新津东方
“灵魂出窍”的生物学解释 20201227很久以前，老何在大学读书的时候就学习了关于脑电波的一些基本知识，2015年，老何在一个自我催眠学习班上有缘了解到人在睡眠过程中各种状态下的脑电波变化，如精神紧张和情绪激动亢奋时14~30Hz的β波；人在清醒、安静并闭眼时8~13Hz（平均数为10Hz）的α波；也了解到人在婴儿期或智力发育不成熟、成年人在极度疲劳和昏睡或麻醉状态下，可在颞叶和顶叶记录到的，频率为1~3Hz的δ波。 最近，老何在王立铭老师的《巡山报告》中了解到一个生命科学的新发现：关于“灵魂出窍”的生物学解释。联想起多年以前读过的史蒂芬·科特勒/杰米·威尔《盗火：硅谷、海豹突击队和疯狂科学家如何变革我们的工作和生活》和王立铭老师解读关于镜像神经元的生物学研究进展，确实令人脑洞大开，非常值得对脑神经科学和静坐冥想有兴趣的朋友学习和思考！“灵魂出窍”的生物学解释“灵魂出窍”这个词，我们日常也会用，一般就是用来描述很爽、很嗨、很过瘾的情绪而已。但有意思的是，实际上有人真的能体验到这种感觉。 比如说，有一类叫作“解离型精神障碍”的疾病，患者就会出现类似灵魂出窍、灵魂和身体分离的感觉。还有某种精神类的药品，服用下去也有类似的效果。据说，它们会让人感觉自己的灵魂慢慢飞升、离开身体，甚至能回过头静静观察自己的四肢如何摆放、自己的脑子出现了什么想法。有时候，还会产生各种真实场景里没有的幻觉，比如看到小人跳舞、空间扭曲，听到五颜六色的声音等。至少根据当事人的描述，这种灵肉分离、灵魂出窍的感觉是实实在在的。因此，这类精神类药物也被称为“解离型药物” 每年，新闻上都有人吃了云南山里的蘑菇，出现各种奇奇怪怪的幻觉。在不少传统宗教里，巫师们会用各种植物和蘑菇做成药物，诱导信徒体验灵魂出窍的感觉。可以想象，一般人哪里扛得住这种经历，很容易就臣服在某种宗教教义的解释之下了。 当然，在现代科学的框架下，人的智慧不管再神奇，也无非是大脑中几百亿个神经细胞活动的结果而已，我们当然不相信人的脑袋里真的住着一个能够独立存在的灵魂，更不相信这东西在特殊条件下能够离开身体到处漂浮，还长了眼睛能回头观察自己的身体。但是不相信归不相信，这种体验的生物学解释又是什么呢？ 你可能觉得这个问题有点太科幻，科幻到不属于我们这个时代。但2020年9月16日，美国斯坦福大学的科学家们在《自然》杂志发表了一篇论文，居然真的为灵魂出窍找到了一个看起来很靠谱的解释[9] 。 这项研究的逻辑其实挺容易理解的。既然这种解离型药物能够引起灵魂出窍的体验，科学家们为了科研需要，就给小鼠注射这种解离型药物，然后通过显微镜观察小鼠大脑不同区域的神经电活动有没有什么变化。结果他们发现，在整个大脑皮层区域，只有一个叫作“压后皮层”的区域，在注射该解离型药物以后，很快出现了频率很低、只有1-3赫兹的规律脑电波活动，有点像一个小灯泡以每秒钟亮1-3次的频率闪烁。等过了45分钟，也就是该精神类药物渐渐失效的时候，这种规律闪烁就停止了。 这个压后皮层的区域大概在小鼠大脑中间偏后的位置，可能和学习记忆这些功能有关，本来根本没有人觉得，它会和灵魂出窍这种玄乎的东西有关。因此，看到这个现象，科学家们自然需要进一步确认。结果他们发现，除了该种解离型药物之外，别的解离型药物对压后皮层的活动也有类似的调节作用，而别的药品，麻醉剂也好，致幻剂也好，抗焦虑药物也好，都没用。 难道说灵魂出窍的体验，就是这个压后皮层区域的这种规律性活动导致的？ 为了回答这个问题，科学家们利用微型电极对数以百计的大脑神经细胞进行了更精细的活动记录，结果发现了一个更有意思的变化—— 在服用这种解离型药物之后，压后皮层的神经细胞的活动和大脑其他区域的神经细胞，出现了明显的脱节。