卵磷脂研究论文

、脂质体离适化结构亲脂性药物镶嵌双层膜内包裹脂质体其包封率取决于所用脂质浓度种情况包封率达90％定要除未包裹药物水溶性药物言包裹药物仅总量部必须脂质体悬液除未包裹药物由于脂质体比包裹药物要利用同离除未包裹药物些凝胶滤柱层析渗析等；若包裹物质蛋白质或DNA或者未包裹药物能形较聚结物则利用与脂质体浮力、密度同采用诸离等进行离()柱层析凝胶渗透层析技术广泛用于脂质体悬液离除未包裹药物用于悬液脂质体组技术实验室效且快速规模产虽用凝胶滤纯化技术较困难且价格昂贵另外脂质体洗脱介质稀释能需要增加浓缩步骤柱层析填料用葡聚糖Sephadex G-50其步骤与规致必须指：①葡聚糖表面存着能与脂质体膜结合并相互作用微部位虽种作用并影响脂质体凝胶柱流特征仍导致少量脂质损失使膜稳定性增加导致膜渗透性改变及包裹物质渗漏种现象脂质浓度较低情况特别应予注意般通加脂质体品柱量或用空脂质体预先柱饱解决通使用20mg脂质制单层脂质体饱10g凝胶；②若凝胶颗粒太细较脂质体能滞留凝胶柱层脂质体宜选用粗级凝胶(粒径50～150μm)单层脂质体则用任何级别凝胶(二)渗析简单用除未包裹药物(化合物除外)需要复杂技术须昂贵仪器且能够扩产通断改换渗析介质除所游离药物费般室温条件要除95％游离药物至少需要更换三渗析介质间10～24h外渗析介质渗透强度应与脂质体悬液致否则渗析改变脂质体悬液体积且能引起包裹物质渗漏(三)离同离力离离除同种类脂质体游离药物效完全除游离药物需重复悬浮离使脂质体沉所需离力取决于脂质体某种程度取决于混悬液絮凝状态脂质体且布窄需要高速离及冰冻条件低速(2000～4000r／min)离能使脂质体沉降显于量脂质体利用高速冰冻离极其耗能昂贵适于离脂质体于比较脂质体低速离缩短操作间并且同较稀脂质体悬液浓缩所需浓度避免脂质体遭破坏必须注意保证重复混悬介质渗透压与脂质体悬液渗透压相致二、脂质体包封率测定()百包封率测定显考查包裹物质物体内行前必须测定该物质脂质体量采用述离除未包入脂质体游离物质利用式计算百包封率(Encapsulation percentageEN％)EN％=(1Cf／Ct)×100％式Cf游离药物量；Ct脂质体悬液药物总量再介绍两种快速、用量少且适应性广离游离物质并测定EN％1．微型柱离(minicolumn centrifugation method)取塑料注射针筒填滤膜作衬片装入用理盐水溶胀Sephadex G-50再针筒置离管低速离(2000r／min3min)除余理盐水凝胶柱变干并能与针筒内壁离精确定量加入脂质体品注意勿滴入柱床边缘离(2000r／min3min)使脂质体进入离管待测再凝胶柱加入少量理盐水依离离液能再脂质体或仍含少量主要取决于脂质体及组游离药物程葡聚糖吸附离凝胶柱再加理盐水离使柱干游离药物洗脱进入离液反复几直至全部游离药物均柱离洗脱别测定包封药物及游离药物浓度计算EN％(图20—10)微型柱离优点脂质体悬液几乎没稀释于实验室规模试验较用离除未包裹药物快速测定包封率2．鱼精蛋白凝聚(protamine aggregation)用于任何组脂质体性或带负电荷脂质体(图20－11)：取脂质体悬液于10ml锥形离管加入鱼精蛋白溶液(10mg／ml)搅匀静置3min再加3ml理盐水室温条件离吸取2ml清液测定游离药物浓度剩余清液弃沉淀物 10％ Triton X-100重新混悬使脂质体膜材溶解再补充理盐水至总体积测定包封药物浓度便算EN％(二)包裹容积测定包裹容积(entrapped volume)指制脂质体相于每毫克磷脂所占内水相体积般微升(μl)表示包裹容积计算通测定包裹脂质体内药物总量推测假设脂质体内水性介质药物浓度与始制备所用药物浓度经离除未包裹药物没物质脂质体渗漏则容易计算许情况假设往往能立例用二乳化制备脂质体干燥除机溶剂内水相能失；另外由于内外渗透压差异水进入或逸脂质体测定内部容积办直接测定水量例利用具光谱性液体代替内相介质利用核磁共振(NMR)测定测水量脂质体高速离(200000g6h)沉降紧密沉淀除尽清液沉淀物D20(deuterium oxide)重新混悬由于膜于水渗透性使整体系H20D20快达平衡取少量用于磷脂量测定剩余部作水NMR扫描峰高与D20含水浓度比与标准溶液照即求水量计算脂质体包裹容积三、脂质体稳定性脂质体放置程能发种同变化磷脂质氧化水解短链磷脂并膜形具溶解性衍物；另外脂质体发凝聚、融合等物理变化导致包裹物质渗漏脂质体制剂若要发展产品应市必须贮藏期间具良稳定性；体内达靶组织前或发挥其缓释作用前亦须保持定及完整性已证明脂质体血液比较稳定随磷脂化性质、胆固醇比例脂质体、双层数目等同脂质体体内稳定性所同若贮存程药物脂质体迅速渗漏则必限制脂质体应用价值()化稳定性脂质体组磷脂氧化降解应制备即加防止采用些措施尽能降低氧化程度例使用新鲜提纯磷脂新鲜蒸馏溶剂尽量避免高温并充氮氧条件完制备程脂质体贮存于惰性环境等膜材组加入抗氧剂种效目前用抗氧剂α-育酚种毒食用脂质