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γδT细胞的抗原识别机制 中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 述评 作者：何维 单位：中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫室，北京 100005 T细胞表面表达两类抗原受体（TCR）：TCRαβ和TCRγδ。TCRαβ可特异地识别由抗原呈递细胞（APC）表面Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子呈递的抗原肽，而TCRγδ则主要以MHC非限制方式识别各类抗原。最近对TCRγδ所识别的抗原类型及方式进行了较为深入的研究，本文就其进展作一述评。 1 TCRγδ的多样性和分布特点提示其抗原识别的特殊性 同TCRαβ和免疫球蛋白(Ig)类似,TCRγδ基因由重组的V、D、J和C区组成。虽然γ、δ位点的V区多样性不及α和β,但其连接区多样性则使TCRγδ存在甚至超过TCRαβ多样性的潜能〔1〕。然而,许多γδT细胞亚群仅取用了其受体库中很有限的一部分,一些特定的Vγ、Vδ和连接区序列的组合导致TCRγδ结构单调化〔1〕。小鼠γδT细胞有3种发育途径：第一组在胎儿胸腺中发育,分批产生的γδT细胞分别进入特定的上皮组织。这些细胞重组单一的γ/δ基因,并具有单一的连接区序列,表现出单一的特异性。Vδ5细胞进入皮肤,Vδ6细胞进入生殖道上皮和舌；第二组在成年胸腺中发育，大多表达Vγ1或Vγ4或少量Vγ2或Vγ7,并具有广泛的连接区多态性,其库容较大，主要分布在外周血中,偶尔也进入粘膜组织；第三组的发育是非胸腺依赖性的，主要为Vγ7和Vγ1,有较大的连接区多态性,主要分布在小肠上皮。因此,γδT细胞的抗原特异性覆盖了从单一特异性到极端可变的范围〔2〕。γδT细胞在不同分布部位的预先设定提示它们可能是识别特定抗原的特殊T细胞群体，而并非象TCRαβ细胞分布一样具有随机性。在人类中,Vδ仅取用δ链中的一种。成人外周血中大于70%的Vδ表达Vδ2,其余为Vδ1。Vδ2与VR9共表达,而Vδ1与Vγ中某一种共表达〔3〕。 2 γδT细胞的抗原识别类型与机制 MHC分子 一些文献报道小鼠和人γδT细胞可识别MHC Ⅰ和Ⅱ类分子。人类外周血γδT细胞(Vδ9)可识别同种异体树突状细胞(DC)/单核细胞表面的MHCⅡ类分子〔4〕。 1987年Matis 等利用同种异体APC在体外刺激无胸腺小鼠的脾细胞建立了一些MHC限制性的γδT细胞系〔5〕。它们识别同种异体细胞上非己的MHC分子并呈现特异性反应，但其特异性不同于传统的αβT细胞。例如,γδT细胞系LBK5可识别MHCⅡ类分子I-E的多个等位基因产物〔6〕。IEK是小鼠Ⅱ类MHC分子，可结合各种肽段和超抗原，刺激αβT细胞活化。Schild 等发现LBK5对IEK识别时,结合于IEK的肽段并不传递特异性，同时经典的抗原处理也未启动〔7〕。各种细胞对LBK5刺激能力的不同都可归结为其表面MHC分子表达的情况，而与细胞来源、类型和影响MHC-肽段装载的因素无关。结合在平皿上的IEK蛋白对LBK5的刺激与表达IEK的细胞引起的刺激强度相仿，这些结果表明LBK5是直接识别IEK分子的。 也有大量报道γδT细胞可识别非经典的MHC类分子。从裸鼠Balb/c脾脏中分离出G8系可识别T10和T22抗原〔6，7〕。Porcelli 等从免疫缺陷病人身上分离出CD1c限制性的γδT细胞。 Schild 等对G8系作了深入研究，发现T10和T22有94％的同源性〔7〕。与LBK5相似，G8克隆对T10/T22的识别不经传统的抗原处理途径。同样，不同细胞对激活γδT细胞的能力也都归于其表面MHC表达的情况，Ⅰ/Ⅱ类抗原处理过程对其并无影响。如小鼠细胞系RMA-S和人细胞系T2在将肽类负载于MHC I类分子上都有缺陷,而转染了T22的RMA-S和T2都可激活G8细胞。非常有意思的是，G8可识别果蝇（Drosophila melanogaster）细胞上表达的T10/T22，而果蝇并不具有与哺乳类相似的免疫系统，也缺乏任何抗原处理-呈递所必需的因子。上述结果表明，这些所谓的MHC限制性的γδT细胞克隆对经典MHC的识别似乎并不通过抗原的处理和呈递。MHC分子作为抗原本身被识别，而这些细胞上负载的肽段也都并不起配基的作用。另有报道，γδ细胞克隆可识别一种单纯疱疹T型跨膜糖蛋白gI〔8〕。在抗原处理缺陷的RMA-S细胞上表达的完整的野生型 gI可被细胞所识别，同样，包被与平皿上的可溶性重组gI-Ig也可被识别，这表明gI是不通过抗原处理和其它分子的呈递而被直接完整识别的。γδT细胞对蛋白抗原的识别似更倾向于直接识别而不经过处理和呈递。特定的MHC分子恰好是作为抗原而非抗原呈递分子被识别的。 非MHC分子 显而易见，相对于TCRγδ庞大的序列多态性，其经典抗原识别的种类还是太少。大量文献显示TCRγδ具有与TCRαβ截然不同的抗原识别途径。目前有两类分子被证明是TCRγδ配体：含磷酸基的非肽类小分子和热休克蛋白。 磷酸化基团 人类主要的γδT细胞亚群Vγ9/δ2可在分枝杆菌感染部位中大量存在，并在体外对细菌和寄生虫起反应。研究发现分枝杆菌中的有效成分是非肽的低分子量（1～3 kD）的化合物，包含碳水化合物骨架和磷酸成分。Constant 等从结核杆菌H37RV株中分离到4种不同的水溶物：TUBag1-4。TUBag4是5'-三磷酸胸苷，其γ-磷酸为一未被确定成分的低分子量基团所取代〔9〕。TUBag3与4结构相似，但为尿苷而非胸苷。1和2为3和4的非核苷酸片段，活性极小。TUBag4可刺激外周血Vγ9/δ2 T细胞的扩增和其它一些特异性的γδT细胞。这些化合物同时存在于微生物和哺乳动物中。由于从分枝杆菌培养滤液或提取物中分离天然抗原比较困难， Tanaka Y 等首先合成了一系列单个碱基的磷酸化合物，并发现其中一些，尤其是单烯基磷酸化合物(Monoethyl),可模拟Vγ9/δ2 T细胞对分枝杆菌的反应〔10〕。其后，他们又报道了此γδT细胞的天然配基：异戊烯焦磷酸盐(Isopentenyl pyrophosphate IPP)和相关的萜类(Prenyl)的焦磷酸化盐衍生物。而用磷酸基团代替焦磷酸基团则可大大削弱它们的抗原性。IPP和相关的萜焦磷酸盐是诸如维生素、脂类和类固醇等亲脂性化合物的活性前体。这些萜焦磷酸盐中间物同时存在于细菌和哺乳类细胞中，人Vγ9/δ2 T细胞亚群对它们的识别也许可以部分解释其对一系列肿瘤细胞系的反应性。上述研究都使用了活化的γδT细胞系，无APC和额外的细胞因子的存在。后继的多数研究结果进一步显示磷酸基团活化γδT细胞需要T-T细胞相互作用，而识别本身则不需要MHC Ⅰ/Ⅱ类分子、CD1、TAP1/TAP2或DMA/DMB的表达。