棱镜毕业论文

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高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷

GPS在工程测量中的优化与应用探讨 摘要］鉴于GPS相对于全站仪等传统测量技术具有全天候、高精度、自动化、高效益等优势，本文通过对几个工程测量实例的实 施、对比及分析，就工程测量中如何对GPS技术进行优化与应用进行了探讨，并得出了相关结论。 ［关键词］GPS静态定位动态定位工程测量 定位技术的特点和优势 全球定位系统具有性能好、精度高、应用广的特点，是迄今最好的 导航定位系统。随着全球定位系统的不断改进，硬、软件的不断完善，应 用领域正在不断地拓宽，目前已遍及国民经济各种部门，并开始逐步深 入人们的日常生活。经过近10年我国测绘等部门的使用表明，GPS以 全天候、高精度、自动化、高效益等显著特点，赢得广大测绘工作者的信 赖，并成功地应用于大地测量、工程测量、航空摄影测量、运载工具导航 和管制、地壳运动监测、工程变形监测、资源勘察、地球动力学等多种学 科。GPS卫星全球定位系统的全面建成和发展，必将给导航和测绘行业 带来深刻影响。 定位技术在实际测量工作中的对比分析 自2003年单位引进4套美国TRIMBLE(天宝)5700 GPS双频接收 机（静态定位精度5mm+×D）以来，笔者一直从事GPS的定位和 测量工作。分别完成了朝阳区温榆河河道改造工程控制测量、海淀区莲 西商务楼竣工控制测量、顺义残疾人培训中心控制和数字地形测量、燕 山石化控制和数字地形测量、大安山矿区控制和数字地形测量、天津塘 沽滨海旅游度假村控制和数字地形测量、天津地铁勘察定位、京沪高速 铁路勘察定位、沈大客运专线勘察定位、外交部职工住宅楼勘察定位等 大小数十项工程的控制和测量工作。在近几年来的工程测量中，通常都 是天宝3602DR全站仪(测量精度±2''，±（2mm+2ppm×D））和天宝 5700GPS联合进行，两者相互配合，取长补短，弥补对方的不足，从而更 有效发挥各种仪器的使用价值。全站仪测量具有精度高，速度快等优 势，但是受通视条件影响较大，遇有障碍物时需多次转点，使其优势得 不到充分发挥；而GPS测量对通视条件则没有要求，但由于测量数据都 是通过接收卫星信号得来，只有保证仪器能够接收到足够的卫星信号， 才能保证测量成果，因此，它对仪器周边的建筑、构筑物要求较高。全站 仪测量经过几十年的发展，现在各个方面已经是十分成熟，而GPS测量 在国内刚开始不久，好多技术都在试验阶段，各方面都有待完善。虽然 这两种测量技术广泛运用在日常生活中，但两者在实际工程测量中应 用时，在满足国家规范的同时两者之间相对测量精度能达到多少，特别 是GPS测量相对业已成熟的主流的全站仪测量之间的测量误差，笔者 多方查询，各方面文献均未作出相关报道。我们一直试图通过各种方法 和手段，对两种测量之间的关系进行一些研究，希望能对今后的测量工 作起到一个指导和借鉴作用。通过多年的工程实践和试验，笔者选取了 几个比较有代表性的工程实例，对GPS测量和全站仪测量在测量成果 精度上作了一些对比、总结和探讨。 GPS静态定位（四等）和全站仪定位工程对比 静态定位基本上都是用在测量控制上，故本研究分别是朝阳区温 榆河河道改造工程控制测量和海淀区莲西商务楼竣工控制测量的控制 测量数据进行比较，主要比较两种定位方面的坐标成果数据，具体测量 数据如表1、表2所示。通过以上工程实例，可以看出现在的GPS静态 定位（四等）和全站仪定位精度已经很接近，平面和高程误差都能控制 在10mm之内，测距相对误差在7万分之一以上，都能够满足3等以下 导线测量和3等以下水准测量的测量规范和生产要求，但是GPS静态 定位比全站仪定位更高速、高效，应用范围更广阔，经济效益更加明显。 在市场竞争激烈的今天，GPS测量已经成为工程测量的首选手段。 GPS动态测量(RTK)和全站仪测量 动态测量一般用在精度要求较低的测量工程。