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一篇文章的引用参考部分包括注释和参考文献两部分，注释是作者自己的解释（转引的参考文献也可以放在注释里），参考文献仅需列出参考书或论文的名称、作者、出版社或发表的期刊、著作时间或期刊期数等。注释用圆圈1 2标注，放脚注，参考文献用[1][2]标注，放尾注。有的刊物要求注释和参考文献都要在内文标注，有的刊物对参考文献不要求内文标注，在尾注列出就行。按最新的CNKI规范的要求应是前者。为保险起见，你还是都标吧。注：参考文献如是著作要标页码，论文只要标出期刊是第几期。例：参考文献：[1]金福海.论建立我国的惩罚性赔偿制度[J].中国法学,1994,(3).[2]杨立新.“王海现象”的民法思考——论消费者权益保护中的惩罚性赔偿金[J].河北法学, 1997,(5).[3]金福海.消费者法论[M].北京:北京大学出版社，2005:251.[4]闫玮.完善我国<消费者权益保护法>中的惩罚性赔偿制度[J].太原师范学院学报,2007,(1).[5]梁慧星.<消费者权益保护法>第49条的解释适用[J].民商法论丛,2001,(3).[6]王堃.论我国<消费者权益保护法>中的惩罚性赔偿[J].现代商业,194.[7]梁慧星.关于<消费者权益保护法>第49条的解释适用[N].人民法院报,2001-3-29.[8]孔祥俊.公平交易执法前沿问题研究[M].北京:工商出版社,1998:219.
写参考书的名称、作者、著作时间等，在论文的最后。
一、缺乏应有的文献综述有些学位论文没有文献综述，作者却说，他写的题目找不到相关文献或没有相关文献。其解释有两种可能: 一是作者认为前所未有才是创新，甚至个别的还误以为写上“填补空白”、“没有同类文献”等词句可以提高文章的价值，这显然是一种误区; 二是作者未下功夫去查阅和学习前人已做的工作而企图走捷径，实际上，“欲速则不达”，一篇没有好的文献综述的学位论文，一般来说很难有创新。二、文献综述没有紧扣主题有相当一部分学位论文评述的并不是对特定专题做出贡献的文献综述，没有紧扣主题，没有围绕论文的主题来筛选文献，而是四面出击，回顾了与专题相关的整个领域的发展，导致文献综述部分漫无边界，冗长而不能给论文的价值“添分”，以致综述部分反映不出论文的特色，同一篇文献综述似乎可以在多篇学位论文中相互套用。同时，容易导致写作上的随意性，甚至为了追求篇幅，就在文献综述部分增添内容，以至于文献回顾曲曲折折占用不少篇幅，而真正进入正题的文字却不多，说明作者并没有理解文献综述的定位和作用。三、简单罗列堆砌文献有些学位论文文献综述写作上存在简单罗列的问题，综述部分仅简单地列示出A 说、B 说、C 说、D 说等，然后就无下文了。从这种文献综述当中看不出作者所依据文献演进的内在逻辑，作者也没有依据文献综述清晰地推导出研究问题，文献综述变成作者的读书心得清单和资料汇编，变成相关学术研究的简单堆砌，表面上看洋洋洒洒，而实际上作用有限，读者既看不到“问题的来龙去脉”，也看不到“证明的来龙去脉”。四、文献综述缺乏权威性有些文献综述不是系统化地回顾现有的研究文献，找出适合研究的主题，而是有选择性地探讨现有文献，特别是遗漏一些权威性和经典性的文献，缺乏权威性和学术性，给人的感觉就是作者没有认真研读过真正有价值的文献，不熟悉所研究领域的理论背景和研究进展，对文献的掌握和理解不到位。五、文献综述与背景描述相混淆有些学位论文将“文献综述”和“背景描述”等同起来，研究生在选择研究问题的时候，需要了解该问题产生的背景和政策法规，如研究中国军人工资制度时，需要收集整理“中国军人工资制度的发展历程”、“中国军人工资制度的政策和规定”等资料，但这些内容属于“背景描述”。由于研究关注的是现实层面的问题，因此严格讲，资料本身不是“文献综述”，真正的“文献综述”应该是对学术观点和理论方法的梳理和评论。六、文献综述只述不评有些学位论文文献综述仅仅局限于对已有文献的简单重复和一般性介绍，缺乏作者自己的观点和见解，缺乏对以往研究的优点、不足和贡献的批判性分析与评论，难以体现自己的研究贡献。特别是对有较多学术争议的研究主题，或发现现有的研究结论互相矛盾时，有些学位论文避重就轻，轻易放弃研究“批判”的权利，而实际上，这些不协调或者冲突是很有价值的，正是研究的可能创新之处。
