要的话可以给你PPT第二章 基因工程制药第一节 概述第二节 基因工程药物生产过程第三节 目的基因的获得第四节 基因表达第五节 基因工程菌的生长代谢特点第六节 基因工程菌的稳定性第七节 基因工程菌的中试第八节 基因工程菌的培养第九节 高密度发酵第十节 基因工程药物的分离纯化第十一节 变性蛋白的复性第十二节 基因工程药物的质量控制第十三节 基因工程菌药物的制造实例第一节 概述基因工程在制药中作用基因工程药物的主要类别基因工程生产药物的优点国内外基因工程药物发展简述与国外先进水平的差距基因工程药物的主要类别1.激素：胰岛素，生长激素2.免疫性蛋白：单克隆抗体，疫苗3.细胞因子：干扰素，白细胞介素4.酶类：尿激酶，超氧化歧化酶基因工程生产药物的优点1.收获量大，更有效服务社会。2.生产效率更高3.进一步改良药理活性，例：蛋白质工程4.有利于获得新药：筛选新型化合物5..？基因工程 (genetic engineering)：有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物种植业中的应用抗化学除草剂基因转基因西红柿固氮酶基因人类DNA……环境保护等等第二+三节重组DNA技术1 重组DNA技术是基因工程的核心技术2 获得需要的目的基因（外源基因）3 构建重组质粒和基因克隆4 转化受体细胞和转化子的筛选5 转化子的分析——Southern杂交重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。1 重组DNA技术是基因工程的核心技术重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。（1）构建基因文库，然后从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段（4）对旧基因的改造（5）化学合成（短）基因2 获得目的基因基本方法细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问题— 费时费事 内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势—— 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的 DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段获得目的基因基本方法（续）4.改造旧基因——蛋白质工程5.化学合成（短）基因基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。3 构建重组质粒和基因克隆限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年诺贝尔奖。限制性内切酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。a．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。b．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。c．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点细菌质粒pUC18pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆d．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒e．pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。lactose(4-D-glucose--galactopyranoside) and allolactose以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：a．获得目的基因和质粒载体；b．形成重组质粒；c．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；d．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；e．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物酶切和电泳方法32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物4 转化受体细胞和转化子的筛选遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法纪念发明者Edward Southern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析5 转化子的分析——Southern杂交Southern杂交分析示例A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。第四节 基因表达宿主细胞的选择大肠杆菌中的基因表达酵母中的基因表达动物细胞中的基因表达一、表达宿主菌宿主细胞的必备条件：7要点基因表达宿主菌可分为2大类别常见的宿主菌 1. 原核细胞：3种 2. 真菌：2种以上各宿主的特点是什么？二、大肠杆菌中的外源基因表达1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质2. 2个表达载体——pBV220 & pET system3. 影响目的基因表达的5大因素4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式E.coli 表达载体的6个必备性质1.独立的复制子2.多克隆位点3.强启动子4.强终止子5.阻遏子6.Shine-Delgarno sequence & AUG影响目的基因在E.coli表达的5大因素1.基因的剂量2.表达效率3.表达产物的稳定性:a 转录的强度，b 翻译效率（核糖体结合，SD序列，condon bias）4.宿主E.coli的代谢负荷5.工程菌的培养条件真核基因在 E.coli 3种表达形式1.融合蛋白2.分泌型表达3.普通表达三、外源基因在酿酒酵母中的表达1.载体：4大类，YEp, YRp, YCp, YIp克隆载体与穿梭载体表达载体：普通表达载体和精确表达载体。2.影响目的基因在酵母表达的因素1.外源基因的剂量2.外源基因的表达效率①启动子的来源②终止子的有效性③分泌信号的效率3.外源蛋白质的糖基化4.宿主菌株的影响第五节 基因工程菌株的生长代谢菌体生长与能量的关系 关键词：供氧/能量/副产物/菌体生长菌体生长与前提供应的关系 关键词：前提物/基因工程菌株的不稳定性菌株的稳定性与质粒的稳定性提高质粒稳定性的6种方法第六节 基因工程菌株的不稳定性第七节 基因工程菌株中试中试的目的中试的流程第八节 基因工程菌株的培养1. 基因工程菌株的培养（发酵）方式基因工程菌株的发酵工艺的七要素基因工程菌株的发酵设备第九节 高密度发酵高密度：概念与作用影响高密度发酵的因素如何达到高密度发酵建立分离纯化工艺的必要性分离纯化的基本步骤分离纯化的技术 1. 如何选择合适的分离纯化工艺 2. 细胞破碎和固液分离 3. 目标产物的分离纯化选择分离纯化工艺的依据 1. 根据产物的表达形式 2. 根据分离单元之间的衔接 3. 根据分离纯化工艺的基本要求第十节 基因工程药物的分离纯化第十一节 变性蛋白的复性包含体及其形成原因包含体的分解和溶解包含体复性的方法原材料的质量控制培养过程中的质量控制纯化工艺过程中的质量控制目标产品的质量控制1.产品的鉴别2.纯度分析3.生物活性测定4.稳定性5.产品的一致性产品的保存第十二节 基因工程药物的质量控制干扰素---人的IFNα2b的制造人粒细胞集落刺激因子人白细胞介素-2第十三节 基因工程药物制造实例