据认蛋卵磷脂氧化解α-育酚加入减缓另选择降低氧化程度使用饱磷脂代替饱磷脂源磷脂其饱度随植物、蛋黄、哺乳物依增加于蛋黄磷脂饱度取决于物饲料及所用提纯论饱饱磷脂脂质体水性悬液都能水解形溶血磷脂脂肪酸溶血磷脂进步水解形甘油磷脂脂肪酸甘油磷酸间酯键难水解所产游离磷酸甘油精制豆磷脂脂质体水性悬液水解力已研究结表明豆磷脂水解主要受H+OH+催化作用左右水解速率体系加入缓冲离醋酸、枸橼酸缓血酸铵轻度增加豆磷脂水解(二)物理稳定性脂质体包裹药物渗漏凝聚、融合团块等物理稳定性问题脂质体研究工作难题些研究表明单层脂质体贮存体积增药物渗漏与脂质及包裹药物性质关由性磷脂制备脂质体凝聚主要由于范德华力相互作用所致膜材加入少量负电荷磷脂(10％PA或PG)克服膜材加入微量1,3-二乙酰-2-磷脂酰胆碱阻止较脂质体融合较脂质体制备适条件般发融合于40nm单层脂质体由于膜曲率易于发融合特别相变温度更易发采用前体脂质体等重建脂质体较避免脂质体贮存发化物理变化重建脂质体三种类型：含药或含药干脂质膜；含药或含药冻干脂质混合物：含药冻干脂质体于干脂质膜或冻干脂质混合物重建所获药物包封率限特别亲水性药物包封率高悬液含较游离药物实际应价值于具适结构亲脂性药物重建产品达较满意包封率重建程所需条件例搅拌程度要求高温超声处理等实际应用甚便于亲水性药物选择含药冻干脂质体重建形式报道冰冻程若加入亲水性聚合物葡聚糖能产自由流能利于冻干脂质体水性介质重建例含胰岛素冻干脂质体用种处理其重建包封率达原70％即冰冻重建程胰岛素渗漏率约30％包裹低量药物渗漏率能更高些种技术保证脂质体制剂贮存稳定性提供效四、脂质体测定脂质体影响脂质体体内处置脂质体重要质量指标测定脂质体激光扫描电显微镜或库尔特粒度析疑电镜测定准确直接观察每脂质体并获各范围内脂质体外形精确信息要观察量脂质体本非费相反．激光扫描非简单且操作快速仅能测脂质体平均性质与类似采用库尔特粒度析仪测脂质体布二种均难描述更精细结构关于粒度测定细节参见本书第十二章五、脂质体析()磷脂质析1．含量测定直接精确测定磷脂质浓度比较困难干燥磷脂总含定量残留溶剂或其杂质磷脂广泛使用测定磷脂非直接例含磷量测定于制备脂质体数磷脂言每摩尔磷脂均含1mol磷仅别例外每摩尔磷脂含2mol磷品磷脂浓度通测定磷含量计算介绍二种磷测定(1)Bartlett磷脂机磷酸解机磷加入钼酸铵使转化磷钼酸磷钼酸用萘磺酸铵定量原蓝色蓝色强度由光光度测定与标准品(磷酸二氢钾)照即计算含磷量该灵敏度较高且重现性若品含少量机磷则干扰测定(2)Stewart脂质体混悬于磷酸盐缓冲液宜采用Stewart该利用磷脂机溶剂与亚铁硫氰酸铵形色复合物受机磷存影响进行测定计算使用与磷脂结构关转换吸收值换算磷脂毫克数该随磷脂基同异利用磷脂标准液绘制标准曲线计算该适于测定含未知磷脂混合物特别须指该能用于甘油磷脂测定若脂质体含卵磷脂甘油磷脂则用该前者定量再通Bartlett测定总磷脂计算甘油磷脂量2．磷脂质薄层层析薄层层析检查磷脂质纯度主要手段与所层析磷脂质薄层层析利用磷脂液态机相亲水性固定相同亲性液相固定相展同磷脂具同保留间根据亲水性强弱改变展剂组改变磷脂两相配系数用固定相硅胶展剂则用含氯仿溶剂①氯仿：甲醇：水：(65：25：4 V／V)；②氯仿：甲醇：水：氨水(65：35：： V／V)；③氯仿：丙酮：甲醇：醋酸：水(6：8：2：2：1 V／V)；④乙酸乙酯：环烷(1：1 V／V)等用显色剂碘用50％硫酸 - 甲醇液或重铬酸钾液显色(三)磷脂氧化程度1．磷脂氧化磷脂脂肪酸氧化主要由于游离基作用电磁波辐射或者微量游离金属离催化脂肪酸碳链首先脱氢原形游离基进与空气氧发连锁反应含双键碳链更易受影响聚合饱磷脂特别容易氧化降解含单或饱脂肪酸脂质混合物磷脂氧化三阶段进行：①单双键偶合；②氧化物形；③形乙醛及链断裂值注意氧情况仍发游离基反应导致双重或三重偶合形产氧化物另外降解步程要消耗偶合双键终降解产物增加同笫步降解产物减少故难用种试验评估磷脂氧化程度甚至即使应用几同试验仍仅能致估计氧化程相速率2．氧化指数测定氧化指数用检测游离基偶合指标氧化偶合磷脂230nm左右具紫外吸收峰别于未氧化磷脂典型紫外吸收图谱图20－12内提作制备脂质体膜材卵磷脂其氧化指数应控制测定磷脂溶于水乙醇配定浓度澄明溶液别测定波233nm及215nm吸收值按式计算：氧化指数 = A233nm／A215nm3．