尽管个别研究体系中有APC的存在，但认为是非MHC限制性的，其作用可能与提供γδT细胞生长所需的细胞因子有关。 而Carena 等的研究进一步显示APC表面MHC分子在γδT细胞识别磷酸基团配体中的特殊含义〔11〕。CD94（NKG2-A/B异质二聚体）是大多数γδT细胞表面表达的与MHC I类分子可发生特异性结合的受体。他们发现，CD94与MHC I类分子结合时可下调磷酸化配基对γδT细胞的激活。当该配基处于低浓度时，CD94的抑制作用更明显，从而提高了γδT细胞激活的阈值。在生理情况下，该机制对防止自身免疫应答具有重要意义。 另外一个重要的问题也初步得到了澄清，即TCRCDR3的多样性对Vγ9/δ2 T细胞磷酸化配基的特异性是否产生影响。通过取用一群随机的细胞克隆和不同配基的检验发现，所有的克隆都显示了相同形式的交叉反应性。要想选出对单一配基有特异性的克隆是不可能的。而且，无论用强的或弱的刺激物来扩增，T细胞系或克隆都显示了相同形式的交叉反应性〔12〕。虽然存在此种交叉反应性，但就配基结构而言，这些细胞是高度特异的。磷酸基团的数目和位置以及碳链骨架的类型对T细胞的活化都至关重要。因此，Vγ9/δ2 T寡克隆T细胞亚群具有广泛的交叉反应性而又是配基特异的。 热休克蛋白（hsp） 在1990年前后，有大量的报道显示γδT细胞识别热休克蛋白家族成员。识别hsp的外周血或脐血γδT细胞亚群的表型主要为Vγ9/δ2 ,具有丰富的连接区多态性，最初的发现来自于细菌感染。人类和小鼠γδT细胞识别的主要hsp家族成员为hsp60和hsp65〔13〕。随后又发现一些肿瘤细胞表面高表达热休克蛋白可活化Vγ9/δ2 T细胞，如Daudi淋巴瘤表面hsp60和肺癌细胞表面的hsp72等〔14，15〕。热休克蛋白的单克隆抗体则至少可部分抑制该反应。该反应与靶细胞表面热休克蛋白表达含量呈正相关。在一些自身免疫性疾病中，γδT细胞对靶细胞表面hsp的识别也被证实，如γδT细胞可识别多发性硬化病人少突胶质细胞表面hsp并引起细胞杀伤〔16〕。 hsp作为一类高度保守的分子伴侣蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞中。除了构成性表达之外，在如高温、低氧、放射、感染、中毒等各种应激条件下均可诱导其高表达。热休克蛋白在蛋白折叠、转送和亚基装配中起不可或缺的作用,而且它们在许多免疫应答过程中也发挥作用。它们与一系列蛋白和肽段结合并参与抗原呈递，使得APC能处理其结合的肽段而形成稳定的MHC I类分子-肽段复合物。另一方面，通过在细胞表面表达，hsp也可能作为抗原呈递分子起作用〔17〕，因为它的三维结构N-端肽段结合位点与MHC I类的肽段结合位点的结构相似。 在各种应激条件下，由于hsp诱导高表达而造成了γδT细胞的激活。通过其产生细胞因子和细胞毒活性的作用，γδT细胞可能发挥快速清除应激因素和受损细胞并且启动后继免疫反应的作用。 3 γδT细胞抗原识别的结构基础 综上所述，γδT细胞对抗原的识别与αβT细胞并不相似，而更类似于Ig对抗原的直接识别，并且无MHC限制性。TCRγδ与TCRαβ分子结构比较研究分析结果在一定程度上为此种作用差异性提供了解释。 TCRαβ和TCRγδ的二级结构与Ig类似。它们三者都通过重组V、D、J形成单一的Ig或TCR，从而形成对抗原的特异性。X线衍射研究结果显示Ig和TCRαβ的CDR3环均是识别肽段的关键结构，因此推测γ/δ链的相似区域也起类似作用。Rock 等分析了从小鼠到人Ig和TCR受体链的CDR3长度〔18〕。Ig轻链上CDR3短且长度相对固定，而重链CDR3长且长度范围变化大，这可能提示Ig识别从小分子到大的病原体较大范围内许多不同大小的抗原。TCRαβ的CDR3长度分布范围窄，且α、β链的CDR3长度相近，这可能反映出αβ链的功能需要，即同时接触MHC和结合肽段。TCRγδ的γ链CDR3短，长度范围小，而其δ链CDR3长且变化范围大，因此就CDR3长度而言，TCRγδ更类似于Ig而非TCRαβ。 在混合淋巴细胞反应中，与αβT细胞同种异体反应性克隆相比，识别同种异体MHC分子的γδT细胞克隆频率是很低的；而且大多数细胞克隆有很高的交叉反应性，这在αβT细胞同种异体反应性克隆中是极罕见的，这提示TCRγδ对MHC的反应类似于Ig对MHC的识别。 4 结论与问题 γδT细胞抗原识别的多样性和机制复杂性使人们目前尚难以概括γδT细胞全部的生物学意义。然而现有的研究结果似乎已经揭示了γδT细胞基本功能特点。γδT细胞对抗原的非MHC限制性和无需抗原处理和呈递识别方式提示，在机体内出现机体异常变化（如应激）时，γδT细胞可作出比αβT细胞更迅速的反应。此外，γδT细胞可对αβT细胞不能识别的抗原产生应答，在功能上与后者实现互补。另外，γδT细胞免疫监视功能具有广泛性，因为其识别配体如hsp 及磷酸类小分子物质在自然界中是普遍存在的。在历经长期进化后，通过APC对抗原肽的复杂处理与加工及精确呈递，αβT细胞实现了其高度抗原特异性、严格MHC限制性和周密职责分工（Th和CTL）的免疫应答特点，使免疫系统高效、协作有序而针对性极强地清除外源生物分子或病原体。而γδT细胞则以更广泛、快速和直接的方式对体内应激事件作出反应，同时其反应手段较为笼统，即γδT细胞可同时发挥细胞毒和分泌细胞因子双重功能；但是在某些特定部位如上皮，表达特定和单一TCR受体的γδT细胞似乎为局部高频突发事件而存在。总之，在免疫应答过程中，γδT细胞可能发挥着启动、协调与互补αβT细胞功能的作用。 γδT细胞抗原识别的研究目前在许多方面仍有待深入。γδT细胞识别蛋白抗原时所需要的基本结构要求是什么？在γδT细胞激活中，hsp到底通过何种途径起作用仍然很不明确。γδT细胞对细胞表面hsp分子的识别是直接识别，还是识别其呈递的肽段？事实上，hsp所携带的肽段的作用尚未被明确而完整地研究过。TCR的CDR3多样性究竟有何意义？既然hsp、磷酸类代谢物同时是自己和非己成分，为什么自身反应性的γδT细胞克隆在其发育中未被从细胞库中选择掉? 在这些物质引起的免疫反应中，γδT细胞的特异性是否同时指向外来物和自体成分？只有这些问题的全部澄清，人们才可对γδT细胞的生物功能作出全面和深刻的评价，并且可将其理论成果用于肿瘤和自身免疫病等的治疗。 自94年始，我们对γδT细胞的特性、分布、亚群、受体分子的选择性取用、功能特点及其在肿瘤和自身免疫病的参与作用进行了系统的研究，以期为揭示其功能之谜提供资料和促进其理论成果在疾病的预防、诊断和治疗中的应用。 作者简介：何维，男，43岁。留德医学博士，教授，博士生导师，中国协和医科大学基础医学院副院长，中国医学科学院基础医学研究所副所长。中国免疫学会基础免疫分会委员,北京免疫学会理事,《国外医学免疫学分册》、《中华微生物学和免疫学杂志》、《中国免疫学杂志》编委。94年回国工作后共主持国家重点基础研究发展项目（973）课题、95攻关课题、国家自然科学基金、863生物高科技计划、卫生部基金、国家博士点基金、教委基金和中美、中日和中德合作研究项目及医科院各种课题15项。科研集中在γδ型T细胞在抗感染免疫、肿瘤免疫和自身免疫中的作用，IL-15基因克隆与表达研究及其IL-15转基因瘤苗抗肿瘤作用，超氧化与免疫在衰老中的关系，胸腺退化的基因调控和老年性痴呆免疫学诊断等方面。目前共发表论文35篇（国外8篇），出版专著两部，获省部级科研二等奖一项。