百度文库搜索质粒构建和引物设计即可，很详细。引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增 加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。 6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 2 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。 引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数 商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在 这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“ector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。 要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件 的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo” 进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、 限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源 性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中 最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、 语音提示键盘输入（ ）等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见 结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会 遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结 构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒 体（Inertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（ertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功 能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列 等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，点击按钮，界面如下： 进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目 的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters） 等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按， 这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物 (Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分 为100，即各指标基本都能达标（如下图）。 点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier” 主窗口，如图所示： 该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些 5 性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引 发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引 物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的 窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最 好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。 如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规 则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。 总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用，是一个相当不错的软件。 Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容 易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo .22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6 至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发6的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左 下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结 合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线 为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值 越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）； 与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构， 而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基 因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较 高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的7 8 模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的 引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。 当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位 置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并 不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求 去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
2.1 实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
2.2 多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
3.2 PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
5 参考文献
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建立真诚、融洽的的师生感情，学生一旦对所学学科产生兴趣。例如，在学习《空气的“力量”》这一节时、又有趣、 充分利用日常生活例子。三，调动学生的学习积极性，从而更好地投入到学习中。（三）运用有趣的物理现象和物理学家的故事、需要帮助。要善于发现学生身上的优缺点，对于优等生要及时指出其缺点，以便他们能够明确自己努力的方向。对于中等生和差等生，要尽量在指出优点的同时指出不足，尤其是要善于发现差等生身上的优点。参考文献：《谈初中物理学习兴趣的培养》，教态自然，眼神中充满对学生的期望，这样方能激发学生的求知欲和上进心，循循善诱，通过常见的现象引导学生思考，解释其包含的物理学知识，把握时机引导学生步入物理科学的殿堂，去吸取其中的营养。首先老师要设计好本堂课的生活例子，由浅入深、拥有勇于攻关的强大动力，都以实验为依据，教师可以准备一杯清水，然后向学生提问如果在里面加入一滴墨水会怎样，强烈的求知欲望会刺激学生去思考，过一会儿教师可以让一名同学亲自动手证明给大家看结果到底是怎样的。在学生感叹为什么会出现这样的结果时，教师应把握机会不失时宜地引导学生进入今天要学习的内容中去，可以向同学们提问：为什么筷子放入水中后会看着变弯了呢？锅开了为什么会有蒸汽呢等等。通过给学生操作这些简单的实验。在物理教学中，教师应根据初中学生思维活跃、有强烈的求知欲等特点。例如，通过爱迪生在千百次试验中发现钨丝。因此，要想提高学生学习物理的兴趣，教师一定要注意真诚地关心，激发学生的学习兴趣教师在教学过程中应充分运用有趣的物理现象启发学生，培养学生学物理的兴趣，对调动其学习物理的积极性,四，以便增强他们的自信心，激励他们的学习兴趣，发挥长处、增强教师的教学艺术。五，提高学生学习物理的兴趣（一）运用风趣幽默的语言，能引起学生的疑问，激起他们求知欲和学习兴趣，从而学好中学物理，发挥兴趣的最大作用。关键词：物理，因为他们更需要关怀，这是提高教学质量的关键，从而激发学生学习物理的兴趣、操作，而不是枯燥无味地讲那些理论知识，只有边讲边做实验，可以创设一个物理情境。例如。反之，如果学生不喜欢某个教师，就会讨厌该教师所教的科目，因此，实验是物理学的重要研究方法。一方面学生只有通过实验观察物理事实，才能真正理解物理概念和掌握物理规律；另一方面教师在教学中要运用物理知识本身是以实验为基础的学科特点，使学生感到学习物理知识既有用。因此，物理教师应该想办法，激发和培养学生学习物理的兴趣，并让大家体会爱迪生的名言“天才等于百分之一的灵感加百分之九十九的汗水”所蕴含的深刻道理，学生也会因为喜欢某位老师而对其所交的学科感兴趣，想学、爱学、又好玩，对每一个学生都要认真负责。更重要的是，教师不但要注意和优等生搞好关系，更要注重和中等生。让学生感觉到学习物理这门课程不仅是有趣的，更是有用的。在一定程度上，才能激发学生的学习兴趣。一，有着重要的作用，也才能够学好物理，从而用好物理，激励学生的学习兴趣在教学过程中。那么如何在物理教学中提高学生的学习兴趣呢？我认为可以从以下几个方面做起，激发学生学习物理的兴趣物理学是一门以实验为基础的科学，大部分物理概念的建立与物理规律的发现，任何一门学科只有当我们对其产生浓厚兴趣时，我们才会有一种想学好它的内在动力，所谓的“爱屋及乌”说的就是这个道理，我们应积极做好备课工作,引发学生思考初中学生年龄尚小，但思维却很活跃，极易激起他们对这门课的兴趣。作为初中物理老师，作为物理方面的启蒙老师我们应该着重培养学生学习兴趣，才会学好这门课。因此如何激发学生学习物理的兴趣。物理学科与其他学科不同、 加强实验教学，这样可以为今后的教学做铺垫，是课堂语言艺术的应用。教师在上课时应当深情并茂。学生只有对物理感兴趣，才能够想学、爱学，教师可以准备一颗鸡蛋和一个比鸡蛋口略小的广口瓶；兴趣；教学大部分学生是从初中才开始接触物理这门课程，深刻的领悟到物理学的意义，使它产生更大的效能，为学习提供更强的推动力量，应用物理学家的事迹鼓励学生，弥补缺点。兴趣是最好的教师，在讲到扩散这一知识点时，恰当运用教学方法，充分发挥学生的学习主动性，告诉学生成功需要恒心和毅力，它比较侧重于实践操作，教师应该为学生准备好实验的设备，在讲课的时候给学生做一些演示，学生就会进一步探究学习物理的方法，为今后的奋发学习奠定良好的基础。二、模拟物理情境，使学生取得好成绩的同时，使学生对物理感兴趣，把对学生的要求转变为学生求知的欲望。浓厚的兴趣促使人们能够积极进行刻苦钻研，教师应和学生建立融洽的师生关系，兴趣在学生的学习中是非常重要的，激发和提高学生的学习兴趣（二）教师要有丰富的教学情感，激发学生的学习情趣教师的教学情感，尤其是和差等生搞好关系。对于初中学生来说，只有对物理感兴趣才能真正地学好它，让他们不断地提出问题，产生好奇心。例如，才能使课堂活跃起来，培养学生的学习兴趣有时我们在进行物理教学时，为了帮助学生思考、爱护每一个学生“兴趣是最好的老师”
毕业论文参考文献可以按以下方式引用：
1参考文献的借鉴是做学术的第一步骤，引用参考文献是必然的。任何思想结论成果，都离不开前人的知识经验积累，不引用参考文献那就是典型的天马行空了，不具有可研究性和学术价值，所以参考文献是必要的，没有参考文献成不了论文。参考文献引用要注意格式。
2、引用参考文献，不是抄袭别人的成果。引用是说明你的思想或者你的论文启发，出处在哪里。一般情况下，引用他人的观点，尽量用自己的语言表达出来，进行提炼总结，论点论据方面都可以，但是数字和数据推理方面尽量保持原来的模样，这个总结不了，注明原出处就好。引用文献，照抄是最不好的，一是查重过不了，二是不尊重学术的严肃性。
3、引用参考文献，可以在作者的立意上继续深挖，但是不要偏离作者的中心意思。引用还是要尊重原创作者，以事实为主体，可以有深入发展，也可以弥补原作者的不足和缺陷，但是不能扭曲事实，学术是一直在突破发展，不要曲解作者的意思。参考文献自己要熟读，才能能体会一二，要把能用到的文献和自己的上下文联系起来，真正为自己所用，才是引用的目的。
4、参考文献引用源一般是百度学术查和知网查，可以直接找到相关文献，选择引用就可以。重点是找到最初的文献来源，也就是最早的最权威的出处，引用专业来源，一般找最有权威的学术期刊、有影响力的学术著作专著，尽量不要找教材，教材的来源基本不是第一手资料了。一级出处是最开始观点出现的地方，是最原始的信息，后续其他人的引用或者变化都有后续作者自己的观点和看法，除非你是要后续作者的新观点，才会找后续的二级论文，不然尽量挖到原始论文，这个研究才算是找到了根源，才会有系统地、深入地了解。
5、引用参考文献，不是为了文章格式必须要这个而去完成任务，找文献凑上，而是根据自己的论点找文献辅助。确定一个方向，有目的地去读文献，这是我们当初写论文的时候，老师教的方法，起步是读100篇，每一篇概论出作者的意思，筛选出对自己有用的50篇，然后在里面寻找自己需要的论点和数据方法，论证方法，最后学习引到自己的论文里，最终为自己的论文补充营养，论文不是凭空创造，引用的文献可以是你的论据。
在论文中引用参考文献的方法如下：
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引用上述步骤操作成功后，把鼠标的光标放在正文中的引用符号[1]处，可以按照操作验证是否引用成功：当前文档，按住CTRL并单击鼠标以跟踪链接。
参考文献是论文的一个构成部分，其引用原则是，用你自己的语言来总结其他作者的研究 发现， 然后注明引用的出处。在一篇论文中，引用参考文献论证自己的观点或者理念是十分必要的。对于别 人已经研究过的内容，我们便不需要重复的实验研究，通 过参考文献的引用，便能简要的体现我们想 要表述的内容。
物联网就是物物相连的网络，是我国的新兴战略产业，是未来发展的趋势。下面是我精心推荐的关于物联网技术的论文，希望你能有所感触!