参考文献如果是网页的话应该按照相关要求进行书写。
网站类参考如下：
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2、【21】中科院报告:我国现代物流2007年将保持快速发展，中央政府门户网站，2007年2月24日，这里写具体网址。
3、【22】2006年全国物流运行情况通报，中国仓储与物流网，2007年4月29日，这里写具体网址。
参考文献注意事项：
一、引用文献不宜过于陈旧。文后参考文献的标引，在很大程度上取决于作者学术造诣的程度及对同类文献的检索水平、利用能力。作者在撰写论文的过程中，引用的参考文献较新颖，能反映同行业最新科研动态和学术水平。
二、引用文献类型应呈一定比例。根据相关规定，文后参考文献的类型主要有：专著、论文集、学位论文、报告、连续出版物(期刊)、论文集析出文献、报纸、标准、专利及电子文献等。
参考文献一般是写论文中所有参考到的文献。那么，论文参考文献怎么写呢?下面我来教你写论文的参考文献。
论文参考文献标准格式
1.专著：[序号]作者.书名[M].版本(第1版不著录).出版地:出版者,出版年.起止页码.
2.期刊:[序号]作者.题名[J].刊名,年,卷(期):起止页码.
3.会议论文集(或汇编):[序号]作者.题名[A].编者.论文集名[C].出版地:出版者,出版年.起止页码.
4.学位论文:[序号]作者.题名[D].学位授予地址：学位授予单位，年份.
5.专利:[序号]专利申请者.专利题名[P].专利国别(或地区):专利号,出版日期.
6.科技报告:[序号]著者.报告题名[R].编号，出版地：出版者，出版年.起止页码.
7.标准:[序号]标准编号，标准名称[S].颁布日期.
8.报纸文章:[序号]作者.题名[N].报纸名，年-月-日(版次).
9.电子文献:[序号]主要责任者.电子文献题名[电子文献及载体类型标识].电子文献的出处或可获得地址，发表或更新日期/引用日期(任选).
10.各种未定义类型的文献:[序号]主要责任者.文献题名[Z].出版地：出版者，出版年.
选择参考文献时应该注意的因素
通读备选参考文献并掌握研究范围
在最终确定你需要的参考文献之前，务必摸透每一篇文献的精髓。在信息化尚未如今天这般发达之前，论文作者一般需要亲自前往图书馆翻阅装订厚厚的过刊，并搞到副本之后方能决定最终需要的参考文献，最痛苦的莫过于还得通读全文。
不过，现在在线数据库资源已经非常发达，我们可以通过很多软件或者平台(比如EndNote、RefWorks或者 Mendeley)将可能需要的参考文献直接下载到自己的账户当中即可。
但不幸的是，很多论文所选择的参考文献和作者所讨论的课题相关性不大，有时甚至不存在相关性，这种情况屡见不鲜。有一个早期的调查(Paper Trail Reveals References Go Unread by Citing Authors. DOI: )指出，论文作者真正通读过的参考文献数量只占所有参考文献数量的25%。
这种情况会对读者造成一定的不良影响，比如说，读了你的论文的人会误认为那些与你所讨论研究课题不相关的参考文献有参考价值，因此这些不具备针对性和相关性的参考文献就被引用到了下一篇文章当中。
好好的文献本来与你无冤无仇，不适当的引用的话，你就会成为始作俑者。
使用正确的`引用格式
确保参考文献信息的完整，要包括作者姓名、期刊名以及分页等。与文献的原始发行版本进行比对，以核对信息的准确性。如果数据库中原版信息条目有误且被引用之后，这些错误信息就会像病毒一样扩散。
常见的引文格式有APA、CELL、Chicago、Harvard、MLA、Nature以及Science。下面我们就同一篇文章，列举出这七种引文格式。为了阅读便利，我选了一个较短的文章标题。
论文题目：Graphene as a new sorbent in analytical chemistry
APA格式
Sitko, R., Zawisza, B., & Malicka, E. (2013). Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 51, 33–43.
