脑供血不足研究论文

谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响论文

脑缺血属中风范畴，是临床常见病，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点，严重危害着人类健康。迄今为止，国内外在治疗脑缺血及其后遗症方面还缺少有效的化学治疗药物。循证医学表明，中医药对缺血性脑卒中的治疗有一定优势。当前大量研究集中在中药对急性脑缺血损伤的保护作用。而脑缺血后的功能恢复是一个较长时间过程，目前对其进行较长时间观察的研究较少。出自清代王清任《医林改错》的补阳还五汤，是治疗缺血性中风及中风后遗症的经典名方，该方在临床上应用广泛且疗效确切，但其促神经功能恢复机制还需进一步阐明。本文采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨了补阳还五汤较长时间多时间点对其神经功能的.保护作用，以期为治疗缺血性脑中风临床用药提供实验依据。

1 材料

1. 1 动物健康雄性SD 大鼠189 只，SPF 级，体重260 ～ 280 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK( 湘) 2009-0004，动物合格证号004535。

1. 2 药物补阳还五汤处方来源于清·王清任《医林改错》，按原方组成: 黄芪120 g，赤芍4. 5 g，川芎3 g，归尾6 g，干地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g，药材经湖南中医药研究院鉴定均符合《中国药典》2005 年版标准。补阳还五汤药剂制备: 饮片先用清水浸泡30 min，第一煎加药材及5 倍体积双蒸水，煎煮60min，二煎5 倍体积双蒸水，煎煮60 min，两煎混匀，浓缩至含生药2 g·mL - 1，冷藏待用。

1. 3 试剂10% 水合氯醛( 扬州市奥鑫助剂厂) ，多聚甲醛( 长沙市锦华化工有限公司) ，TTC( 红四氮唑，Sigma 公司) 。

1. 4 仪器Bx51 光学显微镜及IPP5. 1 图像分析系统( 日本Olympus) ，FA 型电子天平( 上海台之衡电子衡器有限公司) ，自动双重纯水蒸馏器( 上海玻璃仪器一厂) ，Finesse 325 型石蜡切片机( 英国Shando) 。

2 方法

2. 1 分组与给药将大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组，每组63 只，每组动物又分3 个时间点，即分别于首次给药后7， 14， 21 d 处死，每个时间点21 只动物。补阳还五汤组动物于术后2 h后开始给药，给药剂量为5 g·kg - 1·d - 1，每日ig 1次。模型组和假手术组动物均给予等体积蒸馏水。

2. 2 模型制备与评价参照文献采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型: 10% 水合氯醛( 3. 5 mL·kg - 1 ) ip 麻醉，取颈正中切口长约3cm，逐层分离，结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉、再结扎颈总动脉，于颈总动脉充盈分叉部下方约4 mm处将一长为4 cm 直径为0. 26 mm 的尼龙鱼线插入颈内动脉，直到遇到轻微阻力为止，固定尼龙线，缝合切口。假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉后随即缝合。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。动物清醒2 h 后参照Longa及Bederson的5 分制法进行神经功能评分，分值在1 ～ 3 分者入组。0 分: 无神经损伤症状; 1 分: 不能完全伸展对侧前爪; 2 分: 向对侧转圈; 3 分: 向对侧倾倒; 4 分: 不能自发行走，意识丧失。评分越高，神经功能缺损越严重，反之亦然。不纳入标准: 评分低于1 分; 蛛网膜下腔出血; HE 染色无脑缺血病理改变; 未到时间点死亡。死亡等不足动物时随机替补。

2. 3 指标检测

2. 3. 1 TTC 染色测脑梗死面积比每组每个时间点5 只大鼠， 10% 水合氯醛麻醉后，断头取大脑，置于- 20 ℃ 冷冻20 min 后，自额极每隔2 mm 切1片。第1 刀在脑前极与视交叉连线中点处; 第2 刀在视交叉部位; 第3 刀在漏斗柄部位; 第4 刀在漏斗柄与后叶尾极之间，共A，B，C，D，E 5 片。用2%的红四氮唑染色，37 ℃下避光30 min，正常组织呈深红色，而梗死组织则为白色。拍照后选最大缺血断面C 片梗死面积，运用Image-Pro Express 图像分析系统扫描计算，取梗死面积占C 片大脑总面积的百分比表示。为消除梗死侧大脑半球因脑水肿造成的误差，按Swanson 方法进行校正后计算C 片梗死面积百分比( IS) 。IS = ( S1 - Sr) /2S1 × 100%S1: C 片健侧总面积; Sr: C 片患侧非梗死区面积。