具体来说，在正常状态下，因为大脑神经细胞之间存在大量直接或者间接的联系，它们的活动总是或多或少会步调一致，一起开启，一起关闭，因此就产生了我们熟悉的脑电波。但该种解离型药物注射下去，别的神经细胞还好，压后皮层的神经细胞却开始自作主张了，它们自己内部还仍然会步调一致，产生1-3赫兹的规律活动，但是这种活动和大脑其他区域脱节了。当然必须强调一句，这里所有注射该解离型药物的操作，都是为了科研中实验的需要。 这就很有意思了。我们刚刚描述了灵魂出窍的体验，听起来就是一种灵魂离开身体，还能回头观察自己的身体和思想的过程对吧？这个状态和压后皮层的神经细胞活动脱节，似乎有那么点像？ 小鼠不会说话，当然无法描述自己的精神体验。但是，科学家们用了一个很有意思的办法，来测试这种灵魂出窍的感觉在小鼠体内到底存在不存在。 正常情况下，如果让小老鼠的前爪触碰一块很热的金属板，小老鼠挨了烫，会快速收回前爪，同时忍不住去舔舔爪子。你要是养过小狗、小猫、小孩子，可能会知道我在说什么。这两种反应听起来好像差不多，但性质有点不同——缩爪子，是遇到危险的本能逃避反应；而舔爪子，则带了那么点儿受伤以后自我安慰的感情色彩。 科学家们发现，注射该种解离型药物以后，小老鼠遇热缩爪子的反应没变，但是却不怎么舔爪子了。对此，研究者的解释是，小老鼠可能进入了灵魂出窍的状态，身体基本的防御反应还在，但是飞升的灵魂却感觉不到痛苦悲伤了，只是冷静地做个旁观者，因此就不再疗伤了。 当然，这个解释肯定是有点牵强的。毕竟老鼠不乐意舔爪子可以有各种各样的解释，说不定人家就是不喜欢这个动作了呢，扯不到灵魂出窍上。 不过比较幸运的是，这群科学家恰好找到了一个正在接受治疗的癫痫患者，他时不时就会出现灵魂出窍的体验。 在这位患者大脑里，科学家们居然发现了一模一样的现象。在患者说自己正体验灵肉分离、白日飞升、大脑里分出了几个小人彼此聊天的时候，他大脑里的压后皮层区域也出现了非常类似的现象——频率在3赫兹左右的规律神经活动。尽管只有一个人类患者的数据，但还是让科学家们更坚信自己找到了灵魂出窍的生物学解释。 但是请注意，截止到现在，所有的数据都仅仅还是相关性数据——老鼠或者人，在出现灵魂出窍的体验的时候，大脑压后皮层的神经细胞会出现规律活动，并且和其他大脑区域的活动脱节。这本身不说明两者有因果关系。 想要证明因果关系，我们就得人工操纵压后皮层的神经电活动，模拟出那种1-3赫兹的规律活动，然后看看老鼠或者人是不是真的灵魂出窍了。神经科学的技术进步，使这件事已经不是问题了。在这篇论文里，科学家们先是用了一种叫作“光遗传学”的办法，在小鼠脑袋里利用蓝光和黄光交替闪烁，刺激小鼠的压后皮层神经细胞，人为创造出2赫兹的规律性神经活动，果然就发现，小老鼠遇热也不太愿意舔爪子了。然后他们又用微电极，在那位人类患者脑袋里激发了类似的电活动，那位患者确实立马体会到了灵魂离体的感觉。 这样一来，数据就形成了闭环。灵魂离体的时候，大脑一个特殊区域的神经细胞出现了一种特殊的电活动；而如果人为诱发这种电活动，也能够人为诱导出灵魂出窍的体验。 不知道听到这儿你有什么想法，我反正读论文的时候是很兴奋的。灵魂出窍可能是人脑出现的最神奇的一种体验，原本我很难想象，居然能在有生之年看到对它的生物学解释。但是没想到，就在刚刚过去的这个月，我竟然有机会看到这样一个很简单但是合乎逻辑的科学解释。做科学研究的快乐可能正在于此吧，在走向未知世界的道路上，天知道你每天都会碰到什么。 当然，和所有重要的发现一样，这项研究在解决了一些问题的同时，提出了更多的新问题。 