CELL格式
Sitko, R., Zawisza, B., and Malicka, E. (2013). Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51, 33–43.
Chicago格式
Sitko, Rafal, Beata Zawisza, and Ewa Malicka. 2013. “Graphene as a New Sorbent in Analytical Chemistry.” TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51 (November): 33–43. doi:.
Harvard格式
Sitko, R., Zawisza, B., Malicka, E., 2013. Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51, 33–43. doi:
MLA格式
Sitko, Rafal, Beata Zawisza, and Ewa Malicka. “Graphene as a New Sorbent in Analytical Chemistry.” TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51 (2013): 33–43. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. Web.
Nature格式
, R., Zawisza, B. & Malicka, E. Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51, 33–43 (2013).
Science格式
1. R. Sitko, B. Zawisza, E. Malicka, Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 51, 33–43 (2013).
自引的管理
要在一定程度上限制引用自己发表论文作为参考文献的数量。我们心里都非常清楚自己的文章被引用的重要性，因为以前发表的文献提供的信息包括早期发现、实验程序以及与目前工作相关的分析。自引也可以帮助期刊的编辑、审稿人以及读者确定你目前发表的研究结果不仅仅是前期工作的增量推进。
但是作者自己发表的论文不应该占据所有参考文献的支配地位，将自引数量保持在20%至25%以下是比较理想的程度。自引使用过渡的话，你对h指数的功利心便昭然若揭。
比如一位教授的论文引用情况为，共发表了30多篇SCI论文，共被引用为455次，其中他引达432次，也就是自引为23次，他引率超过95%!应该说这个他引率很高。显然,过高的自引率不好，但是，过高的他引率就一定好吗?
高他引率可表示所开展研究工作受到关注或认可度较大，但同时也可能表示其研究工作的离散性大或系统性差。
因此，他引率可能并不是越高越好，至于多高的他引率才比较好，这可能与发表文章的数量和研究内容有关，难以定量推算，但从感性上说，对于发表一定数量论文(如几十篇以上)的作者来说，如果他引率高过95%，可能说明其工作的系统性不够好，如果他引率低于50%，可能说明其工作被别人认可度不高。
在“新”与“旧”之间取舍
这里要讨论的就是如何在开创性论文和目前渐进性论文之间做平衡和取舍。
时代久远的文章提供了概念的起源，会给创造概念、方法和分析的作者一定的信誉度。但从另一个角度来看，近期发表的论文则体现了这个领域内的研究兴趣。
这里要为大家提个醒：如果你选择的参考文献全部都发表于十年前，则意味着你想研究的课题已经被淘汰了。
论文的参考文献格式怎么写
在正文写作完毕后，空两行（宋体小四号）
1.连续出版物的格式 标引项顺序号 作者.题名[J].刊名，出版年份，卷号(期号)：起止页码. (外名可缩写，缩写后首字母大写，并省略缩写点) 2.专著的著录格式 标引项顺序号 作者.书名[M].版本(第一版不标注).出版地：出版者，出版年:起止页码. 3.论文集的著录格式 标引项顺序号 作者.题名[C].见(英文用In)：主编.论文集名.出版地：出版者，出版年:起止页码. 4.学位论文的著录格式 标引项顺序号 作者.题名[D].保存地点：保存单位，年份. 5.专利的著录格式 标引项顺序号 专利申请者.题名[P].国别 专利文专利号，发布日期. 6.技术标准的著录格式 标引项顺序号 起草责任者.标准代号 标准顺序号—发布年 标准名称[S].出版地：出版者，出版年. 7.报告 标引项顺序号 报告人.题名[R].会议名称，会址，年份.
