不容易。国内各大学会、协会、组织机构通过科技工作者推荐、专家评议、结果公示等过程，分为T1级、T2级和T3级三个级别。T1类表示已经接近或具备国际一流期刊，T2类是指国际知名期刊，T3类指业内认可的较高水平期刊。定分级目录的主要目标是推动高质量中国科技期刊与国外高水平期刊在科技评价中等效使用，也就是目标中提到的吸引高水平论文在中国科技期刊首发，换句话说，假如沿用这种标准，发表在国外期刊和国内期刊的认同度相同，自然会带动国内期刊质量提升。
为推动学校“双一流”建设，提高我校师生学术论文水平，推进学校内涵式发展，进一步体现质量导向，依据ISI web ofscience 收录的SCI期刊、EI收录的期刊以及中国科技论文期刊目录，中文核心期刊目录等，学校决定按期刊影响力，将学术期刊分为TO、T1、T2、T3、T4五类。(一）TO类期刊1. ISI web of science 收录的影响因子大于10的SCI期刊。2.对于无影响因子大于10 的SCI期刊的一级学科可申报1个代表本学科国际顶级水平的SCI期刊至TO类。(二）T1类期刊1.依据ISI web of science收录的SCI期刊和中国科学院文献情报中心的期刊分区，大类分区1区的期刊。2.各一级学科可调整1～2个本学科标志性的SCI期刊至T1类。3.《中国科学》系列期刊（英文版）。4.《科学通报》（英文版）。(三）T2类期刊1.依据ISI web of science 收录的SCI期刊和中国科学院文献情报中心的期刊分区，大类分区2区的期刊。2.《中国科学》系列期刊(中文版)。3.《科学通报》（中文版）。4.计算机科学与技术、软件工程学科可调整1～2个代表本学科国际顶级水平的会议论文至T2类。(四）T3类期刊1.依据ISI web of science收录的SCI 期刊和中国科学院文献情报中心的期刊分区，大类分区3区的期刊。2.各一级学科可调整1～2个代表本学科国内顶级水平的国内一级学会期刊至T3类。3.《中国石油大学学报（自然科学版）》。(五）T4类期刊1.依据ISI web of science收录的其它SCI 期刊。2.EI收录的其它期刊。3.各一级学科可调整1～2个本学科标志性的中文核心期刊至T4类。
T1类表示已经接近或具备国际一流期刊。各院校对于期刊的分级，层次略有不同，以地大举例：依据ISI web of science收录的SCI、SSCI、A&HCI期刊、EI收录论文以及中国科技论文收刊目录，按科技论文影响力，将我校学术期刊论文分为T1、T2、T3、T4、T5、T6六类。
期刊的分类
可以分为非正式期刊和正式期刊两种。非正式期刊是指通过行政部门审核领取“内部报刊准印证”作为行业内部交流的期刊(一般只限行业内交流不公开发行)，但也是合法期刊的一种，一般正式期刊都经历过非正式期刊过程。
正式期刊是由国家新闻出版署与国家科委在商定的数额内审批，并编入“国内统一刊号”，办刊申请比较严格，要有一定的办刊实力，正式期刊有独立的办刊方针。
顶级期刊，专业最高水平
不容易。国内各大学会、协会、组织机构通过科技工作者推荐、专家评议、结果公示等过程，分为T1级、T2级和T3级三个级别。T1类表示已经接近或具备国际一流期刊，T2类是指国际知名期刊，T3类指业内认可的较高水平期刊。定分级目录的主要目标是推动高质量中国科技期刊与国外高水平期刊在科技评价中等效使用，也就是目标中提到的吸引高水平论文在中国科技期刊首发，换句话说，假如沿用这种标准，发表在国外期刊和国内期刊的认同度相同，自然会带动国内期刊质量提升。