如地形测量、勘察定 位等方面，本研究选用天津塘沽滨海旅游度假村控制，沈大客运专线勘 察定位和数字地形测量和外交部职工住宅楼勘察定位成果进行比较， 相关测量数据及比较结果如表3、表4和表5所示。通过以上工程实例， 可以看出GPS动态测量(RTK)与全站仪的平面误差基本上在250mm之 内，高程误差在50mm之内。能够满足工程勘察初勘平面误差 m，高 程误差5cm，详勘平面误差，高程误差5cm的规范要求，同时还 能满足常规地形测量1∶500比例尺以上地形测量的工程测量规范要求。 GPS动态测量可以很好避免全站仪测量时繁琐复杂的分级控制过程， 能够很好克服测量点之间的通视问题，能减少一半的测量人员，从而节 约大量工作时间、大幅提高测量工作效率。 在工程测量中的优化经验与思路 通过对以上的测量数据对比和经验总结，我们对GPS测量定位技 术的性能、精度和使用条件有了更进一步的了解，这对我们后续的许多 工程施工提供了很好的依据，我们可以针对不同的工程技术要求，制定 不同的施测方案，在确保工程质量的同时，最大限度降低生产成本，使 单位的经济效益得到大幅提高。后来进行的大兴黄 村动车段勘察定位工程中，施工场地建筑密集，通 视条件极差，我们根据设计规定平面误差不超过1米、高程误差不超过 10cm的技术要求，利用RTK动态定位技术，有效克服了测量点之间通 视不畅的问题，测量人员也从两个测量组减少到一个组，五百多个钻孔 定位在三天时间就全部完成。同样的工作量如果要使用常规全站仪定 位，在如此困难的施测条件下，两个测量组估计七天才能完成。 团河行宫数字地形测量工程也是利用前面的理论成果，我们因地 制宜的制定出相应的施测方案。根据场地位于交通条件极不便利的郊 区且场地附近没有控制点的情况，利用GPS静态定位从6公里外把城 区的控制点引测过来，然后再用RTK动态技术进行数字地形测量，一 个测量组两天时间就完成了1平方多公里的地形测量。如果用全站仪 测量，仅控制测量一项就需一个测量组工作四~五天，加上地形测量至 少要花费一周的时间。利用以上的测量结论，沈大客运专线勘察定位、 外交部职工住宅楼勘察定位等工程都在较短时间内快速、高效地完成， 充分验证了上述经验总结的正确性。 3.结论 通过多年来对GPS定位技术的应用，可以总结出以下几点： （1）测量成果相对精度高，质量可靠。点位范围可以方便地控制在 米之内，并且点与点之间误差均为随机误差，不会产生累积误差。 （2）定位系统可以全天候作业，不受视线通视影响。 （3）可实时提供定位点的坐标及其点位精度，方便快捷，定位情况 一目了然。 （4）野外作业简单，效率高，自动化程度高，大大减小了劳动强度， 可节约大量的人力物力资源。 （5）作业过程中的一些注意事项： a.测量定位前应该做好作业地区的星历预报分析，明确测量的最 佳时段，通常卫星数量少于6颗时，不宜进行作业。因为卫星数量过少， 会对观测结果产生较大影响，测量成果精度不高不说，还会给内业解算 带来许多麻烦。 b.静态观测时，对于空旷、无干扰的地区，至少要连续观测30分钟 以上；对于城市建筑密集、干扰众多地区，最少要观测1个小时以上，才 能确保外业观测质量。 动态测量(RTK)时一定要在初始化完成后，在卫星fixed(固 定)情况下测量，如果在float(浮动)情况下测量，结果差别很大，少则几十 公分，多的有近十米。 （6）有待进一步研究之处： GPS实时静态定位在变形测量（位移、沉降）中的应用，它和全站仪 定位之间的关系。 不同的解算软件对GPS定位结果的影响。 参考文献 ［1］中国有色金属工业协会主编《.工程测量规范》（GB50026-2007） ［M］.北京：中国计划出版社，2008. ［2］北京市测绘设计研究院主编《.全球定位系统城市测量技术规 程》（CJJ73-97）［M］.北京：中国建筑工业出版社，1997. ［3］李天文.GPS原理及应用［M］.北京：科学出版社，2003. ［4］胡伍生，高成发.GPS测量原理及其应用［M］.北京：人民交通出 版社，2002.

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