参考文献一般是写论文中所有参考到的文献。那么，论文参考文献怎么写呢?下面我来教你写论文的参考文献。
论文参考文献标准格式
1.专著：[序号]作者.书名[M].版本(第1版不著录).出版地:出版者,出版年.起止页码.
2.期刊:[序号]作者.题名[J].刊名,年,卷(期):起止页码.
3.会议论文集(或汇编):[序号]作者.题名[A].编者.论文集名[C].出版地:出版者,出版年.起止页码.
4.学位论文:[序号]作者.题名[D].学位授予地址：学位授予单位，年份.
5.专利:[序号]专利申请者.专利题名[P].专利国别(或地区):专利号,出版日期.
6.科技报告:[序号]著者.报告题名[R].编号，出版地：出版者，出版年.起止页码.
7.标准:[序号]标准编号，标准名称[S].颁布日期.
8.报纸文章:[序号]作者.题名[N].报纸名，年-月-日(版次).
9.电子文献:[序号]主要责任者.电子文献题名[电子文献及载体类型标识].电子文献的出处或可获得地址，发表或更新日期/引用日期(任选).
10.各种未定义类型的文献:[序号]主要责任者.文献题名[Z].出版地：出版者，出版年.
选择参考文献时应该注意的因素
通读备选参考文献并掌握研究范围
在最终确定你需要的参考文献之前，务必摸透每一篇文献的精髓。在信息化尚未如今天这般发达之前，论文作者一般需要亲自前往图书馆翻阅装订厚厚的过刊，并搞到副本之后方能决定最终需要的参考文献，最痛苦的莫过于还得通读全文。
不过，现在在线数据库资源已经非常发达，我们可以通过很多软件或者平台(比如EndNote、RefWorks或者 Mendeley)将可能需要的参考文献直接下载到自己的账户当中即可。
但不幸的是，很多论文所选择的参考文献和作者所讨论的课题相关性不大，有时甚至不存在相关性，这种情况屡见不鲜。有一个早期的调查(Paper Trail Reveals References Go Unread by Citing Authors. DOI: )指出，论文作者真正通读过的参考文献数量只占所有参考文献数量的25%。
这种情况会对读者造成一定的不良影响，比如说，读了你的论文的人会误认为那些与你所讨论研究课题不相关的参考文献有参考价值，因此这些不具备针对性和相关性的参考文献就被引用到了下一篇文章当中。
好好的文献本来与你无冤无仇，不适当的引用的话，你就会成为始作俑者。
使用正确的`引用格式
确保参考文献信息的完整，要包括作者姓名、期刊名以及分页等。与文献的原始发行版本进行比对，以核对信息的准确性。如果数据库中原版信息条目有误且被引用之后，这些错误信息就会像病毒一样扩散。
常见的引文格式有APA、CELL、Chicago、Harvard、MLA、Nature以及Science。下面我们就同一篇文章，列举出这七种引文格式。为了阅读便利，我选了一个较短的文章标题。
论文题目：Graphene as a new sorbent in analytical chemistry
APA格式
Sitko, R., Zawisza, B., & Malicka, E. (2013). Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 51, 33–43.
CELL格式
Sitko, R., Zawisza, B., and Malicka, E. (2013). Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51, 33–43.