中医类论文核心期刊有：中华医学杂志、第四军医大学学报、第三军医大学学报等等。1、中华医学杂志：杂志编辑委员会由生物医学领域的学科带头人组成，一般两个月内回复，加上审稿时间，周期较长。2、第四军医大学学报：改为《医学争鸣》，双月刊，由第四军医大学主办，主要发表具有一定理论见解和研究水平的学术论文、3、第三军医大学学报：经中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准，由第三军医大学主管、主办。
医学期刊常规来说只分为 SCI 核心期刊 和普通期刊。但是有一些省份会自己把期刊划分为一类二类三类，比如浙江省，一类期刊是国家级的核心期刊，二类的是除国家级核心期刊之外的其它核心期刊，三类的就是普通期刊。我看到：通知：部分论文取消、条件放宽。查阅各省最新职称政策可搜：全国论文办郑州郑密路20号办（原18号。在百度、360、搜狗58-68页。下同）、高级职称论文全国办郑州郑密路20号办。搜：高级职称（高级经济师、农经师、会计师、审计师、统计师、政工师、工程师、人力资源管理师、教师）论文（论文选题、论文范文、论文辅导、报考条件、评审条件、考试科目）郑州郑密路20号全国办、中国职称大学郑州郑密路20号全国办等。即 搜：高级经济师论文郑州郑密路20号全国办、高级经济师论文选题郑州郑密路20号全国办、高级经济师论文范文郑州郑密路20号全国办、高级经济师论文辅导郑州郑密路20号全国办、高级经济师报考条件郑州郑密路20号全国办、高级经济师评审条件郑州郑密路20号全国办、高级经济师考试科目郑州郑密路20号全国办。后面把“高级经济师”依次换成“高级会计师、高级农经师、高级审计师、高级统计师、高级政工师、高级工程师、高级教师、高级人力资源管理师等”再搜索。，还有河南、陕西、四川 等地也把期刊分为A类B类或者一类二类，也有的是一类为中文核心或者中华牌，二类为科技核心
中医杂志，时珍国药，北京中医药杂志等
学术堂为大家推荐几本中医类的核心期刊,供大家参考:1、《中国中西医结合杂志》刊物简介:主要宣传党的中医政策和中西医结合方针,报道我国中西医结合在临床、科研、教学等方面的经验和成果.级别:本刊为科技核心(2018自然科学), 中文核心(2017年版), RCCSE(A+)(2017-2018), CSCD核心(2019-2020)2、《中华中医药杂志》刊物简介:是中国科协所属的自然科技期刊中反映中医药学术进展的中医药学科杂志.级别:科技核心(2018自然科学), 中文核心(2017年版), RCCSE(A)(2017-2018), CSCD扩展(2019-2020), 梯队期刊(2019)3、《中药新药与临床药理》级别:科技核心(2018自然科学), 中文核心(2017年版), RCCSE(A-)(2017-2018), CSCD核心(2019-2020)刊物简介:全面报道中药新药、中医药的研究进展与成果,并为医药卫生行政部门以及中药新药研究、生产、应用单位提供信息和交流园地,是中药研究、中药临床药理学科进行国内外学术成果交流的重要窗口.