氧化物测定卵磷脂氧化产丙二醛及溶血磷脂等丙二醛(MDA)酸性条件与硫巴比妥酸(TBA)反应种红色染料(TBA-Pigment)该化合物波535nm处特异吸收吸收值即反映磷脂氧化程度丙二醛量与溶血间关系进行研究实验证明每毫升含卵磷脂理盐水丙二醛含量超μg37℃放置1～2h即产溶血除述估计磷脂氧化程度外根据聚合饱脂肪酸链氧化阶段发断裂或缩短用气 - 液色谱解些酰基链变化(四)胆固醇析与磷脂质类似胆固醇纯度及其氧化产物用气 - 液色谱进行检测另外由于胆固醇论游离型酯化型都能与含高氯酸铁乙酸乙酯硫酸试剂反应铁复合物波610nm处紫外吸收采用标准胆固醇溶液照计算胆固醇量六、脂质体灭菌许研究论文都认脂质体宜用加热灭菌办且各类辐射及各种化灭菌剂敏所能使用滤灭菌或采用菌操作进行制备影响脂质体广泛应用于临床重要原近内采用100℃ 30min湿热灭菌获功灭菌前脂质体形态及均明显变化渗漏率约5％另采用辐射灭菌即用60钴发γ射线三磷酸腺苷脂质体甲氨蝶呤脂质体作辐射灭菌照射剂量15～20kGy菌试验结均由试验前阳性转阴性脂质体粒径灭菌前显著变化灭菌所致渗漏率较灭菌实用性能与混悬介质种类、磷脂组及纯度等关采用121℃加热20min灭菌处理几种脂质体发现理盐水脂质体发凝聚等渗糖溶液羟基化合物溶液发凝聚加热灭菌具较高氧化物值含蛋卵磷脂散液稍变黄改用具低氧化物值蛋卵磷脂、氢化蛋卵磷脂或DPPC则变化性pH充入氮气阻止颜色变化加入α-育酚效经μm膜滤由蛋卵磷脂组脂质体变变化介质类型明显影响加热灭菌期间包裹羧基荧光素阴离负电荷脂质体(PC／chol／PG)发渗漏使用电荷脂质体(PC／chol／十八胺)仅加热灭菌期间发渗漏且贮存间渗漏感觉这样的提问是没有意义的还是自己找下资料吧

脂类代谢与人体健康 脂类物质包括脂肪和类脂二类物质，脂肪又称甘油三酯，由甘油和脂肪酸组成；类脂包括胆固醇及其酯、磷脂及糖脂等。脂类物质是细胞质和细胞膜的重要组分；脂类代谢与糖代谢和某些氨基酸的代谢密切相关；脂肪是机体的良好能源，脂肪的潜能比等量的蛋白质或糖高1倍以上、通过氧化可为机体提供丰富的热能；固醇类物质是某些激素和维生素D及胆酸的前体。脂类代谢与人类的某些疾病（如酮血症、酮尿症、脂肪肝、高血脂症、肥胖症和动脉粥样硬化、冠心病等）有密切关系，因此，脂类代谢对人体健康有重要意义。 一、脂类的消化与吸收 1．脂肪的消化与吸收 食物中的脂肪在口腔和胃中不被消化，因唾液中没有水解脂肪的酶，胃液中虽含有少量脂肪酶，但胃液中的pH为1～2，不适于脂肪酶作用。脂肪的消化作用主要是在小肠中进行，由于肠蠕动和胆汁酸盐的乳化作用，脂肪分散成细小的微团，增加了与脂肪酶的接触面，通过消化作用，脂肪转变为甘油一酯、甘油二酯、脂肪酸和甘油等，它们与胆固醇、磷脂及胆汁酸盐形成混合微团。这种混合微团在与十二指肠和空肠上部的肠粘膜上皮细胞接触时，甘油一酯、甘油二酯和脂肪酸即被吸收，这是一种依靠浓度梯度的简单扩散作用。吸收后，短链的脂肪酸由血液经门静脉入肝；长链的脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯在肠粘膜细胞的内质网上重新合成甘油三酯，再与磷脂、胆固醇、胆固醇酯及载脂蛋白构成了乳糜微粒，通过淋巴管进入血液循环。 2．类脂的消化与吸收 食物中胆固醇的吸收部位主要是空肠和回肠，游离胆固醇可直接被吸收；胆固醇酯则经胆汁酸盐乳化后，再经胆固醇酯酶水解生成游离胆固醇后才被吸收，吸收进入肠粘膜细胞的胆固醇再酯化成胆固醇酯，胆固醇酯中的大部分掺入乳糜微粒，少量参与组成极低密度脂蛋白，经淋巴进入血液循环。食物中的磷脂在磷脂酶的作用下，水解为脂肪酸、甘油、磷酸、胆碱或胆胺，被肠粘膜吸收后，在肠壁重新合成完整的磷脂分子，参与组成乳糜微粒而进入血液循环。 二、脂肪的代谢 1．脂肪酸的合成 体内的脂肪酸的来源有二：一是机体自身合成，以脂肪的形式储存在脂肪组织中，需要时从脂肪组织中动员。饱和脂肪酸主要靠机体自身合成；另一来源系食物脂肪供给，特别是某些不饱和脂肪酸，动物机体自身不能合成，需从植物油摄取。它们是动物不可缺少的营养素，故称必需脂肪酸。它们又是前列腺素、血栓素及白三烯等生理活性物质的前体。前列腺素可使血管扩张，血压下降，并能抑制血小板的聚集。而血栓素作用与此相反，有促凝血作用。白三烯能引起支气管平滑肌收缩，与过敏反应有关。 脂肪酸的生物合成是在胞液中多酶复合体系催化下进行的，原料主要来自糖酵解产生的乙酸辅酶A和还原型辅酶Ⅱ，最后合成软脂酸。软脂酸在内质网和线粒体分别与丙二酰单酰辅酶A和乙酸辅酶A作用，均可以使碳链的羧基端延长到18～26℃。机体还可利用软脂酸、硬脂酸等原料，在去饱和酶的催化下，合成不饱和脂肪酸，但不能合成亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等必需脂肪酸。 2．脂肪的合成 脂肪在体内的合成有两条途径，一种是利用食物中脂肪转化成人体的脂肪，另一种是将糖转变为脂肪，这是体内脂肪的主要来源，是体内储存能源的过程。糖代谢生成的磷酸二羟丙酮在脂肪和肌肉中转变为 磷酸甘油，与机体自身合成或食物供给的两分子脂肪酸活化生成的脂酰辅酶A作用生成磷脂酸，然后脱去磷酸生成甘油二酯，再与另一分子脂酰辅酶A作用，生成甘油三酯。 3．脂肪的分解 脂肪组织中储存的甘油三酯，经激素敏感脂肪酶的催化，分解为甘油和脂肪酸运送到全身各组织利用，甘油经磷酸化后，转变为磷酸二羟丙酮，循糖酵解途径进行代谢。