Chicago格式
Sitko, Rafal, Beata Zawisza, and Ewa Malicka. 2013. “Graphene as a New Sorbent in Analytical Chemistry.” TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51 (November): 33–43. doi:.
Harvard格式
Sitko, R., Zawisza, B., Malicka, E., 2013. Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51, 33–43. doi:
MLA格式
Sitko, Rafal, Beata Zawisza, and Ewa Malicka. “Graphene as a New Sorbent in Analytical Chemistry.” TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51 (2013): 33–43. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. Web.
Nature格式
, R., Zawisza, B. & Malicka, E. Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 51, 33–43 (2013).
Science格式
1. R. Sitko, B. Zawisza, E. Malicka, Graphene as a new sorbent in analytical chemistry. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 51, 33–43 (2013).
自引的管理
要在一定程度上限制引用自己发表论文作为参考文献的数量。我们心里都非常清楚自己的文章被引用的重要性，因为以前发表的文献提供的信息包括早期发现、实验程序以及与目前工作相关的分析。自引也可以帮助期刊的编辑、审稿人以及读者确定你目前发表的研究结果不仅仅是前期工作的增量推进。
但是作者自己发表的论文不应该占据所有参考文献的支配地位，将自引数量保持在20%至25%以下是比较理想的程度。自引使用过渡的话，你对h指数的功利心便昭然若揭。
比如一位教授的论文引用情况为，共发表了30多篇SCI论文，共被引用为455次，其中他引达432次，也就是自引为23次，他引率超过95%!应该说这个他引率很高。显然,过高的自引率不好，但是，过高的他引率就一定好吗?
高他引率可表示所开展研究工作受到关注或认可度较大，但同时也可能表示其研究工作的离散性大或系统性差。
因此，他引率可能并不是越高越好，至于多高的他引率才比较好，这可能与发表文章的数量和研究内容有关，难以定量推算，但从感性上说，对于发表一定数量论文(如几十篇以上)的作者来说，如果他引率高过95%，可能说明其工作的系统性不够好，如果他引率低于50%，可能说明其工作被别人认可度不高。
在“新”与“旧”之间取舍
这里要讨论的就是如何在开创性论文和目前渐进性论文之间做平衡和取舍。
时代久远的文章提供了概念的起源，会给创造概念、方法和分析的作者一定的信誉度。但从另一个角度来看，近期发表的论文则体现了这个领域内的研究兴趣。
这里要为大家提个醒：如果你选择的参考文献全部都发表于十年前，则意味着你想研究的课题已经被淘汰了。
德佑二年二月十九日，我受任右丞相兼枢密使，统率全国各路兵马。当时元兵已经逼近都城北门外，交战、防守、转移都来不及做了。满朝大小官员会集在左丞相吴坚家里，都不知道该怎么办。正当双方使者的车辆往来频繁，元军邀约宋朝主持国事的人前去相见，大家认为我去一趟就可以解除祸患。国事到了这种地步，我不能顾惜自己了；料想元方也还可以用言词打动的。当初，使者奉命往来，并没有被扣留在北方的，我就更想察看一下元方的虚实，回来谋求救国的计策。于是，辞去右丞相职位，第二天，以资政殿学士的身份前往。刚到元营时，据理抗争，言词激昂慷慨，元军上下都很惊慌震动，他们也未敢立即轻视我国。可不幸的是，吕师孟早就同我结怨，贾余庆又紧跟着媚敌献计，于是我被拘留不能回国，国事就不可收拾了。我自料不能脱身，就径直上前痛骂元军统帅不守信用，揭露吕师孟叔侄的叛国行径，只要求死，不再考虑个人的利害。元军虽然表面尊敬，其实却很愤怒，两个重要头目名义上是到宾馆来陪伴，夜晚就派兵包围我的住所，我就不能回国了。不久，贾余庆等以祈请使的身份到元京大都去，元军驱使我一同前往，但不列入使者的名单。我按理应当自杀，然而仍然含恨忍辱地前去。正如古人所说：“将要有所作为啊！”到了京口，得到机会逃奔到真州，我立即把元方的虚实情况告诉淮东、淮西两位制置使，相约他们联兵讨元。复兴宋朝的机会，大概就在此一举了。留住了两天，驻守维扬的统帅竟下了逐客令。不得已，只能改变姓名，隐蔽踪迹，奔走草野，宿于露天，日日为躲避元军的骑兵出没在淮河一带。困窘饥饿，无依无靠，元军悬赏追捕得又很紧急，天高地远，号呼不应。后来得到一条船，避开元军占据的沙洲，逃出江口以北的海面，然后渡过扬子江口，进入苏州洋，展转在四明、天台等地，最后到达永嘉。唉！我到达死亡的境地不知有多少次了！