属于遗传性疾病。症状：身体消瘦，心率不稳，急躁情绪……要用神经治疗方法，用神经性药物治疗。天津总医院 有这样的治疗方法，很完善！
农杆菌转换法，基因枪法，花粉管通道法
1．1用基因枪法获得的转基因小麦 1992年对利用现代生物技术改良小麦而言是具有历史意义的一年。Vasil等以长期培养的胚性愈伤组织为外植体，通过基因枪将GUS/Bar基因导入小麦品种“Pavon”，获得对除草剂Basta具有抗性再生植株(T0)及其后一下（T1），从而宣告世界上第一株转基因小麦问世。一年后，同一研究组又对基因方法进行了优化，以未成熟胚及其愈伤组织为外植体，在3个小麦基因型(Pavon、Bobwhite和RH770019)上获得成功，并且将获得转基因小麦植株的时间由15个月缩短至7-9个月。在这一年，Weeks等也报道以品种“Bobwhite”的未成熟胚为外植体通过基因枪法获得转基因小麦植株。两个独立的实验室用同一品种(Bobwhite)的相同组织（未成熟胚）和相同的方法（基因枪法）都得到相同或相似的结果（获得转基因植株），表明所用的转基因方法是可靠的。此后，以未成熟胚（或称为“幼胚”）及其衍生物为外植体，通过基因枪法获得转基因小麦的报道与日俱增，已经成为迄今为止小麦基因转导的主要方法。值得一提的是，以小麦胚顶端分生组织、营养体顶端分生组织和花序分生组织为目标，用“手持式”基因枪射击也获得外源基因的瞬时表达和转基因植株。这一方法能绕过全能性细胞数量的问题，在小麦基因转导上具有一定的潜力。 1．2用花粉管通道法获得的转基因小麦 利用花粉管通道法转导小麦的工作主要集中在前5年（1990-1995），而且主要集中在我国。周文麟等报道，将C4作物的DNA通过花粉管导入春小麦，获得具有C4若干性状的转“基因”小麦及其后代。成卓敏等称获得转小麦黄矮病毒CP基因的小麦，曾君祉等刘根齐等也报道了花粉管通道法转基因小麦的获得。遗憾的是，当时这些报道都缺乏外源基因（或DNA）在转基因小麦植株及其后代中整全和表达的分子生物学证据。最近，Zeng（曾君祉）和Wu等对1990-1994期间通过花粉管通道法获得的转基因小麦的后代进行了外源“基因”表达的分析，包括分子生物学方法的分析，证明了外源基因的整合和表达，从而证明通过花粉管通道法可以获得转基因小麦。周文麟、倪建福等（个人通信）用我们构建的eMS/Bar嵌合基因转导小麦，获得具有除草剂抗性和雄性不育性状的植株，其后代仍然表现出对除草剂的抗性。花粉管通道法避免了复杂的组织培养、植株再生过程，在小麦上是很有潜力的基因转导方法。 1．3其它直接法获得的转基因小麦 其它直接法，如显微注射、激光微束穿刺、PEG介导和电激等对小麦的转化近乎无效。尽管已经有众多的研究证明外源基因在用这些直接法处理后的原生质体和细胞中能瞬时表达乃至能在产生的愈伤组织中的稳定表达，但获得转基因小麦植株的报道仅有一例。He等以品种“Hartog”的原生质体为受体，通过电激法获得具有除草剂（PPT）抗性的绿色转基因植株，但这些植株未能结籽。小麦原生质体或单细胞植株再生的困难可能是电激法、PEG法和显微注射法等直接法在小麦转基因上失败的主要原因。正是由于这些困难，使以原生质体或单细胞为受体的直接法在小麦基因转导上的前景变得十分黯淡。 1．4农杆菌介导法获得的转基因小麦 自1983年第一株农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转基因植株问世一来，农杆菌介导法很快就成为双子叶植物基因转导的主导方法。这一方法操作容易、成本低、转化效率高、单拷贝基因整合率高而且外源基因在转基因植株后代中比较稳定。能否将这一方法引入包括小麦在内的单子叶植物的基因转导成为90年代前后讨论与研究的热点。当时，一种倾向性的观点是认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌介导转化单子叶植物几乎不可能或没有可能性。这种观点的代表人物是曾在小麦等禾谷类作物组织培养与基因枪转导方面卓有建树的瑞士科学家Potrykus，他在国际权威杂志“Bio/Technology”和“Nature”都发表了他的悲观论点。农杆菌介导的石刁柏转基因植株的获得，特别是农杆菌介导的转基因水稻和转基因玉米的获得，不仅改变了单子叶植物不是农杆菌的天然寄主的看法，而且证明农杆菌介导法完全可以用于禾谷类作物的遗传转化。 