胞液中的脂肪酸首先活化成脂酰辅酶A，然后由肉毒碱携带通过线粒体内膜进入基质中进行 氧化，产生的乙酰辅酶A进入三羧酶循环彻底氧化，这是体内能量的重要来源。 4．酮体的产生和利用 脂肪酸在肝中分解氧化时产生特有的中间代谢产物——酮体，酮体包括乙酰乙酸、 羟丁酸和丙酮，由乙酰辅酶A在肝脏合成。肝脏自身不能利用酮体，酮体经血液运送到其它组织，为肝外组织提供能源。在正常情况下，酮体的生成和利用处于平衡状态。 三、类脂的代谢 1．胆固醇的代谢 体内胆固醇主要在肝细胞内合成，胆固醇在体内不能彻底氧化分解，但可以转变成许多具有生物活性的物质，肾上腺皮质激素、雄激素及雌激素均以胆固醇为原料在相应的内分泌腺细胞中合成。胆固醇在肝中转变为胆汁酸盐，并随胆汁排入消化道参与脂类的消化和吸收。皮肤中的7-脱氧胆固醇在日光紫外线的照射下，可转变为维生素 ，后者在肝及肾羟化转变为1，25- 的活性形式，参与钙、磷代谢。 2．磷脂的代谢 含磷酸的脂类称为磷脂，由甘油构成的磷脂统称为甘油磷脂，它包括卵磷脂和脑磷脂，是构成生物膜脂双层结构的基本骨架，含量恒定为固定脂。卵磷脂是合成血浆脂蛋白的重要组分。由鞘氨醇构成的磷脂称为鞘磷脂，是生物膜的重要组分，参与细胞识别及信息传递。磷脂酸是合成磷脂的前体，在磷酸酶作用下生成甘油二酯，然后与CDP-胆碱或CDP-胆胺反应生成卵磷脂和脑磷脂。鞘氨醇由软脂酸辅酶A和丝氨酸反应形成。鞘氨醇经长链脂酰辅酶A酰化而形成N-酸基鞘氨醇，即神经酰胺，又进一步和CDP-胆碱作用而形成鞘磷脂。 四、血浆脂蛋白代谢 1．血脂的组成及含量 血浆中所含的脂类统称血脂，它的组成包括甘油三酯、磷脂、胆固醇及其酯以及游离的脂肪酸等。血脂的来源有二：一为外源性，从食物摄取的脂类经消化吸收进入血液；二是内源性，由肝、脂肪细胞以及其它组织合成后释放入血液。血脂受膳食、年龄、性别、职业以及代谢等的影响，波动范围较大。正常人空腹12～24 h血脂的组成及含量见表1。 表1 正常成人空腹时血浆中脂类的组成和含量脂类物质 nmol/L mg/dl 脂类总量 4～7（g/L） 400～700甘油三酯 ～ 10～160胆固醇总量 ～ 150～250磷 脂 ～ 150～250游离脂肪酸 ～ 8～25血浆中脂类的正常值范围因测定方法不同而有一定的差别。另外，血脂含量与全身脂类相比，只占极小部分，但所有脂类均通过血液转运至各组织。因此，血脂的含量可以反映全身脂类的代谢概况。 血脂的来源与去路如下：2．血浆脂蛋白的分类、组成及功能 正常人血浆含脂类虽多，却仍清彻透明，说明血脂在血浆中不是以自由状态存在，而与血浆中的蛋白质结合，以血浆脂蛋白的形式运输。载脂蛋白主要有apoA、apoB、apoC、apoD和apoE等五类，还有若干亚型。血浆脂蛋白的结构为球状颗粒，表面为极性分子和亲水基团，核心为非极性分子和疏水基团。各种血浆脂蛋白因所含脂类及蛋白质量不同，其密度、颗粒大小、表面电荷、电泳行为及免疫性均有不同，一般用超速离心法和电泳法将它们分为四类，彼此对应，即：HDL高密度脂蛋白（ 脂蛋白）、VLDL极低密度脂蛋白（前 脂蛋白）、LDL低密度脂蛋白（ 脂蛋白）和CM乳糜微粒。CM是在空肠粘膜细胞内合成，转运外源性脂肪；VLDL是在肝细胞内合成，转运内源性脂肪；LDL是在血浆中由VLDL转变而来，转运胆固醇至各组织；HDL是在肝细胞内合成，转运胆固醇和磷脂至肝脏。 五、脂类代谢紊乱引起的常见疾病 1．血浆脂蛋白的异常引起的疾病正常时，血浆脂类水平处于动态平衡，能保持在一个稳定的范围。如在空腹时血脂水平升高，超出正常范围，称为高血脂症。因血脂是以脂蛋白形式存在，所以血浆脂蛋白水平也升高，称为高脂蛋白血症。根据国际暂行的高脂蛋白血症分型标准，将高脂蛋白血症分为6型，各型高脂蛋白血症血浆脂蛋白及脂类含量变化见表2。 表2 各型高脂蛋白血浆脂蛋白及脂类含量变化类型 血浆脂蛋白变化 血脂含量变化 发生率 Ⅰ 高乳糜微粒血症 甘油三酯升高 罕见 （乳糜微粒升高） 胆固醇升高 Ⅱa 高 脂蛋白血症 甘油三酯正常 常见 （低密度脂蛋白升高） 胆固醇升高 Ⅱb 高 脂蛋白血症 甘油三酯升高 常见 高前 脂蛋白血症 胆固醇升高 （低密度脂蛋白及极 低密度脂蛋白升高 Ⅲ 高 脂蛋白血症 甘油三酯升高 较少 高前 脂蛋白血症 胆固醇升高 （出现“宽 ”脂蛋白 低密度脂蛋白升高 Ⅳ 高前 脂蛋白血症 甘油三酯升高 常见 （极低密度脂蛋白升高） 胆固醇升高 Ⅴ 高乳糜微粒血症 甘油三酯升高 高前 脂蛋白血症 胆固醇升高 不常见按发病原因又可分为原发性高脂蛋白血症和继发性高脂蛋白血症。原发性高脂蛋白血症是由于遗传因素缺陷所造成的脂蛋白的代谢紊乱，常见的是Ⅱa和Ⅳ型；继发性高脂蛋白血症是由于肝、肾病变或糖尿病引起的脂蛋白代谢紊乱。 高脂蛋白血症发生的原因可能是由于载脂蛋白、脂蛋白受体或脂蛋白代谢的关键酶缺陷所引起的脂质代谢紊乱。包括脂类产生过多、降解和转运发生障碍，或两种情况兼而有之，如脂蛋白脂酶活力下降、食入胆固醇过多、肝内合成胆固醇过多、胆碱缺乏、胆汁酸盐合成受阻及体内脂肪动员加强等均可引起高脂蛋白血症。