痛骂元军统帅该当死；辱骂叛国贼该当死；与元军头目相处二十天，争论是非曲直，多次该当死；离开京口，带着匕首以防意外，几次想要自杀死；经过元军兵舰停泊的地方十多里，被巡逻船只搜寻，几乎投江喂鱼而死；真州守将把我逐出城门外，几乎彷徨而死；到扬州，路过瓜洲扬子桥，假使遇上元军哨兵，也不会不死；扬州城下，进退两难，几乎等于送死；坐在桂公塘的土围中，元军数千骑兵从门前经过，几乎落到敌人手中而死；在贾家庄几乎被巡察兵凌辱逼迫死；夜晚奔向高邮，迷失道路，几乎陷入沼泽而死；天亮时，到竹林中躲避哨兵，巡逻的骑兵有好几十，几乎无处逃避而死；到了高邮，制置使官署的通缉令下达，几乎被捕而死；经过城子河，在乱尸中出入，我乘的船和敌方哨船一前一后行进，几乎不期而遇被杀死；到海陵，往高沙，常担心无罪而死；经过海安、如皋，总计三百里，元兵与盗贼往来其间，没有一天不可能死；到通州，几乎由于不被收留而死；靠了一条小船渡过惊涛骇浪，实在无可奈何，对于死本已置之度外了！唉！死和生，不过是昼夜之间的事罢了，死就死了，可是像我这样境界险恶，坏事层叠交错涌现，实在不是人世间所能忍受的。痛苦过去以后，再去追思当时的痛苦，那是何等的悲痛啊！我在患难中，有时用诗记述个人的遭遇，现在还保存着那些底稿，不忍心废弃，在逃亡路上亲手抄录。现在将出使元营，被扣留在北门外的，作为一卷；从北门外出发，经过吴门、毗陵，渡过瓜洲，又回到京口的，作为一卷；逃出京口，奔往真州、扬州、高邮、泰州、通州的，作为一卷；从海路到永嘉、来三山的，作为一卷。我将把这诗稿收藏在家中，使后来的人读了它，为我的志向而悲叹。唉！我能死里逃生算是幸运了，可幸运地活下来要干什么呢？要求做一个忠臣，国君受到侮辱，做臣子的即使死了也还是有罪的；要求做一个孝子，用父母留给自己的身体去冒险，即使死了也有罪责。将向国君请罪，国君不答应；向母亲请罪，母亲不答应；我只好向祖先的坟墓请罪。人活着不能拯救国难，死后还要变成恶鬼去杀贼，这就是义；依靠上天的神灵、祖宗的福泽，修整武备，跟随国君出征，做为先锋，洗雪朝廷的耻辱，恢复开国皇帝的事业，也就是古人所说的：“誓不与贼共存”，“恭敬谨慎地竭尽全力，直到死了方休”，这也是义。唉！像我这样的人，将是无处不是可以死的地方了。以前，假使我丧身在荒野里，我虽然正大光明问心无愧，但也不能掩饰自己对国君、对父母的过错，国君和父母会怎么讲我呢？实在料不到我终于返回宋朝，重整衣冠，又见到皇帝，即使立刻死在故国的土地上，我还有什么遗憾呢！还有什么遗憾呢！这一年夏天五月，改年号为景炎，庐陵文天祥为自己的诗集作序，诗集名《指南录》
这个的话应该很简单，你就让自己做都可以了，你要自己多的话你就可以变聪明了
你好，比特币是一种点对点的电子现金，其他
比特币它最基本的功能就是没有中间机构的 P2P ，或者说的更专业一点，比特币就是一个去中心化的 P2P。
收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；3.中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA （单位下同）+ TDZ ；MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达；适宜的生根培养基为MS + 6-BA + NAA ，生根率达，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1( of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA ; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA +TDZ + NAA ; using MS + 6-BA + TDZ + NAA asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA +NAA , the rate of rooting could reach , and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1): Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 升汞5min、2%次氯酸钠 + 升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用升汞处理10min 进行外植体消毒。 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，～μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/ 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况升汞10min 30 5 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 20%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞5min 30 10 3%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞10min 30 5 7%有药害第1 期 王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（）的分化促进作用较高浓度（）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当 时, NAA 促分化作用显著优于。