概述随着社会的发展，交通安全问题越来越凸显，传统的汽车安全理念也在逐渐发生变化，传统的安全理念很被动比如安全带、安全气囊、保险杠等多是些被动的方法并不能有效解决交通事故的发生，随着科技的进步，汽车的安全被细化，目前汽车安全分为主动安全、被动安全两种概念。主动安全技术将成未来汽车的研发重点交通安全问题已成为世界性的大问题。据报载，全世界每年因交通事故死亡的人数约50万，因此汽车的安全性对人类生命财产的影响是不言而喻的。随着高速公路的发展和汽车性能的提高，汽车行驶速度也相应加快，加之汽车数量增加以及交通运输日益繁忙，汽车事故增多所引起的人员伤亡和财产损失，已成为一个不容忽视的社会问题，汽车的行车安全更显得非常重要。而传统的被动安全已经远远不能避免交通的事故发生，因此主动安全的概念慢慢的行成并不断的完善。现代汽车主动安全技术的发展趋势汽车安全设计要从整体上来考虑，不仅要在事故发生时尽量减少乘员受伤的机率，而且更重要的是要在轻松和舒适的驾驶条件下帮助驾驶员避免事故的发生。现代汽车的安全技术包括主动安全技术和被动安全技术两方面。而被动安全技术和主动安全技术是保证汽车乘员安全的重要保障。过去，汽车安全设计主要考虑被动安全系统，如设置安全带、安全气囊、保险杠等。现在汽车设计师们更多考虑的则是主动安全设计，使汽车能够主动采取措施，避免事故的发生。在这种汽车上装有汽车规避系统，包括装在车身各部位的防撞雷达、多普勒雷达、红外雷达等传感器、盲点探测器等设施，由计算机进行控制。在超车、倒车、换道、大雾、雨天等易发生危险的情况下随时以声、光形式向驾驶员提供汽车周围必要的信息，并可自动采取措施，有效防止事故发生。另外在计算机的存储器内还可存储大量有关驾驶员和车辆的各种信息，对驾驶员和车辆进行监测控制。例如，根据日本政府“提高汽车智能和安全性的高级汽车计划”，由日本丰田公司研制成功的“丰田高级安全汽车”即具有驾驶员瞌睡预警系统、轮胎压力监测警告系统、发动机火警预报系统、前照灯自动调整系统、盲区监控系统、汽车间信息传输系统、道路交通信息引导系统、自动制动系统、紧急呼叫(SOS)停车系统、灭火系统以及各向安全气囊系统等，其中有些单项设备已投放市场。汽车100多年的发展史中，有关汽车的安全性能的研究和新技术的应用也发生了日新月异的变化，从最初的保险杠减振系统、乘客安全带系统、安全气囊到汽车碰撞试验、车轮防抱制动系统(ABS)、驱动防滑系统(ASR)，到无盲点、无视差安全后视镜及儿童座椅系统的研究，汽车的安全性能正日趋完善。特别是近几年，随着科学技术的迅速发展，越来越多的先进技术被应用到汽车上。目前，世界各国都在运用现代高新科，加紧研制汽车安全技术，一批批有关汽车安全的前沿技术、新产品陆续装车使用，使未来的汽车更加安全。未来汽车电子控制的重要发展方向之一是汽车安全领域，并向几个方向发展：利用雷达技术和车载摄像技术开发各种自动避撞系统；利用近红外技术开发各种能监测驾驶员行为的安全系统；高性能的轮胎综合监测系统；自适应自动巡航控制系统；驾驶员身份识别系统；安全气囊和ABS/ASR。随着更加先进的智能型传感器、快速响应的执行器、高性能电控单元、先进的控制策略、计算机网络技术、雷达技术、第三代移动通信技术在汽车上的广泛应用，现代汽车正朝着更加智能化、自动化和信息化的机电一体化方向发展。汽车主动安全系统为预防汽车发生事故，避免人员受到伤害而采取的安全设计，称为主动安全设计，如ABS，EBD，TCS，LDWS等都是主动安全设计。它们的特点是提高汽车的行驶稳定性，尽力防止车祸发生。其它像高位刹车灯，前后雾灯，后窗除雾等也是主动安全设计。目前安全技术逐渐在完善，有更多的安全技术将被开发并得到应用。汽车主动安全技术ABS（防抱死制动系统）它通过传感器侦测到的各车轮的转速，由计算机计算出当时的车轮滑移率，由此了解车轮是否已抱死，再命令执行机构调整制动压力，使车轮处于理想的制动状态（快抱死但未完全抱死）。 对ABS功能的正确认识：能在紧急刹车状况下，保持车辆不被抱死而失控，维持转向能力，避开障碍物。在一般状况下，它并不能缩短刹车距离。EBD（电子制动力分配系）它必须配合ABS使用，在汽车制动的瞬间，分别对四个轮胎附着的不同地面进行感应、计算，得出摩擦力数值，根据各轮摩擦力数值的不同分配相应的刹车力，避免因各轮刹车力不同而导致的打滑，倾斜和侧翻等危险。ESP（电子稳定程序）它实际上也是一种牵引力控制系统，与其它牵引力控制系统比较，ESP不但控制驱动轮，而且控制从动轮。它通过主动干预危险信号来实现车辆平稳行驶。如后轮驱动汽车常出现的转向过多情况，此时后轮失控而甩尾，ESP便会放慢外侧的前轮来稳定车子；在转向过少时，为了校正循迹方向，ESP则会放慢内后轮，从而校正行驶方向。EBA（紧急刹车辅助系统）电脑根据刹车踏板上侦测到的刹车动作，来判断驾驶员对此次刹车的意图，如属于紧急刹车，则指示刹车系统产生更高的油压使ABS发挥作用，从而使刹车力更快速的产生，缩短刹车距离。LDWS(车道偏离预警系统）该系统提供智能的车道偏离预警，在无意识（驾驶员未打转向灯）偏离原车道时，能在偏离车道秒之前发出警报，为驾驶员提供更多的反应时间，大大减少了因车道偏离引发的碰撞事故，此外，使用LDWS还能纠正驾驶员不打转向灯的习惯，该系统其主要功能是辅助过度疲劳或长时间单调驾驶引发的注意力不集中等情况。胎压监控美国国家公路交通安全管理局 (NHTSA) 已经做出要求，截止2003产品年车重小于或达到4536公斤的所有美国乘用车辆都必须配备胎压监控系统，事后宝马公司就已经把该系统用在全系轿车中。驾驶者可以通过车内提示警告系统来判断轮胎胎压情况是否正常，首先避免了因轮胎亏气出现的行车跑偏，其次在高速行驶时也对乘坐者安全是一种保障。?所用车型：奥迪、宝马、上海通用别克君越、凯迪拉克、雷克萨斯、迈巴赫、梅塞德斯奔驰、沃尔沃等倒车警告/倒车影像/车外摄像头倒车警告这项技术用于在驾驶期间以及驻车时，针对您盲区中的轿车或物体向您发出警告。通常，该系统会在您行车时已经进行响应；它可能会使后视镜内的一个警告标示进行闪烁，同时会发出声音警告，该系统是一个短程检测系统。如：上海通用别克君越车内后视镜就配备此功能，反光镜左边会有一个车体形状的图标，前/后雷达在侦测障碍物时警告标示会给驾驶者以视觉和听觉上的警告。倒车影像和后视摄像机是一体，不仅保护您的轿车，还能够避免在倒车时意外伤及儿童和动物。倒车已经从向下倾斜后视镜或发出声音警告到实时查看。新一代技术包括一个摄像机，它可以与导航系统协同工作，对您身后的一切进行广角拍摄，然后反映在车内屏幕上，从而帮助您倒车或挂接拖车。