在小麦上，虽然有人早在1988年就证明农杆菌能侵染并进行遗传转化，随后又有人证明农杆菌能附着到经部分酶解和未酶解的小麦幼胚细胞，但多年来一直没有得到转基因植株。Hess等报道，直接将农杆菌接种到小穗获得具有抗生素性和经Southern Blot杂交证明的转基因当代植株，外源基因部分在F1和F2中却未能检测到外源基因的存在。在人工授粉后再用携带有共合载体（pCV2260和pSIR42）的农杆菌（株系C158）处理雌蕊，Pukhal’skii获得经过PCR和Southern Blot杂交证明的F1植株，并由此获得具有外源基因的F2植株。这种简单的基因转化方法，结合了花粉通道与农杆菌侵染的优势，如果能够被其它实验室所证实，将在小麦等的基因转化上发挥主导作用。 在农杆菌介导小麦基因转导方面，Cheng等于1997打破了十几年的沉默，首次获得的正常的转基因小麦植株。2年后，我国科学工作者夏光敏等报道获得农杆菌介导的转基因小麦植株，笔者的研究组也同样成功地获得农杆菌介导的转基因小麦植株(待发表)。这种成功意味着，小麦也能象双子叶植物一样享受农杆菌介导基因转化的所有优点。 结合农杆菌介导与基因枪法的“Agrolistic”法，或通过微弹造成的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移，或把分别携带有 VirDl、VirD2和T-DNA的边界序列加外源片段的三个质粒导入受体，通过VirDl和VirD2在受体中的正常表达促使外源目标片段采用T-DNA边界序列以较低的拷贝数插入受体的基因组中，已经在小麦的基因转化上崭露头角。超声波辅助的农杆菌介导法(Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ，SAAT)通过超声波在受体细胞上产生的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移，使外源基因在小麦受体细胞的瞬时表达强度相对纯农杆菌法增加至少100倍。Singh和Chawla和Serik等还利用碳化硅纤维(silicon carbide fibeers)来辅助农杆菌转基因。此外，还有结合农杆菌与病毒的“Agroinfection ”法等。这些方法目前虽然还不成熟，但在小麦基因转导方面具有很大的潜力。 2、小麦基因转化的受体 作为基因转化的受体取决于所用的转基因方法，而受体操作的难易程度又决定了转基因方法的成败。 小麦胚性悬浮细胞及其分离出的原生质体多用作电激法、PEG法和显微注射法等直接转基因法的受体。正是由于原生质体和悬浮细胞再生植株的困难，使电激法等直接法在小麦的基因转化方面没有多少“用武之地”。小麦的胚性愈伤组织，特别是幼胚及其愈伤组织和幼胚盾片及其愈伤组织具有较强的植株再生能力 (有人认为它们具有较大比例的全能性细胞)，无论作为基因枪法的受体还是作为农杆菌介导法的受体都能再生出转基因植株，从而成为迄今为止小麦基因转化的主要受体，同时也使基因枪法成为目前小麦的主要转基因方法，也有可能使农杆菌介导法成为今后小麦基因转化的主要方法。笔者研究组近年的实验结果 (待发表)表明，小麦花药愈伤组织的再生能力很强，经基因枪轰击后比较容易获得转基因植株，因而也是小麦转基因的良好受体。小麦的各种分生组织作为“手持式”基因枪的受体具有较大的利用潜力，但这一潜力的发挥还有待这种基因枪本身的完善和经济可利用性。雌蕊，作为花粉管通道法及农杆菌一花粉通道法的唯一受体，随着这些转基因方法的完善将在小麦转基因方面发挥越来越重要的作用，有可能发挥主导作用。小孢子、花粉、大孢子和叶基作为小麦转基因的受体可能得到进一步的开发，但在不久的将来，不可能成为主要受体。幼穗可能是进行小麦基因转化一个很好的受体。陈梁鸿在比较幼穗和幼胚为受体的转化试验中观察到，幼穗的转化效果优于幼胚。 3、小麦基因转化的目标基因和选择 标志基因到目前为止，在双子叶植物基因转化中常用的选择基因和报告基因仍然多作为小麦遗传转化的目标基因兼选择基因，这些基因主要有报告基因类的GUS、CAT和LUC;抗抗生素类的NptII、Hpt和抗除草剂类的Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX。这些基因在小麦上利用主要是为了建立有效的遗传转化系统。随着小麦遗传转化体系的建立和完善，旨在改良小麦性状的真正的目标基因的利用不断增多。迄今为止，已经导入小麦并在转基因植株中得到表达的目标基因主要有：①改良小麦加工品质方面的基因：高分子量谷蛋白亚基(HMW Glutenin subunit)基因lAxl、lDx5和lDxl0和重组高分子量谷蛋白亚基基因。②抗病基因：病毒外壳蛋白基因(Coat protein genes，CP)、类萌芽素蛋白(germin-like proteins，GLPs)基因、水稻thaumatin-like 蛋白基因TLP、藜芦醇合成酶(stilbene synthase )基因、大麦种子核糖滞活蛋白（ribosom-inactivating protein，RIP）基因和玉米Ds转座子; ③嵌合雄性不育类基因：核糖核酸酶类基因Barnase、细胞骨架蛋白基因等;④抗除草剂类基因：Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX。 在双子叶植物上广泛作为选择基因的抗抗生素类基因，如NptII和Hpt等，在小麦转基因上应用较少。其主要原因有两个:第一是小麦对Kan具有较高的天然抗性，第二是,人们对小麦含抗生素基因的安全性的忧虑。到目前为止，在转基因小麦中应用得最多的选择基因是抗除草剂基因Bar。 报告基因GUS、CAT和LUC曾为小麦基因转化体系的建立作出重大贡献。但在小麦转基因体系基本成熟的今天，人们已经开始寻求其它的基因以代替上述单纯的报告基因或者根本不再利用报告基因。值得一提的是外观可见报告基因(visual marker)。McCormac等和Mentewab等用花色素苷生物合成促进基因(anthocyanin biosynthesis stimulatory genes)，如Cl/Lc，作为报告基因，通过对转化受体及其细胞的颜色来选择转化子。这是一种具有广泛应用价值的报告基因。另外，合成的绿色荧光蛋白基因(SGFP-S65T)也已用于报告小麦的基因转化。 4、外源基因在转基因小麦中的表达与表达分析 广泛应用于在转基因植物中组成型表达外源基因的启动子CaMV 35s在谷物类中的作用较弱。为了增强外源基因在转基因小麦中的表达，人们或利用双CaMV35s序列，或加入单子叶植物基因的插入子(如玉米Adhl基因的插入子)，或转而利用单子叶植物基因的启动子，如水稻的Actl基因的启动子和玉米Ubil基因的启动子。Actl和Ubil启动子是目前在小麦转基因中应用最普遍的组成型启动子。另外，人工重组的组成型启动子pEmuGN启动外源基因在转基因小麦等的表达强度比CaMV35s高至少10倍。这类重组启动子在小麦遗传转化上将大有作为。 组织和/或器官特异性表达启动子的应用在小麦转基因上是一个巨大的进步。特别值得一提的是花药花粉特异性启动子的利用。De Block等以水稻花药绒毡层特异性启动子ca驱动核糖核酸酶基因Barnse在转基因小麦中表达，从而在世界上创造出第一株基因工程雄性不育小麦。笔者的研究组利用烟草花药绒毡层特异性启动子TA29也创造出基因工程雄性不育小麦。基因工程雄性不育小麦的完善与配套，将彻底改变目前杂交小麦制种难的状况。另外，化学诱导性启动子在转基因小麦上也具有巨大的应用潜力。 近年来，对外源基因在转基因小麦上的整合、表达方式已经有一定的研究，包括分子方面的研究。一般认为，外源基因在转基因小麦上的整合方式与所用的转基因方法有关，但无论是用基因枪还是农杆菌介导法，低拷贝与简单的整合仍然是占优势的整合方式；导入基因的遗传在大多数转基因系法后代中呈孟德尔遗传。Bieri等的实验证明，与MARs(matrix-associated regions)的目标基因(RIP)在转基因小麦的后4代仍然非常稳定，但Alvarez等观察到在T2代有极少数植株丧失了整合的外源基因。据Uze等报道，外源基因无论以单链还是双链，无论是以线形还是以环形，都可以整合到小麦的基因组，但线形基因的转化效率更高。Zupan等观察到，农杆菌VirE2蛋白能在转基因植物细胞中协调细胞核吸取单链DNA。