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA + NAA 培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 参考[2]3 5 0 0 0 0 参考[3]4 3 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 012 0 0 0 参考[8]13 0 0 0 0 0 1 0 8 0 0 0 5 0 0 表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 30 ++18 30 ++19 30 ++20 30 ++21 30 ++22 30 ++23 30 ++24 30 +25 30 ++26 30 +27 30 ++28 30 +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 30 19 +30 0 30 21 ++31 30 20 +++32 30 16 ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA + ZDT + NAA 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA + TDZ NAA 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA + NAA 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. 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再前几天看视频的时候，偶然看到这样的一个视频，有一个人有三根牙签，提起了一杯水，自己也想来试一下。说做就做，准备三根牙签，然后再准备一根绳子，和一瓶水。（用杯子接满水也可以哦⊙∀⊙！） 首先，把绳子系在杯子上；然后，把一根牙签，竖着放在桌子上，但是一半在桌子上，一半没在桌子上。在把系在杯子上的绳子沿着桌边挂在牙签上（注意，一定要扶好哦！），然后拿一根牙签，竖立着顶在，牙签的最后（往前一点也可以哦），最后拿剩下的一根牙签，用两个尖横着扎在绳子上，第二根牙签要顶在第三根牙签的中间，然后就好了可以松手了，成功了，感觉很神奇！ 我又有了一个疑问，这是为什么呢？是什么原理呢？ 打开度娘，搜索。 …… 原来，它的原理正是上个学期，科学课上学的杠杆原理。而它的实验原理就是：绳子挤压第二根牙签，产生摩擦力，且挂水瓶越多，压力越大，摩擦力越大，使第二根牙签不易移动，给第三根牙签支持力；所以三根牙签能提起一瓶水。 那么三根牙签究竟能成多大的重量呢？我又接了一瓶水，准备这次挂两瓶水，开始试验。步骤也是那样，不过这次的更重，一不小心就会把牙签弄断，我得更加小心才是。第一步、第二步、第三步、第四步、第五步。 三、二、一，放手。成功啦！没想到这三根细细的牙签，竟然能承受这么大的重量，太神奇了。 你也快来试试吧！
植物组织培养及其应用研究概况在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤1．1概念植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。1．2原理 植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。 不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。 用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。1．3试验步骤1．3．1选择和配制培养基 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。 ．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。1．3．5试管苗驯化移栽 试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。2 植物组织培养的应用2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。2．2植物花药培养和单倍体育种 将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。2．3植物胚胎培养杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。2．5细胞融合与原生质体培养自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。2．6植物细胞突变体筛选植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。2．7植物体细胞胚胎和人工种子1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。 3 展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。黑龙江农业科学2006，(3)