2. 3. 2 神经功能评分每组每个时间点10 只大鼠，于术后2 h 及动物处死前1 h 进行神经功能评分。

2. 3. 3 HE 染色观察海马、皮质组织病理学变化每组每个时间点6 只。同2. 3. 1 取大脑后4% 多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，脑冠状连续切片( 片厚5 μm) ，取含海马切片贴于载玻片上，随后HE 染色，光镜下观察比较各组大鼠左侧海马、皮质组织细胞形态病理学改变。

2. 4 统计学分析

所有数据以珋x ± s 表示，应用SPSS 19. 0 统计软件对数据进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P < 0. 05 被认为具有统计学意义。

3 结果

3. 1 各组脑梗死面积比较通过TTC 染色，假手术组着色比较均匀，为深红色; 7， 14， 21 d 模型组与补阳还五汤组染色不均匀，局部梗死区为白色，梗死部位在缺血侧顶叶大脑皮质、海马周围。梗死面积分析显示，模型组和补阳还五汤组随时间点后延脑梗死面积均逐渐缩小( P < 0. 05) ; 且7， 14， 21 d 补阳还五汤组梗死面积明显小于同时相模型组，差异具有统计学意义( P < 0. 05) 。

3. 2 各组神经功能评分情况假手术组各时间点大鼠神经功能评分均为0 分; 补阳还五汤组各时间点神经功能评分均较同时相模型组低，差异具有统计学意义( P < 0. 05) 。

3. 3 各组海马、皮质组织细胞形态学变化

3. 3. 1 海马假手术组海马细胞形态正常，细胞轮廓清晰可见，细胞核染色均匀，细胞排列整齐，间质着色均匀。7，14，21 d 模型组海马神经细胞皱缩，出现细胞核固缩，核边集严重，细胞内有空泡，细胞形态由椭圆形变成梭形、三角形，细胞间间距增大，间质染色稀疏，有空洞。7， 14， 21 d 补阳还五汤组海马细胞空泡样细胞较模型组明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列较模型组整齐。7，14 d 补阳还五汤组仍存在少量核深染及空泡样改变细胞，但21 d 补阳还五汤组海马细胞形态接近假手术组。

3. 3. 2 皮质假手术组皮质细胞形态正常，边缘清晰，排列整齐，形态完整，胞核着色均匀，细胞间质染色均匀。7，14，21 d 模型组缺血细胞呈空泡样坏死，细胞形态丧失，细胞间间隙增大，染色变浅，呈网状改变; 残存细胞其体积缩小、细胞核固缩深染、细胞边界不清。补阳还五汤组各时间点皮质细胞空泡样细胞较同时间相模型组明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列整齐，神经细胞核较清晰，细胞间隙染色较均匀。

4 讨论

局灶性脑缺血又称缺血性脑卒中，是由于脑的血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧，所致相应区域脑梗死性坏死，大量神经元丧失，而产生相应的神经功能缺损症状与体征，是脑血管疾病中最为常见的临床类型。目前西医治疗脑缺血的主要方法包括溶栓、抗凝、降纤、扩血管、高压氧、介入治疗等，还有尚处于动物实验阶段的基因治疗、神经干细胞移植等。这些治疗方法中除了超早期( 发病3 h 内)溶栓治疗有效率高达21% ～ 93%，其他疗法效果并不确定。而且溶栓治疗因其严格的时间窗，意味着只有不到5% 的病人有机会进行这一治疗。因此，缺血性脑中风的病人约80% 留下不同程度的后遗症——神经功能缺损。