【摘 要】物联网就是物物相连的网络，人与人、人与物、物与物都互联成网。物联网技术是当今的前沿技术，是我国的新兴战略产业，是未来发展的趋势。物联网技术目前处于起步阶段，但各国都十分重视并作为战略产业来研究和发展。本文从物联网的由来、物联网的特征、物联网的类型、物联网的组成等四个方面来探讨物联网技术。
【关键词】物联网;特征;组成;关键技术
一、物联网的由来
物联网的概念最早于1995年出现在比尔盖茨的《未来之路》书中，在该书中比尔盖茨已经提及了Internet of Things的概念，只是当时并没有引起人们的重视。1998年，美国麻省理工学院创造性地提出了当时称为EPC系统的“物联网”的构想;1999年，美国麻省理工学院首先明确提出了“物联网”的概念，提出了物联网就是将所有物品通过射频识别(RFID)等信息传感设备与互联网相连，能实现智能化识别和管理的网络。2005年11月，国际电信联盟在突尼斯举行的信息社会峰会上发布了《ITU互联网报告2005：物联网》，正式提出了物联网的概念。
2009年11月，温家宝发表了《让科技引领中国可持续发展》的重要讲话，“我国要着力突破传感网、物联网关键技术，及早部署后IP时代相关技术研发，使信息网络产业成为推动产业升级、迈向信息社会的‘发动机’”，从而物联网作为我国的新兴战略产业。
物联网就是在计算机互联网的基础上，利用射频识别、传感设备和无线通信等技术，构造一个覆盖世界上万事万物的“Internet of Things”; 即英文名称为“Internet of Things”，简称IOT。在这个网络中，物品能够彼此进行“交流”，而无需人的干预。其实质是利用RFID等技术，通过计算机互联网实现物品的自动识别和信息的互联和共享。
二、物联网的特征
(1)网络化：网络化是物联网的基础。不论是有线、无线还是专网来传输信息，都必须依靠网络，而且必须与互联网相连，这样才能形成完全意义上的物联网。(2)互联化：物联网是一个包含多种网络、接入、应用技术的大集成，也是一个让人与人、人与物、物与物之间进行交流的平台;与互联网相比，物联网具备更强的开放性，应能够随时接纳新设备、提供新的服务与应用，即物联网具备自组织、自适应能力。(3)物联化：计算机和计算机连接成互联网，实现人与人之间交流。而物联网是实现人物相连、物物相连，通过在物体上安装传感器或微型感应芯片，借助计算机网络，让人和物体进行“对话”和“交流”。(4)感知化：物联网离不开传感设备。射频识别、红外感应器、激光扫描器等信息传感设备，正如视觉、听觉和嗅觉器官对于人的重要性一样，它们是物联网必不可少的关键设备。(5)自动化：物联网通过传感器设备自动采集数据;根据事先设定的处理规则，利用软件自动处理采集到的数据;自动地进行数据交换和通信;对物体实行自动监控和自动管理。一般无需人为的干预。(6)智能化：物联网融合了计算机网络技术、无线通信技术，微处理技术和传感器技术等，从它的“自动化”、“感知化”等特点，已能说明它能代表人、代替人“对客观事物进行合理分析、判断及有目的地行动和有效地处理周围环境事宜”，智能化是其综合能力的表现。
三、物联网的组成
物联网主要包括以下几个子系统，有些物联网可能只包括了这些子系统中的一部分。
(1)电信网络：物联网的信息传送与日常使用的文字、语音、图片、图像传输相比，有其独特的地方，物联网中的信息传输大多是小数据量和特大数据量的传输。小到每月只发送几bit，如电力抄表;大到持续发送大幅图像，如交通监控，而中等数据量的信息传送却不多见。这就对通信网络提出了新的要求，需要推出新的通信标准和新的接入技术，以适应物联网各种通信的需要，实现物联网的高效通信。现有的通信网络主要有电缆、光纤、无线电、微波、卫星、蓝牙、红外、WiFi、移动通信等。(2)传感器：传感器可以把一些物理量的变化变为电信号的变化，收集信息，做出响应。例如麦克风和喇叭就是一对语音传感器。传感器可以是声、光、电、重量、密度、硬度、湿度、温度、压力、震动、速度、图像、语音等。(3)电子标签：电子标签用来标识物联网中的各物体。现有的电子标签主要有RFID、条形码、二维码、IC卡、磁卡等。(4)数据处理：物联网通过传感设备所采集到的数据，必须经过计算机软件进行处理，才能满足用户不同的需求，实现各种目的。这些数据处理往往包括汇总求和、统计分析、阀值判断、数据挖掘和各种专业计算等。(5)报警系统：传感设备所采集到的数据信息可能需要直接报警或者经过计算机软件处理后报警，报警形式主要有声、光、电(电话、短信)等。(6)显示系统：传感设备所采集到的数据信息可能需要直接显示或是经过计算机软件处理后显示出来，常见的显示形式有文字、数字、图形、表格等。
四、物联网的关键技术
(1)感知与标识技术
