中国疼痛医学杂志投稿周期

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脊神经结扎神经病理痛模型大鼠脊髓

星形胶质细胞激活与痛行为的关系

3

赵 红 姜玉秋 孙 钱 孙艳妮 刘风雨 石玉顺 万 有△

(北京大学神经科学研究所、神经生物学系,教育部神经科学重点实验室,北京100083)

摘要 目的:研究L5脊神经结扎模型大鼠脊髓星形胶质细胞的激活与痛行为之间的关系。方法:

44只雄性SD大鼠180～220 g,随机分成4组,分别为假手术组、脊神经结扎1天、3天和7天组。

行为学上使用von Frey Hair测定大鼠在上述各时间点50%缩足阈的变化( n = 8) ,星形胶质细胞的

激活使用免疫组织化学方法观察其特异性标志物GFAP的染色情况( n = 3) 。结果: (1)脊神经结

扎后1天动物出现机械性痛超敏, 3天和7天痛行为稳定并持续存在;假手术组未见显著变化。

(2)结扎侧脊髓背角星形胶质细胞在术后1天发生激活, 3天和7天可见星形胶质细胞强烈的激活

反应,假手术组亦可见轻微的激活。(3)脊神经结扎后,星形胶质细胞发生了激活,其激活程度和

痛行为的产生和维持紧密相关。结论:脊髓背角星形胶质细胞的激活可能在神经病理痛中发挥作

用。

关键词 星形胶质细胞;胶质原酸性蛋白;神经病理痛;脊神经结扎

THE RELATIONSHIP BETWEEN THE SP INAL ASTROCYTIC ACTIVATION AND NEURO2

PATHIC PA IN BEHAVIOR FOLLOW ING SPINAL NERVE L IGATION

ZHAO Hong, J IANG Yu2Qiu, SUN Qian, SUN Yan2Ni, L IU Feng2Yu, SH I Yu2Shun, WAN You

(Neuroscience Research Institute and Department ofNeurobiology, PekingUniversity, Key Lab forNeu2

roscience, theMinistry of Education, Beijing 100083)

Abstract Objective: To investigate the relationship between the sp inal astrocytic activation and neuro2

pathic pain behavior in L5 sp inal nerve ligation ( SNL) rats. Methods: 44 male SD rats were randomly

divided into 4 group s: sham, SNL 1 d, SNL 3 d and SNL 7 d group s. Animalmechanical allodynia was

rep resented by 50% paw withdrawal threshold (50% PWT) thatwas assessed with von Frey filaments ( n

= 8). Using immunohistochemistry technique, GFAP was examined to evaluate the activation of astro2

cytes ( n = 3). Results: (1) The mechanical allodynia of the left hind paw appeared on day 1 after SNL,

and continuously existed from day 3 to day 7. No significant change ofmechanical allodynia was observed

in sham group. (2) In the ip silateral ( lesion side) lumbar dorsal horn, GFAP immunoreactivitywas ob2

served at day 1. This kind of astrocytic activation maintained intense at day 3 and 7, but a slight degree

of astrocytic activation was observed in sham group. (3) Astrocytes were activated in the sp inal cord in

SNL rats, the degree of astrocytic activation correlated wellwith the development and maintenance of neu2

ropathic pain. Conclusion: Astrocytic activation in the sp inal dorsal horn might p lay a role in neuropathic

pain.

Key words Astrocyte; Glial fibrillary acidic p rotein (GFAP) ; Neuropathic pain; Sp inal nerve ligation

( SNL)

3 国家自然科学基金(30330230, 30570566)和北京市自然科学基金(7052039)资助

△通讯作者

中国疼痛医学杂志Chinese Journal of PainMedicine 2007, 13, (1) ·39·

© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 

神经病理痛( neuropathic pain)是指中枢或者外

周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征,以自发

性疼痛( spontaneous pain) 、痛觉过敏( hyperalgesia)