典型的缺血性脑卒中在临床上可按照病程分为3 期。第1 期急性期，脑卒中后1 个月内; 第2 期恢复期，脑卒中后2 ～ 6 个月内; 第3 期后遗症期，脑卒中6 个月后。补阳还五汤主要用于脑缺血恢复期及后遗症期治疗，是治疗脑缺血后遗症的首选方，临床应用疗效显著。因此在动物实验中我们观察的时间点最长达到缺血后21 d，这相当于人脑缺血后遗症期。本实验研究中，神经功能评分结果表明补阳还五汤能促进脑缺血后大鼠神经功能恢复。其作用机制有学者认为与促血管生成、扩血管、抗凝、溶栓等改善脑缺血局部微循环，减轻脑水肿及氧自由基损伤，保护脑组织，从而促进神经功能恢复。本实验室及国内其他实验室研究表明补阳还五汤能促进缺血后脑内神经干细胞增殖、迁移、分化，可能也是其促进缺血后神经功能恢复机制之一。通过比较各组动物脑梗死面积比，结果显示补阳还五汤各时间点分别较同时间相模型组脑梗死面积明显缩小。可能的原因有: 其一，补阳还五汤在脑缺血急性期起脑保护作用，抑制了大量神经元死亡与凋亡导致梗死面积变小; 其二，补阳还五汤促进缺血后脑组织再生、修复、代偿，而导致梗死面积较相应的模型组缩小; 二者也可能兼而有之。另外，通过比较补阳还五汤组与模型组缺血后海马、皮质组织学改变，结果表明补阳还五汤能明显改善细胞形态与排列，促进脑缺血损伤后组织修复。