动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见病之一，发生的原因主要是血浆胆固醇增多，沉积在大、中动脉内膜上所致。其发病过程与血浆脂蛋白代谢密切相关。现已证明，低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白增多可促使动脉粥样硬化的发生，而高密度脂蛋白则能防止病变的发生。这是因为高密度脂蛋白能与低密度脂蛋白争夺血管壁平滑肌细胞膜上的受体，抑制细胞摄取低密度脂蛋白的能力，从而防止了血管内皮细胞中低密度脂蛋白的蓄积。所以在预防和治疗动脉粥样硬化时，可以考虑应用降低低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白及提高高密度脂蛋白的药物。肥胖人与糖尿病患者的血浆高密度脂蛋白水平较低，故易发生冠心病。 2．酮血症、酮尿症及酸中毒 正常情况下，血液中酮体含量很少，通常小于1mg/100mL。尿中酮体含量很少，不能用一般方法测出。但在患糖尿病时，糖利用受阻或长期不能进食，机体所需能量不能从糖的氧化取得，于是脂肪被大量动员，肝内脂肪酸大量氧化。肝内生成的酮体超过了肝外组织所能利用的限度，血中酮体即堆积起来，临床上称为“酮血症”。患者随尿排出大量酮体，即“酮尿症”。酮体中的乙酰乙酸和 羟丁酸是酸性物质，体内积存过多，便会影响血液酸碱度，造成“酸中毒”。 3．脂肪肝及肝硬化 由于糖代谢紊乱，大量动员脂肪组织中的脂肪，或由于肝功能损害，或者由于脂蛋白合成重要原料卵磷脂或其组成胆碱或参加胆碱含成的甲硫氨酸及甜菜碱供应不足，肝脏脂蛋白合成发生障碍，不能及时将肝细胞脂肪运出，造成脂肪在肝细胞中堆积，占据很大空间，影响了肝细胞的机能，肝脏脂肪的含量超过10%，就形成了“脂肪肝”。脂肪的大量堆积，甚至使许多肝细胞破坏，结缔组织增生，造成“肝硬化”。 4．胆固醇与动脉粥样硬化 虽然胆固醇是高等真核细胞膜的组成部分，在细胞生长发育中是必需的，但是血清中胆固醇水平增高常使动脉粥样硬化的发病率增高。动脉粥样硬化斑的形成和发展与脂类特别是胆固醇代谢紊乱有关。胆固醇进食过量、甲状腺机能衰退，肾病综合症，胆道阻塞和糖尿病等情况常出现高胆固醇血症。 近年来发现遗传性载脂蛋白（APO）基因突变造成外源性胆固醇运输系统不健全，使血浆中低密度脂蛋白与高密度脂蛋白比例失常，例如APO AI，APO CIII缺陷产生血中高密度脂蛋白过低症，APO-E-2基因突变产生高脂蛋白血症，此情况下食物中胆固醇的含量就会影响血中胆固醇的含量，因此病人应采用控制膳食中胆固醇治疗。引起动脉粥样硬化的另一个原因是低密度脂蛋白的受体基因的遗传性缺损，低密度脂蛋白不能将胆固醇送入细胞内降解，因此内源性胆固醇降解受到障碍，致使血浆中胆固醇增高。 5．肥胖症 肥胖症是一种发病率很高的疾病，轻度肥胖没有明显的自觉症状，而肥胖症则会出现疲乏、心悸、气短和耐力差，且容易发生糖尿病、动脉粥样硬化、高血压和冠心病等。除少数由于内分泌失调等原因造成的肥胖症外，多数情况下是由于营养失调所造成。由于摄入食物的热量大于人体活动需要量，体内脂肪沉积过多、体重超过标准20%以上者称为肥胖症。预防肥胖，要应用合理饮食，尤其是控制糖和脂肪的摄入量，加上积极而又适量的运动是最有效的减肥处方。 脂肪是人体内的主要储能物质，机体所需能量的50%以上由脂肪氧化供给；脂肪还协助脂溶性维生素的吸收，因此，脂肪是人体的重要营养素之一；包括胆固醇、胆固醇酯和磷脂等在内的类脂广泛分布于全身各组织中，是构成生物膜的主要物质，它与膜上许多酶蛋白结合而发挥膜的功能，胆固醇还是机体内合成胆汁酸、维生素 和类固醇的重要物质。脂类代谢受多种因素影响，特别是受到神经体液的调节，如肾上腺素、生长激素、高血糖素、促肾上腺素、糖皮质类固醇、甲状腺素和甲状腺刺激素促进脂肪组织释放脂肪酸，而胰岛素和前列腺素的作用则相反。适量的含脂类食物的摄入和适当的体育锻炼，有利于脂类代谢保持正常，一旦某种因素发生变化引起脂类代谢反常时，便导致疾病，危害人体健康。

一、脂质体的分离 适当化学结构的亲脂性药物是镶嵌在双层膜内而被包裹在脂质体中，其包封率取决于所用脂质的浓度。在这种情况下，包封率可达到90％，就不一定要除去未包裹药物。但是对水溶性药物而言，被包裹的药物仅是总量中的一部分，就必须从脂质体悬液中除去未包裹药物。由于脂质体比被包裹的药物分子要大得多，因此可利用它们的不同大小来分离除去未包裹的药物，这些方法有凝胶过滤柱层析法，渗析法等；若被包裹的物质是蛋白质或DNA，或者未被包裹的药物可能形成较大的聚结物，则可利用它们与脂质体浮力、密度的不同而采用诸如离心等方法进行分离。 (一)柱层析法 凝胶渗透层析技术广泛用于从脂质体悬液中分离除去未包裹药物，也可用于对悬液中的脂质体大小分组，这一技术在实验室中很有效且快速。