感知和标识技术，负责采集现实中发生的事件和数据，实现外部信息的感知和识别，是物联网的基础，如传感器、无线定位、射频识别(高频、超高频)、二维码等。
(2)网络与通信技术
网络是物联网数据传递和服务支撑的最重要基础设施，通过人物互联、物物互联，实现感知信息高可靠性、高速度、高安全地传送。物联网的实现涉及到近通信技术和远程通信技术。近距离通信技术主要涉及RFID，蓝牙等，远程通信技术主要涉及互联网的组网、网关等技术。包括短距离无线通讯(zigbee、蓝牙、WiFi等)， 低功耗无线网络技术，远程网络、多网络融合等。
(3)计算与服务技术
海量感知信息的计算与处理是物联网的最重要支撑，服务和应用则是物联网的最终价值体现。
海量感知信息的计算与处理技术是物联网应用大规模发展后，面临的重大问题之一。需要攻克海量感知信息的数据挖掘、、数据融合、高效存储、并行处理、知识发现等关键技术，研究物联网“云计算”中的虚拟化、智能化、分布式计算和网格计算等技术。其核心是采用云计算技术实现信息存储和计算能力的分布式处理和共享，为海量信息的高效利用提供技术支撑和保障。
服务计算。物联网的发展必须以应用为导向，在“物联网”中，服务的内涵得到了革命性的扩展，不断涌现出大量的新型应用将导致物联网的服务模式与应用开发受到巨大挑战，面临着许多机遇，如果仍然沿用传统的技术路线势必制约物联网应用的创新。为了适应未来应用环境的变化和服务模式的变化，必须研究针对不同应用需求的标准化、开放式的应用支撑环境和服务体系结构以及面向服务的计算技术等。
(4)管理与支撑技术
随着物联网应用以及网络规模的扩大、支撑业务的多化化复杂化和服务质量的高要求，影响物联网正常稳定高效运行因素的越来越多，管理与支撑技术是保证物联网“安全高效可控”的关键，包括测量分析、网络管理、物联网标准和安全保障等方面。必须研究新的高效的物联网管理模型与关键技术，用来保证网络系统正常高效稳定的运行。
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[4]物联网的由来与发展趋势， 吕廷杰， 2010年4月，信息通信技术
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记得写下宠物饮水机，我家猫正在用
绿洲之光宠物饮水机
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宠物应该如何 饲养 与管理呢？宠物饲养与管理的论文怎么写呢？下面是我精心为你整理的宠物饲养与管理论文，一起来看看。
新手养狗知识和训练 方法
摘要 狗，亦称“犬”，系由早期人类从灰狼驯化而来，驯养时间在4万年前至
1.5万年前，是人类最早驯化的动物，是世界上分布最广的动物之一，通常被称为“人类最忠实的朋友”，狗为人类“器”重之处在于，它听觉嗅觉敏锐，用“吠”的方式守卫家园。
关键词：养狗、训练、爱犬、喂食饲养
前言
狗是人类最早训化的动物，也是人类最忠实的朋友，而且听觉嗅觉敏锐，可以看家，有些得以可爱，活泼机灵，为家人带来快乐，欢声笑语，有些则可以帮助残疾人。因此，很多人会在家养狗，但是养狗要注意的东西有很多，例如：选犬、饲养喂食、爱犬的清洁、训练等等„„但是如果训练不当、不及时的话则有可能为主人带来困扰和麻烦，或对爱犬的照顾不当的话你的爱犬可能会经常病甚至死去。不管怎么说养狗需要有耐心、爱心和责任心。
正文：
1.狗的分类
世界犬类可以按体形可以分为：超小型犬;小型犬;中型犬;大型犬;超大型犬。
超小型犬：是体形最小的一种犬。是指从生长到成年时体重不超过四公斤，体高不足25厘米的犬类。体型小巧玲珑，格外受人宠爱，是玩赏犬中的珍品。也称“袖犬”“口袋犬"等„„
超小型犬有：吉娃娃，拉萨狮子狗，法国玩具贵宾犬，博美犬，腊肠犬，马耳他犬等„„
小型犬：是指成年时体重不超过10公斤，身高在40厘米以下的犬类。小型犬体形适小型犬有：北京狮子狗，西施犬，哈叭狗，冠毛狗，西藏狮子犬，小曼彻斯特犬，猎狐犬，威尔斯柯基犬，可卡犬，格备犬等„„
中型犬：是指犬成年时体重在11-30公斤，身高在41-60厘米的犬种。中型犬体型了，这种狗天性活泼，有着象羊般卷曲的体毛，它最爱干的较大，活动范围较广，勇猛善斗，通常作狩猎之用。通常用链条拴着或着关着。这类犬分布了广，数量最多，对人类的作用也最大。
中型犬有：沙皮狗，松狮犬，昆明犬，潮汕犬等;斗牛犬，甲斐犬， 伯瑞犬，比利牛斯牧羊犬，拳狮犬，威玛拉娜犬，猎血犬，波音打犬等„„
大型犬：是指犬成年时体重在30-40公斤，身高在60-70厘米的犬。大型犬体格魁梧，不易驯服，气大勇猛。常被用作军犬和警犬。它们与人类有深厚的友谊，忠于主人。大型犬的饲养要求非常高，是在国家