为啥压后皮层这么特别呢？这个区域为啥会出现这种1-3赫兹的规律性活动？这种活动意味着啥？和人类的自我意识有什么关系？为什么当这个压后皮层和其他大脑区域活动脱节，人就会出现灵魂出窍的体验？是不是说压后皮层本来就扮演了一个大脑其他区域观察者和指挥者的角色，负责监督其他大脑区域的活动？还有，为啥该种精神类药物会专门干扰这个地方的活动？人类的多重人格障碍和这个区域有没有关系…… 我甚至觉得，这些问题的背后，其实隐藏着人类智慧的关键秘密，特别是咱们人类如何产生自我意识，如何建立起独一无二的身份认知，如何形成复杂的社会并展开合作和交流。但这些，我们只能等待后续的研究进展了。附阅读推荐：《盗火：硅谷、海豹突击队和疯狂科学家如何变革我们的工作和生活》——[美]史蒂芬·科特勒 杰米·威尔这是本刚出版的新书，书名《盗火》源于古希腊神话人物普罗米修斯的故事，他为人类从天上盗来火种，使人成为万物之灵。因此触怒了宙斯，被锁链缚在高加索山脉的一块岩石上，每天被恶鹰啄食内脏，而他的内脏又总是重新长出来。本书所探讨的“火种”便是类似于心理学家所说的“心流”的状态，也称之为“出神”。一种让人能够全身心投入一项活动，忘记自己，忘记时间，毫不费力，发挥特别好还充满愉悦的感觉。在这种状态下的人仿佛获取了天神的力量，对别人构成一个非常不公平的竞争优势。而现在在美国，从特种部队到很多高科技公司则将大量人力、物力、财力投入到这个项目的研究中，并取得了一定成果。海豹突击队员曾经利用这一技术成功地完成了许多看似无法完成的任务，而他们所运用的则是一种随时关闭自我与集体融合，进行意识切换，做出战略调整来取得战争的胜利的被称之为“集体心流”的“出神”状态。从生理学角度分心，当人们体验一次完整的心流状态时，大脑会分泌六种愉悦感激素（多巴胺、去甲肾上腺素、大麻素、血清素、内啡肽及催产素），这也是大脑能产生的全部愉悦感激素。这意味着，如果我们进入心流状态，在工作中也能体会到兴奋和快乐。在这一状态下，大脑前额叶皮层的广泛活动没有了，取而代之的是这块区域某些特定的部分要么亮起来、异常活跃，要么就暗下去、活动减弱。与此同时，脑电波从活跃的β波，慢慢降低到平和的α波，进入到类似白日梦的状态，以及更深度的类似催眠状态的θ波。在神经化学物质上，像去甲肾上腺素和皮质醇这样的重力化学物质被能够加强表现、产生愉悦感的类似于多巴胺、内啡肽、大麻素、血清素和催产素等化合物替代。 从这一机制来看，“出神”状态其实可以通过三种途径进入。 第一种是用药物（吸食或注射刺激性药物）来激发这种状态。比如在人类历史上，某些宗教或团体就曾经在举行某一仪式前要求参加者摄入含有兴奋药成分的食物。比如如果能成功激发人体催产素的分泌，参与者就会感受到前所未有的仪式感，进而影响其一生。 第二种，也是最古老的神秘的一种，就是通过冥想等方式进入。但这种状态很难达到，据说西藏密教的某些得到高僧才能随意控制这种状态。而我们普通人如果想利用冥想来持续性地形成一种自我消失的状态，没有几十年的时间是达不到的。 第三种是经过科学训练，并借助某些现代科学手段和仪器来实现“出神”，这也是之前所提到的美国各大公司和军方正在着力研究的项目。据说现在已经有一种头戴式的仪器，戴上它之后可以有效地控制你的大脑活动，从而让人更专注于一件事，大幅提升办事效率，并能产生强烈的愉悦感。 本书通过数据、实例，以及当代心理学，神经生物学，工程技术和药理学几个领域的最新研究成果，将我们带入了一个全新的领域，标志着人类对自身的了解越来越深入。