在大规模生产上，虽然也可用凝胶过滤来纯化，但技术较困难且价格昂贵。另外，脂质体被洗脱介质稀释后可能需要增加浓缩步骤。 柱层析填料常用葡聚糖如Sephadex G-50，其步骤与常规方法一致。但必须指出：①在葡聚糖表面存在着能与脂质体膜结合并相互作用的微小部位。虽然这种作用并不影响脂质体在凝胶柱上的流动特征，但仍可导致少量脂质的损失，使膜的不稳定性增加，从而导致膜渗透性的改变及包裹物质的渗漏。这种现象在脂质浓度较低的情况下特别应予注意，一般可通过加大脂质体样品上柱量或用空脂质体预先将柱子饱和来解决。通常使用20mg脂质制成的小单层脂质体可饱和10g凝胶；②若凝胶颗粒太细，较大的脂质体可能被滞留在凝胶柱上，因此对多层脂质体宜选用中粗级的凝胶(粒径大小为50～150µm)，而对小单层脂质体则可用任何级别的凝胶。 (二)渗析法 此法是最简单的也是最常用的除去未包裹药物的方法(大分子化合物除外)。它不需要复杂的技术，也无须昂贵的仪器，且能够扩大生产。通过不断改换渗析介质可除去所有的游离药物。但是此法很费时，一般在室温条件下，要除去95％以上的游离药物至少需要更换三次渗析介质，时间在10～24h以上。此外，渗析介质的渗透强度应与脂质体悬液一致，否则在渗析中就会改变脂质体悬液的体积，且可能引起包裹物质的渗漏。 (三)离心法 在不同的离心力下离心是分离除去不同种类脂质体中游离药物的有效方法。为了完全除去游离药物，常常需重复悬浮和多次离心。使脂质体下沉所需的离心力取决于脂质体的大小，在某种程度上还取决于混悬液的絮凝状态。如果脂质体小且分布窄，就需要高速离心及冰冻条件。低速(2000～4000r／min)离心只能使大脂质体沉降。 显然，对于大量脂质体利用高速冰冻离心是极其耗能和昂贵的，因此此法不适于分离小脂质体。对于比较大的脂质体，低速离心可缩短操作时间并且可同时将较稀的脂质体悬液浓缩到所需浓度。为了避免脂质体遭到破坏，必须注意保证重复混悬介质的渗透压与脂质体悬液的渗透压相一致。 二、脂质体包封率的测定 (一)百分包封率的测定 显然，在考查包裹物质在生物体内的行为之前必须测定该物质在脂质体中的量，采用上述方法分离除去未包入脂质体中的游离物质，就可利用下式计算出百分包封率(Encapsulation percentage。EN％) EN％=(1一Cf／Ct)×100％ 式中，Cf为游离药物的量；Ct为脂质体悬液中药物的总量。 这里再介绍两种快速、用量少且适应性广的分离游离物质并测定EN％的方法。 1．微型柱离心法(minicolumn centrifugation method) 取一塑料注射针筒，填上过滤膜作衬片，装入用生理盐水溶胀的Sephadex G-50，再将针筒置一离心管中低速离心(2000r／min，3min)除去多余的生理盐水，此时，凝胶柱变干并可能与针筒内壁分离，精确定量加入脂质体样品，注意勿滴入柱床边缘，离心(2000r／min，3min)使脂质体进入离心管中，待测。再在凝胶柱上加入少量生理盐水，依上法离心，此次离心液中可能不再有脂质体或仍含有少量，这主要取决于脂质体的大小及组成，但游离药物在此过程中因葡聚糖吸附而不会被离出，然后可在凝胶柱上再加生理盐水，离心使柱干，此时游离药物被洗脱进入离心液中，反复几次，直至全部游离药物均从柱子上离心洗脱下来，分别测定包封药物及游离药物浓度，就可计算出EN％(图20—10)。微型柱离心法的优点是脂质体悬液几乎没有被稀释，对于实验室小规模的试验，可较好地用来分离除去未包裹药物和快速地测定包封率。 2．鱼精蛋白凝聚法(protamine aggregation) 此法可用于任何组成的脂质体，如中性或带负电荷的脂质体(图20－11)。方法如下：取脂质体悬液于10ml锥形离心管中，加入鱼精蛋白溶液(10mg／ml)，搅匀，静置3min，再加3ml生理盐水，在室温条件下离心，吸取2ml上清液，测定游离药物的浓度。将剩余上清液弃去，沉淀物以 10％ Triton X-100重新混悬，使脂质体膜材溶解，再补充生理盐水至总体积为，测定包封药物的浓度，就可方便地算出EN％。 (二)包裹容积的测定 包裹容积(entrapped volume)是指制成的脂质体相对于每毫克磷脂所占的内水相的体积，一般以微升(µl)表示。包裹容积的计算可通过测定包裹在脂质体内药物的总量来推测。假设在脂质体内水性介质中药物的浓度与开始制备时所用的药物浓度一样，经分离除去未包裹药物后没有物质从脂质体中渗漏出来，则很容易计算。但是在许多情况下，这样的假设往往不能成立。例如用二次乳化法制备脂质体时，在干燥除去有机溶剂时内水相可能也会失去；另外由于内外渗透压的差异，水分子可以进入或逸出脂质体，因此测定内部容积最好的办法是直接测定水的量。例如利用具有光谱性的液体代替内相介质，利用核磁共振法(NMR)测定，然后测出水的量。