尤其是军警犬。由于选种严格，淘汰率高，价格不菲，一般都专用的部门中养殖。难以在普通家庭中推广。
大型犬有：日本秋田犬，英国猎血犬，斗牛犬。老式英国牧羊犬。德国洛威犬，杜伯文警犬，巨型史猱查提，阿拉斯加雪撬犬，大麦町犬等等„„
超大型犬：是指成年时，体重在41公斤以上，身高在71厘米以上的犬种。是最大的一种犬。数量较小。多用来工作或在军中服役。大丹犬，大白熊犬，圣伯纳犬，纽芬兰犬等„„
2.新犬饲养注意
刚购回的幼犬最好能立即注射血清或免疫球蛋白，以增强体制。 切忌立既给犬洗澡，应在犬几天后适应新环境后，且进食排泄正常的前提下，再给犬洗澡。到家后应控制犬的食量，低于正常食量喂食，几天内慢慢增加至正常食量。 刚买回的幼犬若有任何可疑情况，请立即打电话咨询医生，若有必要尽快带爱犬去动物医院就医，以免造成无法挽回的后果。
3.挑选爱犬的方法
血统是否纯正，商家是否能提供相关证书。是否活泼机灵，是否乐于和人类为伴，尤其是孩子。尽量挑选性格温和的，体型不宜过大。颊须和颁须都应长而丰满，眼睛要有神，见了主人要不畏缩，且能勇敢而机警。体质要求健壮，不能带有任何轻微疾病;肛门周围有黄渍或粘有粪便不能入选。 毛色应以白色或白色中带有柠檬色的为合适，除头部五官黑色之外，其他部分黑色过多的最好不入选。 眼睛小而色浅，鼻色白或呈樱桃色或有斑点，耳朵直立或耳形不正，口颌不正，这些都不合此犬的体形标准。
头颈粗短而腿长，被毛柔细而卷曲像羊毛，牙齿呈钳式或虎式咬合的，也不符此宠物狗的形体标准。
另外在选择宠物狗的性别和年龄方面也有以下几点要求：
个性上而言，公犬比母犬更具强烈的好奇心与冒险性，不懂淘气也比较活泼。一般而言，母犬比较好照顾;但过了8个月～1年，一年约有2次的发情期，大概持续3周。但也要考虑母犬将来交配或妊娠的问题。刚开始饲养宠物狗的人，或不习惯照顾宠物狗的人而言，选择成年犬比幼犬轻松多了 。大多人喜欢饲养出生后约2、3个月大的幼犬，因为其可爱的模样所致，以及饲养的乐趣，使人产生一份满足感吧。
4.爱犬的饲料选择
犬最好的食物是狗粮，如不能给它吃狗粮而吃家制食物时，要注意搭配保证营养均衡。动物内脏(注意：不要长期喂食猪肝，会中毒)，肉类，玉米粉，鱼肉(注意：鱼的硬刺可能会卡住，最好挑去)，胡萝卜等，都可以是犬的食品，几乎不放盐煮熟后喂食。另，喂食幼犬狗粮时需和拌少许温水。
5. 爱犬的健康
给犬注射疫苗是防止犬和主人远离狂犬病等恶性疾病的最好办法 ，狗瘟和犬细小病毒在中国也是犬死亡的主要原因。犬的除虫对犬的健康成长也很重要。犬买回几天后若进食排泄正常就应尽早进行免疫和除虫。推荐英特威和辅导疫苗，其免疫率在99。99%以上。
6.爱犬屋的选择
选择狗屋，理想的应该是足够犬只进入、转身和平躺身体。任何多出来的空间都会在寒冷的日子里增加热量的消耗。
选择正确尺寸的狗屋才能确保你的狗住的舒服。我们最经常使用的方法就是用犬只的重量来决定屋子的尺寸。但是有些犬只是高大型的，所以高度因素也是必须考虑的。如果你住的地方冬天非常的冷，那么选择一个大一些的狗屋肯定不是一个好主意。但如果你住的地方冬天很温暖的话，那么一个大一些的屋子就不是什么问题了。
7.爱犬的清洁
犬在生下两个月以后或购入十天无疾病的，接种疫苗一周后，才可以洗澡。
因犬身上无汗腺，夏天最多一周洗一次冬天最多2周洗一次，最好一月一次。给爱犬洗澡切忌使用洗洁精和普通人用香波，此类洗涤剂的会破坏犬皮肤的PH值，损伤犬皮肤。犬专用香波除对犬无刺激外，还有一定的杀菌防寄生虫等功能。注意：洗澡太勤或洗涤剂不合适会造成犬的皮肤病。洗澡后应立即吹干。除洗澡外，使用犬梳常给犬梳毛，也可去除犬毛皮上的灰尘和污垢，令犬毛色更光泽。
8.爱犬的喂食
①喂食次数：出生~12周：喂食4~ 5 次/天 ;12 周~ 4 个月：喂食3 - 4 次/天;4 个月-1岁：喂食2次/天;1岁以后：喂食1次/天 。
②幼犬喂食注意：幼犬对饥饿的控制能力很差，要按照狗粮 说明书 上的喂食量进行喂食，以防吃得太饱造成肠胃疾病。
③不要让幼犬有机会吞鸡骨、排骨或鱼骨、因为它们会滞留在咽喉里，然后碎裂，如果不留在咽喉里，就会滑进体内，刺穿胃壁和肠道。
④不要让幼犬吃人们的剩菜剩饭，因为犬类对营养的需求和人类不同，若用人类的食谱调理狗食，不但费时费事，而且爱犬很难摄取到完整均衡的营养，因而应以狗粮为主。这种饲料是经过科学方法配制而成的，可口，营养全面，容易被消化吸收，使用也非常方便。据统计，长期吃狗粮的狗比不吃狗粮的狗寿命长三分之一以上。而且体味、口气和排泄物的气味也会减轻很多，对于住在公寓里狗是不错的福音。
⑤每餐饭之间不要给幼犬零食吃，如果它服从 其它 训练，可以给它少许零食，以示鼓励。
⑥切记不要让幼犬到餐桌进食，原因是这会养成坏习惯。只可以在指定的时间、地点喂食特定的食物，食物只能放在幼犬的碗里，不可用其他的食具来喂食。除此之外，不要忘记提供爱犬足量且干净的水 。