总之，本研究证实了补阳还五汤具有降低脑缺血神经功能评分、减小脑梗死面积、改善脑组织细胞形态与排列的脑保护作用，为该药临床治疗缺血性脑卒中提供了有力的实验依据。

挽救大脑的植物  银  杏选自〔美〕简•卡帕JeanCarper著《纽约时报》畅销书《神奇的食物》延缓衰老‐‐‐延缓和逆转衰老进程的基本策略       如果你的身体存在任何循环系统问题或者你想预防这些问题的出现，包括因为年老大脑功能的衰退，那么银杏可以是一个很有利的赌注。如果一个医生知道银杏的作用，他一定会在开出的处方上加上它。幸运的是，你可以在任何健康食物商店里找到它。是的，银杏这个名字对许多美国人来说是陌生而奇怪的，他听起来像是来自东方古老王国的某种东西。但它实际上是非常普通的观赏性植物，在整个美国和世界其他地方都有它的踪影。被捣碎成粉末或液体状的银杏叶，很久以来就以其对大脑的返老还童作用闻名于世。经过五千年对银杏药用价值的断断续续的普及和传播，这种从中间裂开的叶子获得了恒久的新生。银杏是一种古老的植物，它对衰老的问题也有独到的功效。银杏抗衰老的本领在德国的科学影响甚大，这两个国家有数以千万计的人用它与衰老作斗争并取得了很大成功。       普渡大学的药用植物权威泰勒博士声称，银杏是：“过去10年在欧洲出售的最重要的药用植物”。举例来说，在德国，银杏叶的提取物受到严格的检测，每年医生要开出500万张含有银杏的处方用以防治一些衰老的最严重的症状，包括记忆力衰退。银杏是什么？       银杏是具有两亿年历史的观赏性植物，现在它主要生长在全球的温带地区，包括美国，它的叶子分为两瓣，所以被称为双裂片叶。50磅的干银杏叶能够制成一磅的银杏叶提取物，这种提取物可以是液体的，也可以是固体的，它一般被制成胶囊或压成片剂。 银杏抗衰老的秘密       根据一些著名科学杂志的报道，银杏最为出众的抗衰老能力在对于血液循环的改善。这种功能对一些老年人是非常重要的，这些人的血管老化、缺乏弹性并出现了栓塞。显然，银杏能够帮助血液更顺利地通过最为细小和狭窄的血管，使大脑、心脏和四肢的组织中缺氧的部分获得营养，起到恢复记忆力和消除肌肉疼痛的效果。300篇以上有关银杏的科学论文在各种杂志上发表，其中许多论文都论证了银杏能够刺激血液循环，对组织增加氧气的供应，这很可能是通过扩张血管和阻止血液过分粘稠及血小板沉积来起作用的。最重要的是，银杏不仅能够将氧气和血液更多地输送到大脑的健康部分，而且对疾病损伤的部分格外关照，因此它能够赋予衰老的大脑以新生。       银杏的强大功效还来自于另一个方面：它是一种高效的抗氧化物。一项最近的试验显示，银杏在清除游离基方面的效率比维他命E还要高，因此它可以有效地防止高脂肪的细胞膜被氧化。法国巴斯德学会的德里博士认为，银杏的最重要的功效是在游离基对细胞破坏之后，重新恢复细胞膜的完整。在一项重要的动物实验研究当中，，德里博士还发现，银杏可以恢复大脑细胞接受来自神经传导系统的指导大脑进行工作信号的能力。举例来说，银杏能够在大脑细胞中奇迹般地恢复一些接收点，增加十分重要的大脑化学物质5-羟色胺的传递，这种植物随着年龄增加而逐渐失去。这是银杏逆转大脑衰老的另一条途径。       在欧洲和东南亚银杏获得了为老年人提高生活质量的声明，它应该成为每个希望度过幸福健康晚年的人生活中的重要伙伴。 （――麦卡伯，科罗拉多洲草本植物研究学会主席；科罗拉多洲草本植物研究学会是一个研究草本植物的非营利性组织。）银杏是如何抗衰老的―改善大脑功能       随着年龄的增加，人体中含氧的血液通过大脑中细小的毛细血管的能力逐渐下降，这种情况被称为脑供血不足。它的症状是众所周知的：注意力和短期记忆力下降，心不在焉、糊涂、乏力、疲劳、抑郁、焦虑、头晕和耳鸣。       根据一些令人吃惊的研究结果，银杏能够改善脑供血不足的症状。荷兰马斯特里赫本林姆堡大学的克莱金和奈普奇尔医生对40项控制研究进行了分析，他们在1992年《英国临床药理学杂志》上发表了一篇论文指出，用银杏来治疗脑供血不足和通常所使用Codergocrine(Hyder-grineTM）具有同样的功效。这两位荷兰医生特别引用了1991年德国所进行的两项研究。其中一项研究对99名患大脑功能障碍两年以上的老年患者施用银杏进行治疗，结果发现，3个月以后，72%的人的症状得到了改善，相比之下，用安慰剂进行治疗的人中只有8%症状得到了改善。与此类似，德国研究者对200名年均69岁的4年以上记忆力功能障碍的患者进行了实验，结果是，服用3个月的银杏制剂后，71%的患者症状获得改善，同期只服用安慰剂的患者只有32%获得改善。       