Srivastava等报道了“位点特异性重组” (site-specific recombination)方法，他们利用这一方法成功地将4个4拷贝插入基因位点转化成单拷贝基因。 此外，Pederson等还利用荧光原位杂交(FlSH)研究了基因枪法导入的基因在转基因小麦染色体上定位。他们观察到，同一品种 (Florida)的不同转基因株系，外源基因的插入位点不同，例如，一个株系的插入点在染色体6B，而另一株系的插入点在染色体2A。这类研究的深入，将有助于了解插入基因的“位置效应”，从而更好地了解外源基因在转基因小麦中的表达及其稳定性。 5、小麦基因转化存在的主要问题 尽管转基因小麦的研究近年来进展很快，但与双子叶植物相比，甚至与同为谷物类的水稻和玉米相比，仍然有较大的差距。最明显的差距是，转基因双子叶作物已经有几十个种类的120多个品种已经用于生产实践或已经被批准进入大田实验，转基因水稻和玉米有若干品种也已经用于生产实践，而转基因小麦基本还处在建立和优化转基因体系阶段。笔者认为，造成这种差异的主要原因或在小麦转基因方面存在如下的问题： 第一，也是最主要的，小麦组织培养技术问题。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性很强的问题是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的瓶颈。植株再生性强的小麦品种，如Bobwhite等，无论用基因枪法还是农杆菌法都己经得到转基因植株，而再生性差的品种则用基因枪也无法得到转基因植株。也正是由于品种的再生问题，使全世界的转基因小麦都集中在少数几个基因型，而这些基因型又并非生产实践所需要的或在生产实践中的应用很有限。 第二，基因转化的受体比较单一。未成熟胚及其衍生物是小麦转基因的主导受体，而在世界发展中国家，有条件周年提供小麦未成熟胚者寥寥无几。 第三，过份依獭基因枪法。目前转基因小麦90%以上是用基因枪法获得的，而基因枪法转基因的缺点在双子叶植物上已经表现得很明显，在此毋须多言。其实，这两个原因在本质上是由第一个原因所引起的。另外，基因枪昂贵的价格也是附带因素。 第四，对农杆菌转化单子叶植物，特别是转化小麦的机理缺乏系统而深入的研究。目前人们已经认识到，不同种类的农杆菌对同一种单子叶植物的侵染能力不同，甚至同一菌株在不同的培养条件下侵染能力也有明显差异。而包括小麦在内的一些单子叶植物本身也存在着一些不利于农杆菌侵染的因素，如，细胞壁的果胶多糖的高度酯化而缺乏农杆菌的附着位点;分泌的愈伤诱导物少或缺乏或与双子叶植物存在明显的差异，不利于农杆菌的转化等。正是由于这些了解，人们通过选用适宜的农杆菌菌株和植物表达载体、提高侵染时农杆菌的浓度和延长侵染时间、在共培养时加入vir基因活化剂 (如AS，OH-AS，双子叶植物伤流等)以及选用合适的受体基因型、外植体和培养基等，使农杆菌转化小麦有了重大突破，成功地获得转基因植株。 第五，小麦本身为异源6倍体，基因组较大而复杂，导入的外源基因的沉默与修饰更为严重。 第六，对转基因小麦分子生物学证据作用的过分依赖。这在某中意义上曾扼制了极有优势的花粉管通道法在小麦转基因上的应用。 6、转基因小麦的展望 随着小麦多种基因转化体系的建立或初步建立，小麦的转基因研究的进展在今后5年将会更快。但这种进展将以更高效的植株再生体系的建立和完善为基础。以基因枪为主体的转基因研究将转向以农杆菌介导法为主体转基因研究，这一研究将会优化或完善农杆菌介导的小麦转基因体系。同时，基因枪法转化小麦将从研究阶段进入应用阶段，因而将有少量转基因小麦品系或品种进入大田试验或作为品系、品种释放。花粉管通道法，特别是它与农杆菌结合的方法将被人们普遍接受并广泛用于小麦转基因的实践。各种辅助农杆菌介导的方法将走向成熟。抗抗生素基因作为选择基因将基本在小麦转基因上消失，代之而来的将是不同的抗除草剂基因、不同糖类和激素类基因。明显易见而又对小麦有益的报告基因，如花色素基因等将会得到较普遍的应用，因而转化子的选择效率将大为提高。更多的优良农业性状基因将被导入和表达，特别是提高面粉，营养价值、改良面粉加工性状的品质基因、提高植株抗病性的基因、提高植株抗旱性的基因和促进植株氮的有效利用基因。更高强度的启动子和组织、器官特异性启动子将会被普遍利用，化学剂可调控启动子也将在部分先进的实验室利用，象 “位点特异性重组”等单拷贝插入技术将更加完善并得到应用。