所用车型：雷克萨斯、上海通用别克君越、梅塞德斯-奔驰等芯片防盗系统财产安全也被人日益关注，一部几十万的轿车被偷盗会让车主受到很大的损失。厂家也绞尽脑汁为轿车加入更多的安全防范系统。通用别克君越不仅在点火钥匙上加入Passkey III安全防盗系统，还针对后行李箱结构进行了改进，变为遥控开启无锁芯防盗模式，大大减低了被盗被撬的几率，给车主财产方面的最大保护。自动感应大灯和/或夜视辅助系统自动感应大灯随车辆周边环境光线影响，系统会自动识别判断。雨雾天气光线不够，大灯会自动亮起给驾驶者提供更安全的行车环境。后期厂家又延伸到自适应大灯系统，这更高级的系统会因方向而调节(在车辆转向时会转动灯光)。它们也可以是车速感应式车灯(可以改变光束的长度或高度)，或者对环境光进行补偿。夜视系统可以有不同的形式，如基本的红外线大灯或热成像摄像机。但是无论采用何种科技，作用都一样：在夜间或者视线不明的情况下，帮助您看清更远处的路面并且辨别接近 1000 英尺外道路上的动物、人或树木。图像在驾驶室中的显示屏上形成，使肉眼难于看清的障碍物体提前被驾驶者掌控，目前博世公司开发的夜视系统则具有以上功能，但价格很是昂贵，即使是超豪华轿车目前也基本为选配系统。相信不久将来这一更高级的系统也会被中高级轿车所选用。所用车型：凯迪拉克、雷克萨斯、林肯、梅塞德斯-奔驰S系等相关运用车型(ASR奔驰/TCS凯迪拉克/TCR丰田/DCT宝马、电子稳定控制系统（ESP博世/DSC宝马/VSC丰田/VDC日产/VSA本田)、陡坡缓降系统（HDC）、自动驻车/上坡辅助系统、高位刹车灯（第三刹车灯）等这些都属于汽车主动安全配置产品。 除了以上这些在操控性方面的主动安全设施外，还有基于图像处理技术以及雷达感应技术，可以提前预防和缓解交通事故的汽车主动安全用品。其中以基于图像处理技术原理的碰撞预警系统为目前汽车主动安全产品中的领航者。最新汽车主动安全技术驱动防滑控制系统VSC车辆稳定控制系统四轮转向控制技术卫星导航与车距控制系统自动刹车系统LWDS车道偏离预警系统LNVS夜视系统FCWS前碰撞预警系统HMWS车距监控系统HUD抬头显示系统最新主动安全产品运用车型1、VOLVO-XC60 城市安全系统，自动刹车。2、奔驰公司，自动报警、自动锁定车速刹车。3、福建东南汽车工业集团----东南（三菱君阁）旗舰版已经配套车道偏离预警系统。4、(VOLVO-S80)配套车道偏离预警；5、( BMW-X5)配套车道偏离预警和HUD抬头显示系统；6、(宝马-745)配套被动式红外夜视系统；7、 新（奔驰-E350）带车道偏离预警和主动夜视系统上市；8、 新（凌志）LS460和E350已经配套视觉和雷达结合防撞系统；9、 现代顶级豪车（雅科仕）带车道偏离预警上市；10、 (雪铁龙C4)配套车道偏离预警系统；11、 英菲尼迪顶级版和起亚k7北京车展也展示带车道偏离警报器系统的车；12、欧洲2012年新车必须强制安装车道偏离预警（LWDS）。国际市场运用国际市场运用综述虽然人们采用各种方法来保证驾驶员的安全，但是如何避免事故发生才是我们对于未来车辆安全的讨论重点。因为只有最大程度地减少事故发生率，才能最好地体现车辆安全。可以预见，主动安全将成为未来汽车安全技术发展的重点和趋势。在不断完善被动安全系统的同时，逐渐地发展和应用主动安全系统，尽量避免事故的发生，结合行人保护的概念和技术的引入，完善对行人的保护是当今汽车安全的发展趋势。通过数据总线进行系统集成，可以将汽车安全的很多方面，例如防驾驶瞌睡装置、轮胎压力监测报警装置、行人碰撞保护装置集成在一起，提高汽车的安全性能。未来智能行人保护系统(IPPS)、高级驾驶员辅助系统、保持车道状态系统、夜视系统、高灵敏度雷达传感器和激光雷达技术的应用将大大提高汽车主动安全的水平。欧盟委员会和日本政府已颁布了新法规来保护行人和其他易受伤的道路使用者。相信随着技术和立法的不断完善，汽车主动安全技术将成为未来汽车安全技术发展的重点。它将与被动安全技术一起发挥作用，保证驾驶员和行人的安全。汽车安全性已经不仅是个技术问题，在某种程度上也是一个重要的社会问题。汽车的主动安全性因其定位于防患于未然，所以有着广阔的发展前景，越来越受到汽车生产企业、政府管理部门和消费者的重视。在汽车业群雄逐鹿的今天，中国汽车工业必须顺应汽车主动安全技术发展的方向，在我国有计划、有步骤地发展现代汽车主动安全技术是势在必行的。目前国内主动安全技术的研发还比较滞后，但广阔的前景不言而喻。当然主动安全的意识要不断的推广普及，让更多的人加入主动安全的行列中。更希望涌现一批像南京运泰汽车自动防撞器销售有限公司这样的以（关爱生命，造福人类）为主旨致力于推广主动安全事业的单位。

细胞免疫治疗，它是针对如何预防恶性肿瘤的复发而来，其最主要的原理就是把患者的外周血中的单核细胞（属于免疫细胞的一种）在体外分离出来，经过特异性抗原作用及实验室培养，使其具备特异性杀伤肿瘤的能力，同时在体外将这种细胞扩增到一定数量后再回输到体内，杀灭那些肉眼看不见得肿瘤细胞，从而预防肿瘤的复发和转移，在一定程度上解决了患者放化疗后免疫力差，生活质量低的严重问题，并且由于自体细胞免疫治疗的机理可以提高患者免疫力，所以在一定程度上可以大大延缓患者的生存时间。

其中这些有开题报告 1. 用单片机进行温度的控制及LCD显示系统的设计 2. 基于MultiSim 8的高频电路仿真技术 3. 简易数字电压表的设计 4. 虚拟信号发生器设计及远程实现 5. 智能物业管理器的设计 6. 信号高精度测频方法设计 7. 三相电机的保护控制系统的分析与研究 8. 温度监控系统设计 9. 数字式温度计的设计 10. 全自动节水灌溉系统--硬件部分 11. 电子时钟的设计 12. 全自动电压表的设计 13. 脉冲调宽型伺服放大器的设计 14. 基于虚拟仪器技术的数字滤波及频率测试 15. 基于无线传输技术的室温控制系统设计——温度控制器硬件设计 16. 温度箱模拟控制系统 17. 基于无线传输技术的室温控制系统设计——温度控制器软件设计 18. 基于微控制器的电容器储能放电系统设计 19. 基于机器视觉的构件表面缺陷特征提取 20. 基于单片机的语音提示测温系统的研究 21. 基于单片机的步进电机的控制 22. 单片机的数字钟设计 23. 基于单片机的数字电压表的设计 24. 基于单片机的交流调功器设计 25. 基于SPI通信方式的多通道信号采集器设计 26. 基于LabVIEW虚拟频谱分析仪的设计 27. 功率因数校正器的设计 28. 高精度电容电感测量系统设计 29. 电表智能管理装置的设计 30. 基于Labview的虚拟数字钟设计 31. 超声波测距语音提示系统的研究 32. 斩控式交流电子调压器设计 33. 基于单片机的脉象信号采集系统设计 34. 基于单片机的简易智能小车设计 35. 基于FPGA的18路智力竞赛电子抢答器设计 36. 基于EDA技术的智力竞赛抢答器的设计 37. 