产胰岛素、生长因子及干扰素等[1]。
二、微生物在药学中的应用
（一）微生物转化在药学中的应用
1、在手性药物合成中的应用
不同的化合物光学活性不同，自身展现出了不同的生物学活性。现阶段，手性药物拥有广阔的发展前景，拆分及不对称合成手性药物成为热点研究问题。在生物体系中，酶展现出了高度的立体选择性，通过利用及筛选微生物或酶的过程，能够产生活性较高及立体结构专一的化合物，是一种可行性和有效性较高的方法。例如，将氯—酮丁酸甲酯及乙酯作为底物，将酮基还原为羟基时，展现出较高的立体选择性。通过生物转化的过程，不仅能够得到立体结构专一的手性化合物，同时也完成了对手性化合物的拆分。微生物转化中的合成手性化合物被广泛应用于制药工业中。
2、在药物代谢中的应用
药物在动物体内代谢是较为复杂的过程，展现出生物学活性功能，会生成有毒性的气体和不良反应的产物，在药学中占有重要位置。现阶段，微生物转化主要是利用产生的代谢产物，将其作为制备代谢产物的标准样品，应用在鉴别哺乳动物代谢产物中，完成对毒理学及药理学的研究。甾体羟基化在哺乳动物体内展现出了较强的生理学特性，是引发外源性甾体药物中毒的主要原因，转化成的相关模型是哺乳动物代谢有用信息的来源，产生的代谢产物对人类的孕激素受体具有较强的亲和能力，对人的糖皮质激素及盐皮质激素受体产生了一定的亲和性，对雄性激素产生了较弱的亲和性。黄腐酚作为一种化合物，被广泛应用于骨质疏松治疗中，通过利用真菌模型来寻找哺乳动物产生的代谢产物，为代谢产物及黄腐酚在哺乳动物体内的生物学活性研究提供了方向。
3、在天然药物中的应用
天然活性药物自身具有资源有限、含量低、结构复杂等特点，增加了药物的开发难度，利用生物转化方法合成有活性的天然产物，为开发新药提供了有效途径。羟基喜树碱是从自然植物中分离和提取出来的，毒性较低，拥有良好的治疗效果，被广泛应用于抗癌治疗中。主要是利用微生物对喜树碱来完成转化。青蒿素具有溶解度低、复燃性高等特点，是一种有效的抗疟药物。加大对其结构的改造，寻找合适的青蒿素衍生物，成为现阶段的重点研究课题。通过微生物转化方法，能够快速寻找到新的青蒿素衍生物[2]。
（二）微生物发酵在药学中的应用
近年来，微生物学基础理论及实验技术发现迅速，微生物学的应用范围越来越广阔。主要是利用微生物发酵来制备各种药物，在医药领域形成了一门独立的微生物药物学科。目前，医学上常见的微生物发酵制品有维生素、抗生素、氨基酸及酶抑制剂等。
生物发酵工艺多种多样，包括菌种的选育、培养及培植。培植出合适的菌种，是发酵工程的前提，菌种需要从自然界中找，但是该种方法寻找到的菌种产量相对较低。到了20世纪40年代，微生物学家开始使用激光、紫外线及化学诱变剂等处理方法来寻找菌种，使筛选出来的菌种更加优良，科学家通过构建工程菌，对其进行发酵，生产出一般微生物不能生产出来的产品。医用抗生素自身的特点包括：
（1）差异独立较大。差异毒力由抗生素的作用机制所决定，被广泛应用于临床抗感染中，抗生素的差异毒力越大，临床应用效果越好。
（2）抗菌活性强。抗生素自身展现出了杀灭微生物及药物抑制等能力，极微量的抗生素就能够展现出抗菌活性作用，抗生素的抗菌活性强弱主要是运用最低抑菌浓度来衡量，最低抑菌浓度是指抗生素能抑制微生物生长的最低浓度，值越小，说明抗生素作用越强。
（3）不良反应及副作用小。抗生素在使用过程中，对人体的毒性较小，对病原菌具有较强的杀伤力，这主要是针对理想的抗生素，一般的抗生素都或多或少会对人体产生一些不良反应及副作用。
综上所述，本文通过对微生物与药学的关系，微生物转化及发酵在药学中的应用进行分析，印证了微生物在药学中的应用可行性及应用价值。因此，制药行业在未来的发展中，需要进一步对微生物进行研究和分析，了解微生物内存在的药学价值，促使其在药学中的价值最大化，提升药物工业生产效果。
参考文献：
[1]张孝林，马世堂，俞浩.浅谈药学专业《微生物学》教学中创新型应用人才培养[J].中国科技信息，2012（7）：229.
[2]任春萍.抗微生物药物的临床应用调查结果分析与药学研究[J].中国医药指南，2015，13（18）：143-145.
药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶( )，异淀粉酶( , Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus ) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌() 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸()。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基(( ～)上生长良好。 枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为～，但在时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在～有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans, 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, , Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, , Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～,α～,α～,α～,α～,α～糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加，麦芽糖含量平均增加了，糊精含量平均减少了高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～和α～糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达，最佳发酵条件下产量可达 .酶的最适作用温度为600C，最适pH值，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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