但我们也应该清醒的认识到，“出神”体验也有很大的副作用，比如：出神体验带来的多巴胺能让我们产生极端的自我意识，这时我们会认为再大的事业也可以一蹴而就（类似传销的体验），从而决心去做，这样可能会产生悲剧；在出神状态下，我们很难平衡好“放纵”和“克制”的关系，做不到收放自如，这样，便无法做到真正的“自由”；有些出神状态的进入可以通过之前提到的吸毒，或者从事剧烈的、危险的运动来实现，而这样很可能会给我们带来难以预料的危害。附：脑电波（Electroencephalogram,EEG）是一种使用电生理指标记录大脑活动的方法，大脑在活动时，大量神经元同步发生的突触后电位经总和后形成的。它记录大脑活动时的电波变化，是脑神经细胞的电生理活动在大脑皮层或头皮表面的总体反映。[1] 脑电波来源于锥体细胞顶端树突的突触后电位。脑电波同步节律的形成还与皮层丘脑非特异性投射系统的活动有关。脑电波是脑科学的基础理论研究，脑电波监测广泛运用于其临床实践应用中。[1] 2020年3月30日，美国加州大学旧金山分校的科研团队把人的脑电波转译成英文句子，最低平均错误率只有3%，发表在《自然·神经科学》杂志上。[2] 概念 人的大脑是由数以万计的神经元组成的，脑电波就是这些神经元之间的活动产生的电信号，这些神经元之间的连接有的是兴奋的，有的是抑制的；思维活动就是反应这些神经元之间的联系，大脑中的神经元会接收来自其他神经元的信号，当这I些信号的能量积累量超过一定的阐值时，就会产生脑电波，为了检测到脑电波，人’们通常将电极放置在人的头皮上来检测脑电波信号，再应用相关的设备进行脑波的收集与处理。[4] 脑电波中单导联脑电信号确定性较差、随机性强,非线性研究受到一定的限制,识别结果较差;而多导联脑电信号包含着更多的脑活动的信息,它更能反映脑活动的整体信息。[1]波段划分 现代科学研究表明，人脑工作时会产生自发性电生理活动，该活动可通过专用的脑电记录仪以脑电波的形式表现出，在脑电研究中，至少存在有四个重要的波段。[5] 脑电波是一些自发的有节律的神经电活动，其频率变动范围在每秒1－30次之间的，可划分为四个波段，即δ（1－3Hz）、θ（4－7Hz）、α（8－13Hz）、β（14－30Hz）。除此之外，在觉醒并专注于某一事时，常可见一种频率较β波更高的γ波，其频率为30~80Hz，波幅范围不定；而在睡眠时还可出现另一些波形较为特殊的正常脑电波，如驼峰波、σ波、λ波、κ-复合波、μ波等。[5] δ波 频率为1~3Hz，幅度为20~200μV。当人在婴儿期或智力发育不成熟、成年人在极度疲劳和昏睡或麻醉状态下，可在颞叶和顶叶记录到这种波段。[5] θ波 频率为4~7Hz，幅度为5~20μV。在成年人意愿受挫或者抑郁以及精神病患者中这种波极为显著。但此波为少年（10－17岁）的脑电图中的主要成分。[5] α波 频率为8~13Hz（平均数为10Hz），幅度为20~100μV。它是正常人脑电波的基本节律，如果没有外加的刺激，其频率是相当恒定的。人在清醒、安静并闭眼时该节律最为明显，睁开眼睛（受到光刺激）或接受其它刺激时，α波即刻消失。[5] β波 频率为14~30Hz，幅度为100~150μV。当精神紧张和情绪激动或亢奋时出现此波，当人从噩梦中惊醒时，原来的慢波节律可立即被该节律所替代。[5] 在人心情愉悦或静思冥想时，一直兴奋的β波、δ波或θ波此刻弱了下来，α波相对来说得到了强化。因为这种波形最接近右脑的脑电生物节律，于是人的灵感状态就出现了。[5]
慧慧在济南
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](
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