基于EDA技术的数字电子钟设计 38. 基于EDA的计算器的设计 39. 基于DDS的频率特性测试仪设计 40. 基于CPLD直流电机控制系统的设计 41. 单色显示屏的设计 42. 扩音电话机的设计 43. 基于单片机的低频信号发生器设计 44. 35KV变电所及配电线路的设计 45. 10kV变电所及低压配电系统的设计 46. 6Kv变电所及低压配电系统的设计 47. 多功能充电器的硬件开发 48. 镍镉电池智能充电器的设计 49. 基于MCS-51单片机的变色灯控制系统设计与实现 50. 智能住宅的功能设计与实现原理研究 51. 用IC卡实现门禁管理系统 52. 变电站综合自动化系统研究 53. 单片机步进电机转速控制器的设计 54. 无刷直流电机数字控制系统的研究与设计 55. 液位控制系统研究与设计 56. 智能红外遥控暖风机设计 57. 基于单片机的多点无线温度监控系统 58. 蔬菜公司恒温库微机监控系统 59. 数字触发提升机控制系统 60. 仓储用多点温湿度测量系统 61. 矿井提升机装置的设计 62. 中频电源的设计 63. 数字PWM直流调速系统的设计 64. 基于ARM的嵌入式温度控制系统的设计 65. 锅炉控制系统的研究与设计 66. 动力电池充电系统设计 67. 多电量采集系统的设计与实现 68. PWM及单片机在按摩机中的应用 69. IC卡预付费煤气表的设计 70. 基于单片机的电子音乐门铃的设计 71. 新型出租车计价器控制电路的设计 72. 单片机太阳能热水器测控仪的设计 73. LED点阵显示屏-软件设计 74. 双容液位串级控制系统的设计与研究 75. 三电平Buck直流变换器主电路的研究 76. 基于PROTEUS软件的实验板仿真 77. 基于16位单片机的串口数据采集 78. 电机学课程CAI课件开发 79. 单片机教学实验板——软件设计 80. 63A三极交流接触器设计 81. 总线式智能PID控制仪 82. 自动售报机的设计 83. 断路器的设计 84. 基于MATLAB的水轮发电机调速系统仿真 85. 数控缠绕机树脂含量自控系统的设计 86. 软胶囊的单片机温度控制（硬件设计） 87. 空调温度控制单元的设计 88. 基于人工神经网络对谐波鉴幅 89. 基于单片机的鱼用投饵机自动控制系统的设计 90. 锅炉汽包水位控制系统 91. 基于单片机的玻璃管加热控制系统设计 92. 基于AT89C51单片机的号音自动播放器设计 93. 基于单片机的普通铣床数控化设计 94. 基于AT89C51单片机的电源切换控制器的设计 95. 基于51单片机的液晶显示器设计 96. 超声波测距仪的设计及其在倒车技术上的应用 97. 智能多路数据采集系统设计 98. 公交车报站系统的设计 99. 基于RS485总线的远程双向数据通信系统的设计 100. 宾馆客房环境检测系统 101. 智能充电器的设计与制作 102. 基于单片机的户式中央空调器温度测控系统设计 103. 基于单片机的乳粉包装称重控制系统设计 104. 基于单片机的定量物料自动配比系统 105. 基于单片机的液位检测 106. 基于单片机的水位控制系统设计 107. 基于VDMOS调速实验系统主电路模板的设计与开发 108. 基于IGBT-IPM的调速实验系统驱动模板的设计与开发 109. HEF4752为核心的交流调速系统控制电路模板的设计与开发 110. 基于87C196MC交流调速实验系统软件的设计与开发 111. 87C196MC单片机最小系统单板电路模板的设计与开发 112. 电子密码锁控制电路设计 113. 基于单片机的数字式温度计设计 114. 列车测速报警系统 115. 基于单片机的步进电机控制系统 116. 语音控制小汽车控制系统设计 117. 智能型客车超载检测系统的设计 118. 直流机组电动机设计 119. 单片机控制交通灯设计 120. 中型电弧炉单片机控制系统设计 121. 中频淬火电气控制系统设计 122. 新型洗浴器设计 123. 新型电磁开水炉设计 124. 基于电流型逆变器的中频冶炼电气设计 125. 6KW电磁采暖炉电气设计 126. 基于CD4017电平显示器 127. 多路智力抢答器设计 128. 智能型充电器的电源和显示的设计 129. 基于单片机的温度测量系统的设计 130. 龙门刨床的可逆直流调速系统的设计 131. 音频信号分析仪 132. 基于单片机的机械通风控制器设计 133. 论电气设计中低压交流接触器的使用 134. 论人工智能的现状与发展方向 135. 浅论配电系统的保护与选择 136. 浅论扬州帝一电器的供电系统 137. 浅谈光纤光缆和通信电缆 138. 浅谈数据通信及其应用前景 139. 浅谈塑料光纤传光原理 140. 浅析数字信号的载波传输 141. 浅析通信原理中的增量控制 142. 太阳能热水器水温水位测控仪分析 143. 电气设备的漏电保护及接地 144. 论“人工智能”中的知识获取技术 145. 论PLC应用及使用中应注意的问题 146. 论传感器使用中的抗干扰技术 147. 论电测技术中的抗干扰问题 148. 论高频电路的频谱线性搬移 149. 论高频反馈控制电路 150. 论工厂导线和电缆截面的选择 151. 论工厂供电系统的运行及管理 152. 论供电系统的防雷、接地保护及电气安全 153. 论交流变频调速系统 154. 论人工智能中的知识表示技术 155. 论双闭环无静差调速系统 156. 论特殊应用类型的传感器 157. 论无损探伤的特点 158. 论在线检测 159. 论专家系统 160. 论自动测试系统设计的几个问题 161. 浅析时分复用的基本原理 162. 试论配电系统设计方案的比较 163. 试论特殊条件下交流接触器的选用 164. 自动选台立体声调频收音机 165. 基于立体声调频收音机的研究 166. 基于环绕立体声转接器的设计 167. 基于红外线报警系统的研究 168. 多种变化彩灯 169. 单片机音乐演奏控制器设计 170. 单目视觉车道偏离报警系统 171. 基于单片机的波形发生器设计 172. 智能毫伏表的设计 173. 微机型高压电网继电保护系统的设计 174. 基于单片机mega16L的煤气报警器的设计 175. 串行显示的步进电机单片机控制系统 176. 编码发射与接收报警系统设计：看护机 177. 编码发射接收报警设计：爱情鸟 178. 红外快速检测人体温度装置的设计与研制 179. 用单片机控制的多功能门铃 180. 电气控制线路的设计原则 181. 电气设备的选择与校验 182. 浅论10KV供电系统的继电保护的设计方案 183. 智能编码电控锁设计 184. 自行车里程,速度计的设计 185. 等精度频率计的设计 186. 基于嵌入式系统的原油含水分析仪的硬件与人机界面设计 187. 数字电子钟的设计与制作 188. 温度报警器的电路设计与制作 189. 数字电子钟的电路设计 190. 