叶绿素的测定方法研究论文

叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法。不过目前应用最为广泛的还是分光光度法。叶绿素提取液的吸收光谱表明：有两个强吸收峰，分别在红光区和蓝紫区，不同提取溶剂和原料所得的叶绿素溶液的吸收光谱比较相似。叶绿素a、叶绿素b的红区最大吸收峰分别在663nm、645nm附近，在蓝紫区分别为429nm、453nm附近。由于提取溶剂和原料不同，对叶绿素提取液进行光谱扫描后，所得的最大吸收值可能有较小范围的浮动。高效液相色谱(HPLC)定量检测叶绿素含量准确率较高，效果很好。用甲醇和丙酮作为流动相，体积比为80：20时，同时在流动相中加入质量分数为的冰醋酸，流速为。利用每一种色素的色谱峰面积进行定量，叶绿素a、叶绿素b的定量可通过外标法由工作曲线求得。[8]稳定性影响因子光在活体植物中，叶绿素得到了很好的保护，既可以发挥光合作用，又不会发生降解。但离体叶绿素对光照很敏感，光和氧气作用可导致叶绿素不可逆的分解。在自然条件或以胶态分子团存在的水溶液中，叶绿素在有氧的条件下，可进行光氧化而产生自由基，因此一些研究人员认为叶绿素的光氧化降解必需有氧分子参与，而且其降解速率随氧分子浓度的升高而加快。单线态氧和羟基自由基是叶绿素光化学反应的活性中间体，可与叶绿素吡咯链作用而进一步产生过氧自由基和其他自由基，最终可导致卟啉环和吡咯链的分解既而造成颜色的褪去。当然影响光氧化的因素有很多，比如体系中的水分、温度、光照时间、光照强度、光的波长范围等等，在这些影响因素中主要有光照时间、光照强度、光的波长范围、氧的浓度。目前在此方面的研究主要集中在自然光(复合光)对色素的影响而且大多数研究不是很深人。对于单色光(不同波段的光)对叶绿素稳定性的影响研究方面的报道却较少。叶绿素酶已有研究表明，叶绿素酶是一种糖蛋白。叶绿素酶催化叶绿素结构中的植醇键而水解生成脱植叶绿素，是叶绿素降解中的关键酶。叶绿素酶是以叶绿素作为底物的，它是一种酯酶。脱镁叶绿素也是叶绿素酶的底物，酶促反应的产物是脱镁脱植叶绿素。叶绿素酶的最适反应温度在60～80℃范围，实验证明，叶绿素酶在80℃以上其活性下降，100%时已完全失活。温度一些研究表明，叶绿素提取液在不同受热温度下，其降解速率曲线有明显的拐点，叶绿素在80℃以下，降解速度较慢，90℃以上降解速度急剧加快。总体而言，随着温度的升高，叶绿素降解的速率是逐渐加快的，只是较低的温度下降解速率不明显。pH值

叶绿素含量的测定方法如下：

叶绿素含量跟光合作用速率、植物营养状况等指标密切相关，通常，我们会通过对叶绿素含量的测定，来了解植物的生长状况。一般，植物叶绿素含量测定有三种：分光光度法，活体叶绿素仪法和光声光谱法。其中分光光度法是应用最广泛的叶绿素含量测定方法。

叶绿素含量的计算：

叶绿素含量测定首先得提取叶绿体色素，叶绿体 色素中含有叶绿体a，叶绿体b，胡萝卜素和叶黄素。在提取叶绿体色素时，我们使用不同的试剂，如丙酮，乙醇等有机物。

当试剂不同时，所得到的结果也会不 同。上图中我们使用四种不同的溶剂，进行叶绿体色素的提取。图中通过对四种溶剂在600nm-700nm波长间的吸光量进行比较，从而计算叶绿素含量，而 从图中，我们可以大致得到，这四种叶绿素提取液的光吸收性质基本相同。

利用分光光度法测定叶绿素含量是依据Lambert-Beer定律，数学表达式为A=Kbc。其中，A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。

叶绿素a,b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别在663nm和645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数分别为和；在645nm处的吸光系数分别为和。根据Lambert-Beer定律，我们可以列出方程：

D663 =

D645 =

根据以上方程组，可以求得：

Ca = –

Cb = –

然后我们又可求得叶绿素总量CT =（D652 × 1000）/

95% 丙酮2乙醇(匀浆)的提取效果最佳，因此，我们在进行叶绿素含量测定的时候，可以考虑运用95% 丙酮2乙醇(匀浆)作为提取液。

目前已经发明了比较方便的用于测量叶绿素含量的仪器—叶绿素含量测定仪，它是通过测量植物的叶绿素相对含量来了解土壤的性能指标和植物的硝基需求量，并了解植物的生长状况。