将脂质体在高速离心(200000g，6h)下沉降成为紧密的沉淀，小心除尽上清液，将沉淀物以D20(deuterium oxide)重新混悬，由于膜对于水的渗透性使整个体系中H20和D20很快达到平衡，取出少量用于磷脂量测定，剩余部分可作水的NMR扫描，峰高与D20中含水浓度成正比，与标准溶液对照即可求得水的量，从而计算出脂质体的包裹容积。 三、脂质体的稳定性 脂质体在放置过程中可能发生多种不同的变化。如磷脂质会氧化和水解，生成短链的磷脂，并在膜中形成具溶解性的衍生物；另外脂质体还可发生凝聚、融合等物理变化，从而导致包裹物质的渗漏。因此脂质体制剂若要发展为产品应市，必须在贮藏期间具有良好的稳定性；在体内到达靶组织之前或发挥其缓释作用之前亦须保持一定的大小及完整性。已证明脂质体在血液中比较稳定，但随磷脂的化学性质、胆固醇的比例和脂质体的大小、双分子层的数目等的不同，脂质体在体内的稳定性也会有所不同。但若在贮存过程中，药物从脂质体迅速渗漏，则必将限制脂质体的应用价值。 (一)化学稳定性 脂质体组分磷脂的氧化降解应在制备时即加以防止，可采用一些措施尽可能地降低氧化程度，例如，使用新鲜提纯的磷脂和新鲜蒸馏的溶剂，尽量避免高温，并在充氮和无氧的条件下完成制备过程，最后将脂质体贮存于惰性环境等。 在膜材组成中加入抗氧剂也是一种有效的方法。目前常用的抗氧剂是α-生育酚，为一种无毒的食用脂质。据认为蛋卵磷脂的氧化分解可因α-生育酚的加入大大减缓。另一可选择的降低氧化程度的方法是使用饱和磷脂代替不饱和磷脂，在天然来源的磷脂中，其不饱和度随植物、蛋黄、哺乳动物依次增加，对于蛋黄磷脂，不饱和度取决于动物的饲料及所用的提纯方法。 但是，无论是不饱和还是饱和磷脂，在脂质体的水性悬液中，都可能水解而形成溶血磷脂和脂肪酸，溶血磷脂进一步水解而形成甘油磷脂和脂肪酸，甘油和磷酸之间的酯键很难水解，所以不产生游离的磷酸和甘油。精制天然豆磷脂在脂质体水性悬液中的水解动力学已有研究。结果表明，豆磷脂的水解主要受H+和OH+的催化作用，在左右水解速率最小。体系中加入缓冲离子如醋酸、枸橼酸和缓血酸铵也可轻度增加豆磷脂的水解。 (二)物理稳定性 脂质体中包裹药物的渗漏和凝聚、融合成大的团块等物理稳定性问题是脂质体研究工作中的一大难题。一些研究表明，小单层脂质体在贮存中体积增大，药物渗漏与脂质成分及包裹药物的性质有关。由中性磷脂制备的脂质体的凝聚主要是由于范德华力相互作用所致，可在膜材中加入少量负电荷磷脂(如10％PA或PG)来克服。在膜材中加入微量的1,3-二乙酰-2-磷脂酰胆碱也可以阻止较小脂质体的融合。 较大的脂质体在制备方法适当的条件下一般不发生融合，而小于40nm的小单层脂质体由于膜的曲率大，易于发生融合，特别在相变温度时更易发生。 采用前体脂质体等重建脂质体的方法可以较好地避免脂质体在贮存中发生的化学和物理变化。重建脂质体有以下三种类型：含药或不含药的干脂质膜；含药或不含药的冻干脂质混合物：含药冻干脂质体。对于干脂质膜或冻干脂质混合物，重建时所获得的药物包封率是有限的，特别是对亲水性药物的包封率常常不高，悬液中含有较多的游离药物，实际应成价值不大。对于具有适当结构的亲脂性药物，重建产品可达到较满意的包封率，但在重建过程中所需的条件，例如搅拌程度和方法，要求在高出常温下超声处理等，实际应用不甚方便。 对于亲水性药物，可选择含药冻干脂质体这一重建形式，有报道在冰冻过程中若加入亲水性聚合物，如葡聚糖能产生自由流动能，利于冻干脂质体在水性介质中重建。例如当含有胰岛素的冻干脂质体用这种方法处理时，其重建后的包封率可达原来的70％，即在冰冻和重建过程中胰岛素的渗漏率大约为30％。如果包裹的是低分子量药物，渗漏率可能更高些。但是，这种技术为保证脂质体制剂在贮存中的稳定性提供了一个有效的方法。 四、脂质体大小的测定 脂质体的大小将影响脂质体在体内的处置，也是脂质体重要的质量指标之一。测定脂质体大小的方法有激光扫描法，电子显微镜法或库尔特粒度分析法。无疑，电镜测定法最为准确。因为人们可以直接观察每一个脂质体，并获得各个大小范围内脂质体外形的精确信息。但是要观察大量脂质体样本非常费时。相反．激光扫描法非常简单且操作快速，但仅能测出脂质体的平均性质。与之类似，采用库尔特粒度分析仪也可测出脂质体的大小分布，但后二种方法均难以描述更精细的结构。关于粒度测定的细节可参见本书第十二章。 五、脂质体的成分分析 (一)磷脂质的分析 1．含量测定 直接精确测定磷脂质浓度比较困难，因为干燥磷脂中总含有一定量的残留溶剂或其它杂质磷脂，因此最广泛使用的测定磷脂的方法是非直接法，例如含磷量的测定。对于制备脂质体的大多数磷脂而言，每摩尔磷脂均含1mol磷，仅有个别例外，如每摩尔心磷脂含有2mol磷。因此样品中磷脂的浓度可通过测定磷含量来计算。这里介绍二种磷测定法。 (1)Bartlett法 将磷脂的有机磷酸解成无机磷后，加入钼酸铵使之转化成磷钼酸，磷钼酸可用萘磺酸铵定量还原为蓝色，蓝色的强度由分光光度法测定，与标准品(如磷酸二氢钾)对照即可计算出含磷量。