鸡舍电子智能补光器的设计 191. 电子密码锁的电路设计与制作 192. 单片机控制电梯系统的设计 193. 常用电器维修方法综述 194. 控制式智能计热表的设计 195. 无线射频识别系统发射接收硬件电路的设计 196. 基于单片机PIC16F877的环境监测系统的设计 197. 基于ADE7758的电能监测系统的设计 198. 基于单片机的水温控制系统 199. 基于单片机的鸡雏恒温孵化器的设计 200. 自动存包柜的设计 201. 空调器微电脑控制系统 202. 全自动洗衣机控制器 203. 小功率不间断电源(UPS)中变换器的原理与设计 204. 智能温度巡检仪的研制 205. 保险箱遥控密码锁 206. 基于蓝牙技术的心电动态监护系统的研究 207. 低成本智能住宅监控系统的设计 208. 大型发电厂的继电保护配置 209. 直流操作电源监控系统的研究 210. 悬挂运动控制系统 211. 气体泄漏超声检测系统的设计 212. FC-TCR型无功补偿装置控制器的设计 213. 150MHz频段窄带调频无线接收机 214. 数字显示式电子体温计 215. 基于单片机的病床呼叫控制系统 216. 基于单片微型计算机的多路室内火灾报警器 217. 基于单片微型计算机的语音播出的作息时间控制器 218. 交通信号灯控制电路的设计 219. 单片机控制的全自动洗衣机毕业设计论文 220. 单片机脉搏测量仪 221. 红外报警器设计与实现

Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges 单细胞T细胞受体测序：技术与挑战 T细胞的特性是能够识别无限范围内的自体抗原和外来抗原。这个能力是靠胸腺发育过程中通过一种基于体细胞重组的复杂分子机制实现的。该机制导致了表面抗原受体有很多种类的群体的表达，这种受体就叫做T细胞受体（TCRs）。TCRs具有细胞特异性，是T细胞的一种分子标记，在淋巴恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤免疫学等多种背景下，TCRs被广泛用于监测T细胞的克隆类型（clonality）和多样性（diversity）。在这篇综述中，我们概述了用于研究TCR指令集的策略，从基于V段识别的先锋技术，到下一代测序所引入的革命，该技术允许阿尔法链和贝塔链的高通量测序。基于单细胞的方法将分析提高到更高的复杂性，现在提供了对成对的alpha和beta链进行排序的机会。我们还讨论了新的方法，通过整合TCR跟踪和mRNA单细胞测序提供了一个有价值的工具，将抗原特异性与转录动力学联系起来，并了解T细胞可塑性的分子机制。 人类T细胞在胸腺中由造血组织的祖细胞发育而来。在它们的发育过程中，它们获得了识别外来抗原的能力，并对许多不同的病原体提供保护。这种功能的灵活性是由高多态性表面受体的表达称为T细胞受体(TCRs)。TCR由两个不同的蛋白质链组成。绝大多数的人类T细胞表达细胞组成的α和β链而表达了TCR组成的一个小子集γ和δ链。αβ T细胞适应性免疫的关键调解人和识别抗原在协会主要组织相容性复合体(MHC)类I和II级蛋白质。γδ T细胞而不是MHC-restricted和参与先天反应组织。αβT细胞代表超过90%的总T细胞群和γδT相比更加多样化;出于这个原因,绝大多数的研究TCR的重点是αβ T细胞。 编码alpha (TCRA)和beta (TCRB)链的基因由多个不相邻的基因片段组成，包括TCRB基因的变量(V)、多样性(D)和连接(J)片段，以及TCRA基因的变量(V)和连接(J)片段。T细胞库的巨大多样性是由生殖系基因片段的随机组合(组合多样性combinatorial diversity)和已连接片段在连接位点的随机添加或删除(连接多样性junctional diversity)产生的。 Alpha和Beta链在体细胞上的V（D）J 排列。(A) TCRB和TCRA位点的基因组组织和体细胞重组。抗原库多样性是通过重组步骤来保证的，该步骤逐步重新排列T细胞受体(TCR)β链的V、D和J段，以及TCRα链的V和J段。这种变异性(组合多样性)进一步增加或删除核苷酸在连接位点(连接多样性)。(B)转录本和转录本的生产性重排（productive arrangements）。(C) TCR的结构。TCR由两个亚基TCR Alpha 和TCR Beta 组成，每个亚基分别位于一个恒定区域和一个负责抗原识别的可变区域。 由V(D)J结编码的序列称为互补决定区域3或CDR3。这个序列在α链和β链中都具有最高的可变性（variability），决定了T细胞识别MHC分子所呈现的抗原肽的能力（Figure 1B）。随后的异二聚体对alpha链和beta链进行配对，进一步增加了组合变异性，估计可能的组合总数超过10e18。T细胞库是动态的，直接反映了免疫反应的多样性:抗原呈递给一个幼稚的T细胞，事实上，与共刺激信号相关联，促使携带相同TCRs的细胞迅速克隆扩增，产生一批“效应细胞”。抗原清除后，这些细胞作为“记忆细胞”留在血液中的数量减少了。“TCR序列的特征一直具有很大的科学价值，因为它准确地描述了T细胞在多种疾病中的动态，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病。 利用流式细胞术和针对TCRBV亚群的单克隆抗体的组合，在蛋白质水平上进行了开拓性实验，以解剖T细胞库。这种方法是定性和定量的，但受限于特定单克隆抗体的可用性，没有提供任何关于CDR3多样性的信息。第一个基于基因组的方法是基于对群体中CDR3序列长度分布的分析。这种技术被称为免疫镜或CDR3光谱分析，其基础是利用针对不同可变片段和恒定区域的特异性引物，在CDR3区域扩增TCR转录产物，从而获得PCR片段的电泳分析。免疫镜比较了单个TCRBV亚科中不同长度产物的相对频率，该亚科在多克隆群体中呈高斯分布，而在克隆富集中呈偏态分布。第一个用于在核苷酸序列水平上查询TCR指令集的分子方法是基于传统的分子克隆和Sanger测序。这种方法提供了一个更具体的TCR曲目描述，但它不足以估计巨大的TCR多样性。真正的突破免疫特性的曲目来自高度敏感的高通量测序技术的引入大规模并行测序数以百万计的DNA分子,而不是单一的克隆细胞提供一个全面的知识的安排(α,β链,或两者兼而有之)包括这段和完整的CDR3上序列。 目前的测序技术采用从基因组DNA或cDNA开始的目标富集步骤，既提高了灵敏度，又降低了测序成本。常用的富集策略包括多重PCR、RNA诱饵富集和5’RACE PCR。多重PCR策略使用一个互补于所有可能的V段的多重正向PCR引物池和一个设计在J段(如果从基因组DNA开始)或在α和β链的恒定区域(如果从cDNA开始)上的反向引物池。这两种方法都有优点和缺点。