Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在Oligo软件中使用的是最邻近法（thenearestneighbormethod）。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。
变性过程在94℃进行，一般来说预变性3～5min；退火温度在35～38℃，也可根据引物Tm值来确定，一般退火温度比引物Tm值低3～5℃；延伸温度在72℃，在此温度下Taq酶的效率约为2000bp／min（Kumari等
故图中Tm值介于82°C-87℃之间的熔解峰为非标记探针与不对称PCR扩增的后几十个循环,浓度相对较低的下游引物耗尽时,由浓度相对较高的上游引物扩增得到的单链产物结合形成的局部双链结构的熔解峰,即探针熔解峰。探针峰与产物峰之间的Tm值差异明显。
我用oligo6设计出的引物Tm值要比引物公司给的值高很多，在CNBI上BLAST得到的信息其Tm值又是不一样，到底以哪个为准比较好，我基本按引物公司给的Tm值做一个梯度实验，但是有时候却什么也得不到，RNA肯定是没有问题的，因为内参的目的片段可以扩增...
Tm值★★★两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值序列★整体上碱基不能过偏个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)避免T/C连续，A/G连续3'末端序列★3’末端避免GCrich或ATrich3’末端碱基最好为G或C3’末端碱基尽量避免为T互补性
投必得论文编译：常用生物学软件的安装与应用（五）—强大的工具进行进化树的构建与美化这里是投必得——全专业顶级论文润色专家，有关于论文润色发表的问题都可以和我讨论，我们下一篇文章再见~投必得SCI写作神器大集合！同学们在写论文的时候发现
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