该法灵敏度较高且重现性好，但若样品中含有少量无机磷则会干扰测定。 (2)Stewart法 当脂质体混悬于磷酸盐缓冲液中，此时宜采用Stewart法。该法是利用磷脂在有机溶剂中与亚铁硫氰酸铵形成有色复合物，而不受无机磷存在的影响进行测定。在计算时，使用一与磷脂结构有关的转换因子将吸收值换算成磷脂毫克数，该因子随磷脂头基不同而异。也可利用磷脂标准液绘制标准曲线来计算。因此该法不适于测定含有未知磷脂的混合物。特别须指出的是，该法不能用于甘油磷脂的测定，若脂质体中含有卵磷脂和甘油磷脂，则可用该法对前者定量，再通过Bartlett法测定总的磷脂，就可计算出甘油磷脂的量。 2．磷脂质的薄层层析 薄层层析是检查磷脂质纯度的主要手段。与所有的层析法一样，磷脂质的薄层层析也是利用磷脂在液态有机相中对亲水性固定相有不同的亲和性，当液相在固定相展开时，不同的磷脂具有不同的保留时间，可根据亲水性的强弱改变展开剂的组成，从而改变磷脂在两相中的分配系数。最常用的固定相是硅胶，展开剂则常用含有氯仿的溶剂。如①氯仿：甲醇：水：(65：25：4 V／V)；②氯仿：甲醇：水：氨水(65：35：： V／V)；③氯仿：丙酮：甲醇：醋酸：水(6：8：2：2：1 V／V)；④乙酸乙酯：环己烷(1：1 V／V)等。最常用的显色剂为碘，也可用50％的硫酸 - 甲醇液或重铬酸钾液显色。 (三)磷脂氧化程度 1．磷脂的氧化 磷脂脂肪酸的氧化主要是由于游离基的作用。在电磁波辐射或者微量游离金属离子的催化下。脂肪酸碳链上首先脱去一个氢原子形成游离基，进而与空气中的氧发生连锁反应。含有双键的碳链更易受影响，因此聚合不饱和磷脂特别容易氧化降解。在含有单个或多个不饱和脂肪酸的脂质混合物中，磷脂的氧化分成三个阶段进行：①单个双键的偶合；②过氧化物的形成；③形成乙醛及链断裂。 值得注意的是，在无氧情况下仍会发生游离基反应导致双重或三重偶合的形成，但不产生过氧化物。另外，降解的最后一步过程要消耗偶合双键，因此在最终降解产物增加的同时，笫一步的降解产物将会减少。故很难用一种试验方法评估磷脂的氧化程度，甚至即使应用几个不同试验仍仅能大致估计氧化过程相对速率大小。 2．氧化指数的测定 氧化指数是用来检测游离基偶合的指标，因为氧化偶合后的磷脂在230nm左右具有紫外吸收峰而有别于未氧化磷脂。典型的紫外吸收图谱如图20－12。国内有人提出作为制备脂质体膜材的卵磷脂，其氧化指数应控制在以下，测定方法是，将磷脂溶于无水乙醇，配成一定浓度的澄明溶液，分别测定在波长233nm及215nm吸收值。按下式计算：氧化指数 = A233nm／A215nm 3．过氧化物的测定 卵磷脂氧化产生丙二醛及溶血磷脂等。丙二醛(MDA)在酸性条件下可与硫巴比妥酸(TBA)反应，生成一种红色染料(TBA-Pigment)该化合物在波长535nm处有特异吸收，吸收值的大小即反映磷脂的氧化程度。有人对丙二醛量与溶血之间的关系进行了研究，实验证明，当每毫升含卵磷脂的生理盐水中丙二醛含量超过µg时，在37℃放置1～2h即产生溶血。 除上述方法可估计磷脂的氧化程度外，根据聚合不饱和脂肪酸链在氧化最后阶段发生断裂或缩短，也可用气 - 液色谱法了解这些酰基链的变化。 (四)胆固醇的分析 与磷脂质类似，胆固醇的纯度及其氧化产物可用气 - 液色谱法进行检测。另外，由于胆固醇不论是游离型还是酯化型都能与含高氯酸铁的乙酸乙酯和硫酸试剂反应生成铁复合物，在波长610nm处有紫外吸收，采用标准胆固醇溶液对照，就可计算出胆固醇的量。 六、脂质体的灭菌 许多研究论文都认为脂质体不宜用加热灭菌的办法，且对各类辐射及各种化学灭菌剂也敏感，所以只能使用过滤灭菌或采用无菌操作法进行制备。这也是影响脂质体广泛应用于临床的一个重要原因。 近年来，国内有人采用100℃ 30min湿热灭菌法获得成功，灭菌前后脂质体的形态及大小均无明显的变化，渗漏率约为5％。另有人采用辐射灭菌法，即用60钴发出的γ射线，对三磷酸腺苷脂质体和甲氨蝶呤脂质体作辐射灭菌，照射剂量为15～20kGy，无菌试验结果均由试验前的阳性转为阴性。脂质体粒径灭菌前后无显著变化。灭菌所致渗漏率较小。 灭菌方法的实用性可能与混悬介质种类、磷脂组成及纯度等有关。采用121℃加热20min灭菌处理几种脂质体，发现在生理盐水中脂质体发生凝聚，而在等渗糖溶液和多羟基化合物溶液中不发生凝聚。加热灭菌后，具有较高的过氧化物值的含蛋卵磷脂的分散液稍变黄，改用具低过氧化物值的蛋卵磷脂、氢化蛋卵磷脂或DPPC则无此变化。在中性pH时充入氮气也可阻止颜色变化，但加入α-生育酚无效。经µm膜过滤的由蛋卵磷脂组成的脂质体的大小变小。在这一变化中，介质的类型也有明显影响。加热灭菌期间，包裹有羧基荧光素阴离子的负电荷脂质体(PC／chol／PG)发生渗漏，而使用正电荷脂质体(PC／chol／十八胺)不仅在加热灭菌期间不发生渗漏，且可贮存很长时间不渗漏。