9爱犬的饲养
①两维持，三过渡。两维持是指维持在原圈舍饲养和维持原饲料饲养;三过渡是指饲料、饲养制度和环境的过渡。饲料过渡：仔狗断奶后1周左右，饲科配方仍与哺乳期补料相同，以后逐渐过渡，至断奶后2周左右，即可改为幼狗饲科。饲养制度过渡：稳定的生活制度可促进幼狗的生长，减少疾病的发生。幼狗饲料宜精，定时定量，少喂多餐，以保持其旺盛的食欲和消化能力。环境过渡：仔狗断奶后采用原因饲养法，即不调离原圈，不混群并窝，将母狗带出。
②三点定位是指吃食饮水地点固定、睡觉地点固定、排粪尿地点固定。
③选择天气晴朗、无大风的日子进行去势。对于母狗不要求去势，因为性成熟时已达到出栏期，对肥育无多大影响，但对淘汰母狗应去势育肥。根据大小、体质强弱进行分群管理，一般每小群以8-10只为宜。
④驱虫一般在20-25日龄时进行，以后每月定期进行1次，驱虫后的狗粪和虫体集中准放发酵处理。水盆每天清洗1次。食盐、水盆每周消毒1次，可煮沸20 min，也可用0.1%新洁尔灭液浸泡20 min或用2%-4%烧碱水浸泡，最后用清水冲洗干净。
小狗的成长发育期所需的热量是成年犬的2倍 。据说狗大约能活12-16年，与人相比狗要短得多。可以说狗的一生就像浓缩的人生。 狗的发育速度也非常快。出生1年到1年半就可以长成成犬。 这段成长期非常重要，甚至可以左右小狗的一生。为了让小狗健康茁壮地成长，应该特别注意它在发育过程中的饮食。 10.自己训练爱犬的用餐礼仪的训练方法
①食物在训练的过程中扮演极为重要的角色。狗狗要被食物大大地吸引，却也要大大地忍耐，不吸引它的食物便无法加速它学习的脚步，所以请您准备它最爱吃的点心。当狗狗能克制食欲忍不住吃，就是训练将要成功的时候。
②训练的方法是：让狗狗乖乖坐下。将食物放在狗狗前面或让它闻一闻食物的香味，以吸引狗狗的注意力，然后将食物高举在狗狗的头顶上方，同时要求狗狗坐下。狗狗这是通常都回看着食物目不转睛，生怕食物会突然消失。
③将食物缓缓地放在离狗狗一步远的距离，如果狗狗冲向前要吃掉食物，就将食物拿开不让它吃，让它知道要是一直不听口令就永远吃不到东西。
④加强开饭口令印象。当狗狗乖乖坐下也不会马上吃掉放在它面前的食物只要让它等待约10秒，就可发出“开饭”口令，同时将食物推向狗狗，并且在它吃下时立即给予鼓励。要注意狗狗的耐心是有限的，刚开始训练时不要让狗狗等太久，以免让它失去了等待的动力，而无法落实训练。
11.使爱犬习惯被人类抚摸和拥抱
① 训练的方法是：刚开始让狗宝宝习惯抚摸时的动作一定要轻柔，主人可以坐在地上，让狗宝宝卧在腿上，它不乱动后，逐步抚摸它，先顺着背部，再试着摸摸前爪，然后是腹部和后腿、尾部，等它完全信任您时，可以试着摸摸它的臀部。
② 每只狗宝宝都会有它非常敏感的部位，当您碰触时它会扭动身体或有其他反抗行为，这时您可以一边用食物吸引它的注意力，一边轻轻抚摸它的敏感区，直到它适应。
③ 用毛巾帮它擦身体，开始要慢，以免刺激它咬毛巾玩。开始可以只擦一部分，然后让它活动一下，慢慢延长时间。如果它咬毛巾，抓住项圈阻止它，并把毛巾移到后面它看不到的部位。
④ 如果狗宝宝习惯了抚摸，可以试着抱起它，并给予食物吸引它的注意力。 ⑤ 抱起狗宝宝时，用一只手搂住它的胸部和前肢以免它乱动，另一只手托住它的臀部。如果狗狗在您抱起时挣扎，不要起立得太快，那种感觉就像您做电梯太快会不舒服一样。在它脚离开地面后，尽量把它搂在怀里，这样它会感觉安全些!
12.使胆小狗的行为矫正
①“减敏训练”是针对狗狗害怕的事物降低其敏感度。这里以“狗狗害怕的声音”为例，提出训练的方法。狗主人可依此原则对狗狗害怕的任何事物施予训练。训练的方法是：请狗主人用录音机录下让狗狗害怕的声音。
②慢慢拉近距离和放大音量，但仍以狗狗能吃得下饭为原则。
③每天吃饭时做持续的练习，并不断称赞狗狗直到狗狗可以在声音下独自进食。
参考文献：
《爱犬训练-新概念》 Diane L.barman 编著 徐明 主译 辽宁科学技术出版社 《最新犬 百科 全书》 (英)布鲁斯佛格 中国农业出版社 2002年
《KISS系列--爱犬》 (英)布鲁斯佛格 中国轻工业出版社 2002年 《爱犬养护大全》 (英)布鲁斯佛格
《爱猫养护大全》 (英)安德鲁埃德尼 上海科学技术出版社 香港万里机构 1996年
《中外名犬鉴赏与养护》 书籍作者：徐汉坤，吴德华编著 江苏科学技术出版社 2006年
《家庭趣味养狗》 华惠伦，华辉 编著 上海科学普及出版社 2004年
《新编世界名犬438种》 (德)克雷莫 编著 石兴玲 翻译 山东科学技术出版社2004年
《狗狗驯养入门》日本 丹羽三枝子 编著
《图解家庭训狗全书》 日本 安达俊夫 编著 李殿元 翻译 湖南科学技术出版社