从cDNA开始的PCR富集比基因组DNA有很多优势:(a) PCR伪产物的偏倚更小，因为扩增片段不包含内含子，因此更小;(b) cDNA分析只检测有效排列的片段(“表达的”和链);(c)由于mRNA转录本比模板基因组DNA更丰富，因此它能够更容易地检测较少表达的序列。基于诱饵的富集利用RNA诱饵直接从DNA或RNA测序(RNA-seq)文库中捕获TCR序列，捕获后再进行扩增。诱饵是特定的阿尔法和贝塔转录本，通常是共轭的磁珠。这一过程需要很少的扩增周期，减少PCR相关偏差的潜力。 第三种方法是基于转录本的方法，在模板切换（template-switch）步骤之后使用5'RACE。RNA由具有末端转移酶活性的酶逆转录，该酶在cDNA的3 '端添加一段非模板dCTPs。含有聚g束的非模板开关寡核苷酸然后与非模板拉伸结合，并允许逆转录酶切换模板并继续扩展模板直到寡核苷酸的末端。模板开关寡核苷酸包含一个通用序列，所有转录本包括TCR链共享。然后，在该序列上设计的正向引物与在α和β链的恒定区域上设计的反向引物一起使用，以丰富TCR转录本扩增片段的内容，然后可以对片段进行处理，生成测序文库。 使用基因组DNA作为起始材料反而更具挑战性，因为富集通常是通过多重PCR进行的，但内含子的存在和较长片段的扩增可能会引入更多的技术偏差。此外，非生产性的重新安排也被放大和排序，使表达的曲目的分析复杂化。这一革命性的方法首次被用于描述健康个体的TCR库多样性，并迅速适应于不同病理环境(如肿瘤免疫学和自体免疫)和多种临床应用(如监测造血细胞移植)中的库分析。 由于beta链具有较高的多样性，与alpha链相比，beta链具有更大的组合潜力，因此一直是所有TCR序列研究的主要目标。此外，β链代表T细胞的一个“独特标签”:T细胞经历了一个称为“等位基因排斥”的过程，导致只产生一个有效排列的β链基因，而两个α链等位基因都可以表达。“bulk”方法的局限性在于缺乏关于α和β链配对的信息，而α和β链配对真正反映了T细胞在体内的生物学功能，只能通过单细胞分析来实现。单细胞TCR全谱分析方法主要采用两种策略:从单细胞cDNA开始直接目标扩增和测序，或从单细胞RNA-seq数据重建TCR。 第一次尝试测序单细胞TCRα和β链使用与Sanger测序或高通量测序相关的多重PCR策略。Hans和他的同事们用多重PCR方法对浸润人结肠癌的T淋巴细胞的异质性进行了分析，以丰富来自同一细胞的TCR序列和一组“表型基因”。他们还实现了一个基于pcr的单细胞条形码策略来汇集所有的扩增子，并通过NGS对它们进行排序。条形码是一种短核苷酸序列，它唯一地标记细胞转录本，并用于追踪mRNA转录本的来源。通过这种原始的方法，他们可以将TCR序列与具有不同功能的特定T细胞子集相关联。一个类似的单细胞条形码策略被用来建立高通量的方法来识别具有相同的α和βTCR序列的克隆，并应用于乳腺癌和肺癌的肿瘤浸润淋巴细胞。 上图解释：单细胞T细胞受体(TCR)测序方法综述。直接富集和测序TCR。 在图(A)中，单细胞TCR转录本通过RT反应后的多重PCR进行富集，使用一组正向引物，涵盖所有带注释的V alpha 和V beta 片段，并在α和β链的恒定区域设计反向引物。然后通过PCR添加barcode adapter，并测序。在图(B)中，细胞通过微流体乳化装置以及特定的RT和PCR试剂在油包水的droplets中捕获。在每个液滴中，单个细胞的TCR alpha 和 beta转录本都被设计在alpha和beta链的恒定区域上的RT引物特异性地逆转录。利用设计在所有α和β片段上的正向引物池和设计在恒定区域上的反向引物，依次扩增cDNA。α和β引物在其5 '端包含重叠序列，通过重叠扩展机制可以合成TCRα和β融合序列。熔融分子聚集在一起，打破乳液，并通过巢式扩增和测序进一步丰富。从单细胞“全长”RNA测序(RNA-seq)数据重建TCR。图(C) 用微流体设备分选或捕获的单细胞被裂解，总mRNA通过oligo dT启动反应逆转录。通过模板切换机制，在转录本的5 '端添加一个通用序列。这个序列与RT反应中使用的dT引物共享，然后在文库制备前用于扩增cDNA。在文库制备步骤中，利用转座酶对全长cDNA进行“标记”，然后利用转座酶插入的标记序列对cDNA进行扩增，并插入测序barcode接头(AD1和AD2)。然后对文库进行排序，使用专用的生物信息学算法(TraCer、TraPes、VDJ Puzzle)从所有转录组中提取TCR序列。采用基于乳化剂的单细胞TCR测序和RNA-seq配对。图(D) 成千上万个平行的细胞被分成水滴中的油。裂解步骤后，它们的mRNA被使用含有相同“cell barcode”的特定RT引物池逆转录，该“cell barcode”是一种独特的分子标识符(UMI)，用于标记细胞转录组。每个引物的UMI都是不同的，这使得mRNA转录的数字计数和T7启动子的测序成为可能。然后通过体外转录扩增cDNA。扩增后的barcode RNA汇集在一起进行处理。然后利用扩增的RNA作为模板，对TCR序列进行富集，并根据InDrop协议生成RNA-seq文库。在RNA-seq文库制备过程中，RNA被片段化，只有3 '端转录本被测序。对于TCR富集，扩增的RNA使用一组横跨V alpha 和V beta 段的RT引物进行逆转录，然后使用“内部”V alpha 和V beta 和设计在恒定区域上的引物(primers)进行扩增。在此PCR反应中，还添加了测序barcode(AD1和AD2)。图(E) 成千上万个平行的细胞被分成油包水的液滴中（droplets）。裂解后，用oligo dT引物逆转录它们的mRNA。通过template-switch机制，在转录本的5 '端添加含有cell barcode和UMI的primer。RT反应后液滴破碎，利用设计在dT 和 switch oligonucleotides 上的external primer，将cDNAs pooled 和扩增。然后利用扩增的全长cDNA作为模板，富集TCR测序，或片段化处理，生成RNA-seq文库。TCR富集采用巢式PCR法，正向引物跨越switch oligo，反向引物设计在α和β链的恒定区域。然后将PCR产物部分片段化，加入测序接头(AD1和AD2)。 真正的突破来自于基于乳化剂的PCR技术。这些技术使用的设备可以泵入水中的油状乳剂，成千上万的单个细胞可以被捕获到液滴中，液滴与引物和PCR试剂一起工作，就像一个微型反应室。这种方法可以大幅增加并行处理的细胞数量，并能够生成具有代表性的单细胞和融合在一起的TCR基因文库。其中，细胞裂解后，在每一个液滴中释放出α和βTCR mRNA，并利用末端重叠的引物进行多重PCR逆转录扩增。在随后的反应中，重叠端退火，允许每条链的3 '端启动互补端3 '延伸。此步骤生成包含序列和序列的融合片段;融合片段在含有“阻断”引物的PCR中进一步扩增，这些引物可以防止未被扩增的片段被扩增。Turchaninova和他的同事应用这项技术来描述人类血液中的T细胞库，但是这种方法已经广泛应用于包括癌症在内的许多研究领域，最近在一个超高通量平台上重新调整，允许对数百万个细胞进行TCR配对测序。 