和痛超敏( allodynia)为特征。近年来,胶质细胞的

激活成为疼痛研究领域的新亮点[ 1 ] 。本实验以L5

脊神经结扎( sp inal nerve ligation, SNL)大鼠作为神

经病理痛模型,通过测定SNL大鼠机械性痛敏的变

化和脊髓背角星形胶质细胞的激活情况,进一步探

讨神经病理痛大鼠星形胶质细胞的激活和动物痛行

为之间的关系。

材料与方法

1. 动物的分组和模型制备

雄性SD大鼠由北京大学医学部实验动物中心

提供,体重150～180 g。随机分为4组,分别是假手

术组、SNL 1 天、SNL 3 天和SNL 7 天组。每组11

只,其中8只用于行为学检测, 3只用于免疫组织化

学分析。

按照Kim 和Chung[ 2 ]方法制作SNL 模型。大

鼠经水合氯醛(300 mg/kg, i. p. )麻醉后,置于腹卧

位,背部切开皮肤,钝性分离左侧椎旁肌肉,暴露L5

脊神经,并用6号丝线紧紧结扎,止血、缝合并注射

青霉素预防感染。假手术大鼠操作与手术大鼠相

同,但不结扎神经。

2. 动物机械性痛敏的测定

按Chap lan等[ 3 ]报道的“up and down”方法,用

von Frey纤维( Stoelting公司,美国)测定大鼠后足

50%的缩足阈。15 g为本法可测定的最大50%缩

足阈值, 0. 25 g为本法测定的最小50%缩足阈值。

当50%缩足阈值小于4 g时认为出现痛敏。术前和

术后1天、3天和7天测定假手术组和手术组50%

缩足阈值。

3. 免疫组织化学实验

术后1天、3天和7天,动物10%水合氯醛(300

mg/kg, i. p. )麻醉后,打开胸腔,行左心室灌流。取

腰膨大段于恒冷切片机中做连续切片,切片厚度14

μm。

脊髓切片经水化、灭活内源性过氧化氢酶、封

闭,加入GFAP 多克隆抗体(Dako公司) 1 : 750,

4℃过夜后,依次加入生物素标记的二抗( SP29001,

中山) 、辣根过氧化物酶标记链酶卵白素( SP29001,

中山) ,之后3, 3’2联苯二胺(DAB)显色,梯度酒精脱

水,二甲苯透明,封片后显微镜下照相。

4. 统计学处理

行为学采用上述公式计算的动物足底50%的

缩足阈值,免疫组化采用Metamorph软件对结扎侧

脊髓背角浅层进行平均灰度分析,每个脊髓标本选

取5张切片,求其灰度的平均值。数据统计分析采

用Prism 4. 0软件进行,其结果用平均值±标准误

(mean ±s. e. m) 表示。多组数据间差异用单因素

方差分析(one way ANOVA)并继之以Dunnett’s post2

hoc检验,以P < 0. 05作为检验水准。

结果

1. 脊神经结扎后大鼠左侧足底50%缩足阈下

降

脊神经结扎后1天,大鼠结扎侧足底50%缩足

阈较术前基础值有明显的下降,即动物出现机械性

痛超敏, 3天和7天,该痛行为稳定并持续存在(与

手术前正常动物比较, P < 0. 01) 。假手术组动物足

底50%缩足阈较术前基础值未有显著变化(与手术

前正常动物比较, P > 0. 05,见图1) 。

图1 大鼠脊神经结扎后机械性痛敏的变化。术后7天内假手术大

鼠和SNL模型大鼠结扎侧足底50%缩足阈值的变化。

3 3

: P < 0. 01,与术前正常对照组相比

Fig. 1  Tactile allodynia in rats after SNL. The change of 50% paw

withdrawal threshold (50% PWT) in sham and SNL rats within 7 days.

3 3

: P < 0. 01, compared to the p re2operation control

2. 免疫组织化学方法显示脊髓背角GFAP染色

加深,胶质细胞激活

采用免疫组织化学(DAB显色)的方法,观察假

手术( sham)以及脊神经结扎后1 d ( SNL 1d) , 3 d

( SNL 3d)和7 d ( SNL 7d)各时间点星形胶质细胞

的反应(见图2A和2B) 。从图中可以看出, SNL 1 d

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结扎侧脊髓背角GFAP染色较假手术组增强, SNL 3

d和SNL 7 d GFAP染色较假手术组有明显的增强,

即提示神经损伤后1 d星形胶质细胞发生了激活, 3

d和7 d星形胶质细胞发生了强烈的反应;未结扎侧

的星形胶质细胞未发生此种改变。假手术组亦可见

结扎侧脊髓背角星形胶质细胞的轻微激活。

我们对结扎侧脊髓背角浅层进行了平均灰度值

分析,用此值代表星形胶质细胞的激活程度(见图

2C) 。脊神经结扎后1天,星形胶质细胞发生了激

活, 3 天和7 天,星形胶质细胞的激活程度逐渐增

加。

图2 免疫组化染色显示脊神经结扎后不同时间点脊髓背角GFAP染色变化。(A)脊神经结扎后1 d、3 d和7 d脊髓GFAP免疫组织化学染

色。Scale bar = 100μm。(B)为(A)图结扎侧脊髓背角的放大图。Scale bar = 50μm。(C)为(A)图结扎侧脊髓背角浅层平均灰度值的定量

分析。

3 3

: P < 0. 01, 与假手术组相比

Fig. 2 GFAP immunoreactivity in the sp inal dorsal horn after sp inal nerve ligation. (A) Immunostaining of GFAP in the sp inal dorsal horn at days 1, 3

and 7 after SNL. Scale bar = 100μm. (B) Two2fold highermaginification in (A) . Scale bar = 50μm. (C) Quantification of average intensity in the

superficial layers of the ip silateral sp inal dorsal horn as shown in (A) .