这两位荷兰研究者对银杏的药用价值深信不疑，他们表示，一旦自己出现脑供血不足的症状，他们一定会服用银杏来治疗，因为所有的研究都没有发现银杏有什么明显严重的副作用。根据他们的研究，治疗脑供血不足最常规的日服用量是120毫克，症状的改善一般发生在服用后四到六周。       脑积水的治疗是神经病学和神经外科学中一个没有解决的问题，但是动物实验已经证实，银杏提取物对化学引致的脑积水有较好的的疗效。银杏还可以保护肝脏、减少心率不齐、防止过敏反应中致命性的支气管收缩，它在另一些情况下还被用于对付哮喘、抑制排异、心肌梗塞、中风、器官保护和透析。 （――赫特伯博士，任教亚利桑那大学医学院。）挽救老化的大脑       银杏似乎在那些比年轻人更有需要它的老年人身上可以起到更快和效率更高的作用。根据意大利的一项研究结果，静脉注射银杏的提取液，使70%的老年人体内流向大脑的血液增加。另一方面，50至70岁的人血液量增加了70%，而且，老年人血流量增加至最大量所需要的时间也比年轻人要短。 快速恢复记忆力       在一些情况下，记忆力会得到迅速的改善。法国对18名平均69岁的老年男女进行了一项双盲实验，这些人都患有轻度的记忆力障碍。银杏改善了他们大脑处理信息的速度。在实验前一个小时，研究人员给参加实验的人服用了320毫克的银杏或600毫克的安慰剂，结果发现，银杏使其服用者的大脑处理信息的速度几乎提高了一半。       延缓早老性痴呆症的发生根据德国一项对40名被诊断为老年性痴呆症的患者进行的双盲实验，银杏似乎可以改善这些患者的一些症状。每日3次，每次80毫克的银杏服用一个月之后，记忆力、注意力和运动心理状态都有了显著地改善。由于老年性痴呆症被认为是游离基的损害而导致，所以银杏的抗氧化活性很可能能够延缓这种损害的发展，如果能够防微杜渐的使用它，效果将会更好。西雅图自然产品研究咨询会的主任布朗博士说：“银杏叶的提取物是不多的几种真正能够被称为物超所值的<好药>。”改善边缘血循环       当人老了以后，由于流入边缘动脉血管的血液受到限制，可能会受到腿疼的折磨，这种情况被称为间歇性颇足。当血液循环太弱时，肌肉中的氧气量减少，有毒物质和游离基的生成增加，疼痛就会出现了。有确凿的证据显示，银杏可以通过刺激血液循环来缓解这种疼痛。德国有一项统计显示，它对5次实验进行了变化分析，结果显示，与服用安慰剂相比，服用银杏可以使患者在踏车实验中比服用前走得远得多。       在一项德国进行的为期6个月的实验中，银杏使1/3的患者无痛步行的距离延长了一倍，在其他患者中，步行距离延长了30%。 根据最新研究结果所列示的银杏的功效： 改善动脉、静脉和毛细血管当中的血流。 改善老年人记忆力衰退和信息处理速度的降低问题。 延缓老年性痴呆症的发生。 减少由于四肢血流不足所引起的脚疼的发生。 防止细菌的过分活跃，包括牙龈疾病。 缓解眩晕症。 减少耳鸣。 防止由于视网膜缺氧引起的视力衰退。 防止由于血液减少引起的听力损失。 降低血压。 增加良性的HDL胆固醇。 防止不正常的血栓的发生。 通过增加流入阴茎的血流，缓解男性阳痿的症状。 缓解雷那尔德病，这是一种循环系统疾病，会引起手脚发冷。 专家们抗衰老的秘密         克拉茨博士，40岁，美国抗衰老药物学会主席。克拉茨博士是该学会的创始人和负责人，他致力于对医生进行抗衰老药物临床应用的培训。该学会是把抗衰老当作可治疗的疾病加以研究的第一组织。预防衰老的有效物质       为什么一定要等到失去了很多身体能力之后才开始服用银杏呢？为什么不像服用维他命E和C及其他抗氧化物那样，早早地服用银杏来防止游离基的损害呢？事实上，新的研究成果对陈旧的观念提出了挑战。过去，对银杏的应用主要集中在它的治疗功能上。现在，新的研究显示银杏是一种具有抗衰老功能的强大的抗氧化物，它可以预防一些老年病的发生。       比利时的研究者发现，银杏的功能类似于人体内部分泌的最强大的抗氧化物――超氧化物歧化酶，它就是前文所提到的令果蝇返老还童的物质。日本研究者发现，银杏中所含的两种抗氧化物，杨梅黄酮和橡黄素，能够抵御游离基对大脑细胞的损害，这就带来了它对缺氧的大脑细胞的保护功能。研究者们推测，这两种类黄酮的抗氧化活性能够阻止游离基对大脑细胞的氧化。所以从中年开始每天服用40到80毫克的银杏作为衰老的预防措施，可以有助于在年老时保持大脑功能的健全。银杏对于那些刚开始发现大脑功能减退的人来说尤为合适。专家们说，它可以延缓这种衰退，推迟或消除日后的正式治疗。