基因工程雄性不育体系将会得到完善，并初步用于杂交种子的生产。抗除草剂基因也将用于控制杂种的纯度。另外，对外源基因的插入位点和插入方式将有比较清楚的了解，从而对外源基因的表达与沉默将有更清楚的了解。同时，反义基因技术将初步用于对小麦功能基因的研究。 或一、植物的遗传转化 20世纪70年代末80年代初，人们用野生型Ri和Ti质粒转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株后，以Ti质粒为载体的植物遗传转化技术随之被建立。近年来植物的遗传转化技术得到了迅速发展，建立了多种转化系统。按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类：以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术。 （一）载体法转化 农杆菌介导的转化是最主要的一种载体转化方法。利用经过改造的农杆菌Ti质粒为载体可以高效地转移外源基因。所获得的转化植物有两种基本方法：一种是1979年Marton等以植物原生质为受体的共培养法（ocultivation）；一种是1985年Horsch等人建立的叶盘法（leaf disc cocultivation）。 共培养法是把农杆菌与植物原生质体共同培养以实现转化的方法。其程序包括农杆菌对初生细胞壁的原生质体的转化、转化细胞的筛选和诱导转化细胞分化并再生植株。 叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。 农杆菌介导的遗传转化是大多数双子叶植物转化中常采用的方法，但由于农杆菌具有宿主局限性，极少能感染单子叶植物，特别是一些重要的农作物如水稻、小麦、玉米等对农杆菌不敏感，难于应用此法进行遗传转化。 除上述以Ti质粒为载体的基因转化外，还可以用脂质体（liposome）为载体进行遗传转化。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，因此可将DNA分子包装在脂质体内以避免受体细胞DNase的降解，把DNA分子导入到植物的原生质体中去。 （二）基因直接转移的方法 这是指既不依赖于农杆菌，也不依赖其他载体或媒介的一些基因转移方法。 1．电激和电注射法 电脉冲能改变细胞膜的透性。通过高压电脉冲的电激穿孔作用把外源DNA引入植物原生质体的方法就称为电激法（electroporation）。这种方法现已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物以及动物的基因转移，如20世纪80年代末用此法将新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因转入玉米自交系的原生质体，已再生成植株。 通过电激技术把基因直接引入完整的植物细胞或组织的方法，称作电注射（electroinjection）。这种方法可避免原生质体培养和再生成植株的繁杂操作与困难，因而具有巨大的应用潜力。 2．基因枪法 基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment）。这一方法是用粒子枪把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于此法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，转化率又高，被转化的细胞或组织容易再生成植株，因而颇受关注。 3．微注射法 微注射法（microinjection）是利用显微注射仪等，通过机械的方法将外源基因或DNA直接注入细胞核或细胞质。与其他方法相比，这个方法对外源遗传物质的导入更为直接和有效。 微注射法除用于植物细胞外，近些年还发展到用于直接注射植物子房，这样更有利于外源遗传物质对幼胚的转化。这方面的工作我国于20世纪70年代即已进行了理论与实践的探索，并已获得抗枯萎病的棉花转化植株抗虫棉等。 二、转基因动物技术及其应用 （一）转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenic animal）。