单细胞RNA-seq技术的发展也为TCR分析开辟了新的前景。到目前为止，已经开发了许多不同的protocol，主要在细胞分离方法、cDNA合成和扩增以及文库制备步骤上有所不同。单细胞分离方法迅速发展在过去的几年里从手工操作到使用微流体或emulsion-based平台的高通量分离方法,这不仅提供了巨大的优势在throughput方面而且在灵敏度和准确性方面由于很小的反应量使用。所有测序方案的特点是在文库制备前的一个逆转录和扩增步骤。常用的扩增步骤不同，可通过PCR或体外转录进行扩增，分为两组:基于标记或全长cDNA测序protocol。 基于标记的策略在逆转录反应中引入“细胞条形码”，为“标记”单个细胞的整个cDNA池提供了可能。“标记策略”已经成倍地提高了通量，因为标记的cDNAs可以在扩增和库准备过程中被汇集，从而大大降低了成本和实验时间。主要缺点是，这些protocol在库制备过程中由于cDNAs片段化而失去了全长转录本的覆盖范围，并且与全长策略相比具有较低的敏感性(可检测基因的数量较少)。相反，全长策略更昂贵、更耗时(每个细胞的cDNA池被独立处理以生成单个测序库)，但更敏感，可以提供更广泛的信息，包括亚型、剪接和单核苷酸多态性。利用全长方法生成的单细胞RNA-seq数据提取T细胞库和异质性信息。来自scRNA-seq数据的全长(TCR)序列的组装允许alpha和beta链序列配对(在执行“bulk”分析时不可能)，并允许clonality信息与单个T细胞的整个转录组集成。这种方法也呈现非琐碎的分析问题:规范化reference-based组装方法,依赖的一致性读到“参考”体细胞基因组实际上是有偏见的重组和突变(CDR3上是特定为每个细胞)和缺乏一个完整的“参考”基因组需要从头组装为基础的生物信息学工具的发展。 所有可用的工具基本上都结合了基于引用的组装(reads与带注释的基因片段对齐)和从头组装(重建CD3区域)。最早用来重建成对TCR和β链的工具之一被称为TraCer (34)。为了验证 TraCer的性能，Stubbington和同事使用SMART-seq protocol和从小鼠脾脏分离的FluidigmC1系统(Fluidigm Corporation)生成单细胞RNA-seq数据。为了验证所识别的克隆型，他们使用了一种实验方法来丰富TCR序列，该方法使用了一种基于pcr的多路方法，从用于测序库生成的相同cDNA开始，该方法由NGS并行测序。两种策略之间的良好相关性证实了该方法的有效性。在同一篇论文中，他们将这一分析应用于沙门氏菌感染的小鼠模型，并能够监测感染后扩大的克隆型。该方法的优势在于将TCR克隆型与特定的基因表达谱相关联，该基因表达谱提供了对整个CD4+ T细胞群的详细分子描述，并在感染后监测CD4+ T细胞亚群的动态。 同样的方法也被用于分析T细胞亚群的异质性，以解决几个生物学问题，特别是与“肿瘤免疫”相关的问题。“在过去的几年里，T细胞在癌症中的作用已经被广泛研究，CD8+ T细胞和CD4+ T调节细胞被广泛描述分别在几种癌症中抑制或促进肿瘤进展。最近，郑和同事利用示踪剂对T细胞浸润性肝癌进行了解剖。他们分析了浸润的Treg和CD8+ T细胞的克隆富集，以了解肿瘤微环境中淋巴细胞募集的分子机制。通过对TCR表达谱的解剖，他们得出结论:Treg细胞在肿瘤中不存在克隆富集，提示从周围招募，而CD8+ T细胞经克隆富集，提示肿瘤内部存在克隆活化和扩增。在相同的研究思路下，陆续开发了scTCR Seq、TRAPes等工具，适用于短读单细胞RNA-Seq文库和VDJ Puzzle，可以同时分析基因表达和TCR多样性，并在抗原特异性循环CD8+ T细胞上进行了开发和验证。 最近修改基于标签的策略的尝试有望将来自相同细胞的RNA-seq和TCR测序结合起来。这些方法具有极大的优势，可以大幅增加并行处理的细胞数量，这对于描述非常罕见的T细胞群是至关重要的。 最近发表的一篇论文研究了小鼠和人类Treg细胞的T细胞库(41)。在本文中，Zemmour和同事使用不同的单细胞RNA-seq方法分析了Treg细胞的转录表型。他们发现，Treg细胞具有广泛的异质性，某些高度活化的亚群似乎与T细胞的转录相关。他们还表明，具有相同TCR的Treg在转录上比具有不同抗原特异性的Treg更相似，这说明Treg可塑性受TCR成形的影响较大。为了分析TCR指令表，Zemmour和他的同事使用了一种基于乳化剂的InDrop协议(图2D)的修改，该协议目前用于3 ' '端计数。 其中，细胞通过微流体装置形成油包水乳状液被捕获成水滴。细胞被捕获连同裂解缓冲液，试剂，特别是条形码引物，启动RT反应。条形码cDNAs是由上千个细胞并行合成的。将不同细胞的逆转录后的cDNAs通过破碎液滴汇集在一起，利用体外转录进行线性扩增，然后制备测序文库。正如本文所述，这种池策略成倍地提高了吞吐量，因为可以将数千个单元池放在一个库中。然而，片段化步骤牺牲了所有来自mRNA 5 '端(包括CDR3区域)的信息。Zemmour和他的同事们克服了这个问题，他们在线性放大后引入了一个TCR富集步骤，这个步骤使用了一个横跨所有V和beta段的多重RT池。此步骤生成与整个转录组库共享相同条形码的TCR alpha和beta库(图2d)。最近，10x基因组公司推出了一种类似的方法，将α和β链测序结合起来，并行地对数千个单细胞进行转录组分析(图2e)。该方法采用商业化的基于乳化剂的微流控平台(Chromium 10x)，可以生成用于单细胞RNA-seq文库制备和TCR目标富集和测序的扩增cDNA。通过PCR对扩增的cDNA进行TCR富集，使用设计在α和β链的恒定区域上的反向引物和设计在第二链合成过程中通过模板开关机制添加在5 '处的寡核苷酸序列上的通用正向引物。每个寡核苷酸包含一个独特的cell barcode，用于标记整个细胞转录组，包括TCR转录本。 T细胞受体库分析已成为了解健康个体和多种病理条件下T细胞生物学的基本工具，目前不仅应用于研究免疫介导性疾病的生物学，而且还应用于监测治疗后的免疫反应。CD3谱分型等前沿技术已被广泛用于提供克隆扩增的信息，但随着NGS技术的发展，在产量和应用方面出现了真正的革命。对成千上万个细胞的TCR进行并行测序是分析T细胞反应库复杂性和多样性的有力工具。这项技术的主要局限在于无法配对测序和测序，这削弱了我们对体内情况的理解。随着单细胞技术的快速发展和扩展，这一关键问题最近得到了解决，单细胞技术提供了配对的和单个细胞的序列信息。进一步的复杂性来自于将来自相同细胞的TCR库和基因表达谱联系起来的努力。这种分析提供了对感兴趣的种群的无偏分类，以及每个细胞的转录景观与其TCR之间的关联。这种方法有望开辟新的途径来描述免疫细胞亚群的特异性克隆性，即使是特征不明显的表型亚群也是如此，并为监测与克隆性密切相关的转录动力学效应提供了机会。