3 3

: P < 0. 01, compared with the sham group

讨论

1. 星形胶质细胞的激活反应与神经病理痛行为

的关系

中枢神经系统中的星形胶质细胞执行着多种功

能,如参与构成血脑屏障,调节细胞外离子和神经递

质的浓度,维持细胞外pH值的稳定等。许多刺激

可以激活星形胶质细胞,如神经损伤、炎症、神经系

统感染以及各种致痛因子等。星形胶质细胞激活后

发生一系列的改变,如增生、肥大、GFAP合成增多

和前炎性因子释放增多等。1994年, Garrison等[ 4 ]

通过免疫组织化学技术发现在坐骨神经压迫模型中

星形胶质细胞是激活的,如果用药物MK2 801阻断

异常的疼痛传导也可以阻断胶质细胞的激活,胶质

细胞的激活和放大性疼痛之间有很强的相关性,这

样就将胶质细胞和疼痛联系起来。后来随着研究的

不断深入,人们逐渐发现胶质细胞在许多痛模型中

是激活的[ 5～7 ] 。在本次实验中,我们对脊神经结扎

后不同时间点星形胶质细胞的反应做了一系列观

察,发现星形胶质细胞在脊神经结扎后的1天发生

了激活, 3天和7天,星形胶质细胞发生了强烈的激

活反应。星形胶质细胞的激活主要发生在结扎侧的

脊髓背角,未结扎侧和脊髓腹角未见星形胶质细胞

的激活。这和文献已有的报道相一致,神经损伤后,

星形胶质细胞在神经投射的区域发生了激活[ 8, 9 ] 。

脊髓是传递从外周到大脑疼痛信息的中继站,传递

疼痛的初级传入神经元轴突末梢终止于脊髓背角的

不同层面,在此与不同类型的脊髓次级神经元发生

联系。其中中等直径有髓鞘Aδ纤维和小直径无髓

鞘C纤维终止于脊髓背角浅层[ 10 ] ,这两种纤维介导

伤害性信息的传递。因此,脊髓背角浅层被认为是

和疼痛传导相关的部位。星形胶质细胞在此处发生

中国疼痛医学杂志Chinese Journal of PainMedicine 2007, 13, (1) ·41·

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激活提示这类细胞可能参与了伤害性信息的传导。

脊神经结扎后1天动物即出现明显的机械性痛

敏, 3天和7天动物维持在高水平的痛敏状态。假

手术组未见明显的行为学变化。星形胶质细胞的激

活也发生在脊神经结扎后的1天, 3天和7天,激活

的程度呈上升的趋势。脊髓中的胶质细胞包括星形

胶质细胞和小胶质细胞。根据已有文献报道[ 11 ] ,脊

神经结扎后小胶质细胞不激活或者轻微激活,小胶

质细胞的抑制剂不能反转已经建立的痛行为;而星

形胶质细胞在脊神经结扎后发生强烈的激活反应,

并且与痛行为的发生和维持相平行,提示星形胶质

细胞可能参与了痛行为的形成。小胶质细胞和星形

胶质细胞在疼痛中发挥的作用不同,目前的观点认

为小胶质细胞的激活启动了星形胶质细胞的激活,

而星形胶质细胞的激活程度与放大性疼痛的产生和

维持相关[ 12 ] 。星形胶质细胞与痛行为的产生和维

持的整个过程相关还是只是短暂性相关,星形胶质

细胞的激活是因还是果,单纯的星形胶质细胞的激

活可否诱发痛敏的产生还需实验进一步验证。

2. 星形胶质细胞在神经病理痛中的可能意义

星形胶质细胞和神经元之间关系密切,它们对

神经元周围微环境的改变非常敏感,能迅速发生反

应。发生反应的胶质细胞能释放大量的神经活性物

质和促炎性因子,这些物质能增加初级传入神经末

梢痛递质的释放和增加痛觉传递神经元的兴奋性来

扩大痛觉传递,并和神经元之间形成了一个反馈环

路[ 13 ] 。由此可见胶质细胞不再是中枢神经系统中

的一个静止不动的成分,而是处于一个与神经元不

断进行信息交流的动态过程。胶质细胞通过胶质网

络传递信号,从而与神经元互补,共同参与疼痛的传

导。有关胶质细胞和疼痛关系的深入认识,将为研

制慢性痛的药物提供新的靶点。

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