转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。 （二）转基因动物技术 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。反转录病毒转移基因的基本方法在前面已有简介，这里只介绍显微注射法和胚胎干细胞法两种。 1．受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研究移核实验的基础上发展而来。20世纪80年代初期人们利用这一方法向动物生殖细胞转移外源基因，成功地建立了转基因小鼠。1985年转基因绵羊和转基因猪问世，以后转基因大鼠、兔、鸡、牛、鱼等都已陆续取得成功，可见显微注射法是迄今应用得较为普遍而又最有成效的一种获得转基因动物的技术。 本方法是在显微镜下，用直径约为1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。为了解转基因的整合情况，可酌情应用斑点杂交、多聚酶链式反应或Southern印迹杂交等方法对子代个体DNA进行检测。 显微注射法的优点是导入的外源基因片段可长达50 kb，且无需载体，外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高。其不足之处是外源基因的整合是随机的，因而难以控制其整合率；再者，对外源基因能否稳定整合于受体基因组的检测，必须等到子一代个体出生后经过选择才能确定，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。 2．胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期人们开始研究利用ES细胞获得转基因动物的方法。这个途径是将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引入的外源基因传递下去。 在以胚胎干细胞为媒介获得转基因动物的技术中，既可以用多种方法将外源基因导入ES细胞，且细胞的鉴定、筛选比较方便，又可预先在细胞水平上测定外源基因的拷贝数、定位和表达的水平以及插入的稳定性等，而且将ES细胞注入囊胚的操作较易进行，整合率相对较高。只是建立ES细胞系本身就是一项难度极高的工作，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。 （三）转基因动物的应用 转基因动物的研究内容非常广泛，20世纪80～90年代以来从基础理论到应用技术在深度和广度上都有了很大发展，并已日渐由实验室走向生产实践。 1．在基因表达调控研究方面的应用 利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”，下面仅就DNA顺式调控元件和基因在发育中的时空调节为例予以介绍。 （1）顺式调控元件的研究 异常的脂蛋白水平与动脉粥样硬化等疾病有关。人类有5种脂蛋白，各自含有不同的载脂蛋白。现已发现约有17种载脂蛋白，它们的编码基因已测序，是用于研究心血管疾病的候选基因。把载脂蛋白基因转入小鼠，可用来研究人脂蛋白代谢、调控以及动脉粥样硬化。在研究载脂蛋白基因组织特异性表达的顺式调控元件时，发现有两簇载脂蛋白基因凋节的组织特异性表达（图19-15）。一簇包括A－Ⅰ、C-Ⅲ和 A-Ⅳ基因，定位于人11号染色体长臂2区3带（11q23），是按A－Ⅰ、C－Ⅲ、A－Ⅳ的顺序组成。C－Ⅲ的转录方向与其他两个基因相反。 A-Ⅰ和C-Ⅲ主要在肝和小肠中表达，A-Ⅳ主要在小肠表达。在 C-Ⅲ基因的-0.2～-1.4bp之间是调节 A－Ⅰ基因在小肠中表达的区域。这个区域也是 C－Ⅲ和A－Ⅳ基因在小肠表达的凋控元件，表明这一元件可以调节整个载脂蛋白基因簇在小肠的表达。另一基因簇定位于19号染色体长臂1区3带（19q13），包含有E、C－Ⅰ和C-Ⅱ基因，它们按E、C－Ⅰ、C－Ⅱ顺序排列。E基因主要在肝脏和大部分身体组织中表达，但表达水平低。以后发现在C－Ⅰ基因和C－Ⅱ基因之间有
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