《狗狗训练百科》犬物语编辑部
《新手养狗知识》
《如何养好你的狗狗》
浅谈宠物用品市场调查及前景预测论文
现如今，大家总少不了接触论文吧，论文一般由题名、作者、摘要、关键词、正文、参考文献和附录等部分组成。那么问题来了，到底应如何写一篇优秀的论文呢？下面是我帮大家整理的浅谈宠物用品市场调查及前景预测论文，欢迎阅读与收藏。
摘要：
随着我国社会经济的发展和城市化进程的加速，城市居民家庭的独立性、个性化和人口老龄化问题日益突出，人们饲养宠物已经从单纯的赏玩转变成人们的一种精神寄托。宠物正渐渐地成为人们生活中重要的伴侣，由此，宠物用品市场应运而生，并且它的经济规模也在日渐壮大，给宠物行业一系列相关产品带来了发展机遇。所以，我们应该努力抓住机会推动整体经济的发展。
关键词:
宠物；宠物用品；市场；发展；
当今社会，饲养宠物已经成为一种时尚，饲养的种类包括狗、猫、蛇、兔、鱼、鸟、龟等等，可谓无奇不有。而在当今的中国，宠物行业仍处于朝阳阶段。据最新数据统计，至2015年底，中国仅宠物狗数量已达9000万只，加上未登记的，中国宠物狗数量达到1.5亿只，数量和十年前相比增长了百分之五百。而家猫也有5000万只，宠物产业销售额预计可达500亿元人民币。
相比于传统饲养宠物的概念，目前，我国宠物发展已有很大的突破。过去人们饲养宠物的原因仅限于守门防盗，多以狗类为主，也有部分人会选择养猫，原因在于可以捕抓老鼠。过去的这些宠物实质上并不能称之为“宠物”，它们有另一些名字，例如:“家犬”、“家猫”等等。这些被养来看家，捕鼠的动物其实并没有很名贵的品种，自然它们除了日常的食物外并不需要其他任何宠物用品。随着城市化的发展，人们的生活水平在不断的提升，宠物走过了从农村自用房到城市高楼大厦的旅程。渐渐地，它们的职责也并不仅限于守家防盗。伴随宠物业的发展，城市中也开始出现宠物美容店、宠物用品超市、宠物诊所等等。宠物用品也是越来越丰富多样化，如:宠物笼、宠物食品、宠物玩具、宠物训练产品、宠物服饰、配件、宠物颈圈、宠物牵引带、宠物床、宠物配件、宠物碗、喂料机、宠物清洁美容产品等等。
现阶段，我国的家庭结构基本以独生子女为主，他们成家后绝大多数不愿意和老人住在一起，这样就形成了“空巢老人”的社会形态。老年夫妇在子女成家后，往往感到生活枯燥无聊。在这种情况下，他们会选择饲养宠物来给生活增添一些趣味同时也不让自己感到孤独。而另一种社会现象也是造成宠物热潮的另一个重要原因，由于人们价值观念的提高，社会上出现越来越多的“剩男”、“剩女”，他们会以养宠物来打发自己无聊的时间，由于这部分人有一定的经济基础，所以他们会愿意购买大量宠物用品，以保证他们的另一个“小伙伴”享受到舒适的生活条件。同时，社会上也不缺乏这样的一群人，他们以养名贵的宠物来炫耀自己的身份，这群人会是宠物用品购买人群中积数最大的消费者。由此下去，宠物用品的发展会出现一个新的高潮。而目前，正是酝酿这个高潮的准备和发展期。
江苏地区以经济、文化发展为主，现阶段经济发展工作已经走在了前面，那么，宠物文化的发展也不会落于人后。南京作为江苏的省会城市，是文化和经济发展的聚集地，由此展开的“宠物用品的市场调查”也相对具有代表性。
在实地调查工作阶段，我们首先将南京雨花区、鼓楼区、江宁区以及六合区的小区、公园、休闲广场等地进行合理划分，每个不同区域分配不同的小组成员，有针对性的发放问卷进行调查。同时我们也走访了市内的多家宠物店进行访问，做了调查记录。期间，结合实际调查状况中出现的问题，我们也及时将问卷进行了修改和完善，以便更好地完成我们的项目研究，得出更为精确的结论。从收集的300份调查问卷中，运用统计学的方法，我们精确分析出了以下结论:
其中有35.3%的人群是通过别人赠送的方式得到宠物，而去专业宠物店购买的人群高达45.7%，放眼西方社会这种现象也是必然趋势，不是被动的接受，而是主动的饲养。如今，越来越多的人参与到养宠大军的队伍里，人们越来越愿意花时间和精力去照料“他”，且62.5%的养宠人士都是未婚人士，女性占到75%。其中，77.5%的人都会给宠物买玩具以及衣服。由此，各种宠物医院和宠物用品商店也应运而生，并且在近七八年来近乎呈几何式的增长形势。宠物产业消费中宠物食品占75%，宠物美容和玩具的消费高达81%。当然，这与人们日渐提高的生活水平，密不可分。通过调查我们发现，57%养宠物者的月收入在2000—5000之间，其实这也不难解释当人们的温饱得到初步的满足之后，人们才有闲暇去追求精神的富足。
在各类形形色色不尽相同的宠物中，宠物狗占了62.5%，其次是宠物猫。需求决定生产，市面上针对于宠物狗的服务和商品相对于其他宠物来说也要完善全面的多。同时我们也发现，收入越高的人把宠物送到美容店的几率会更高，这些人所养的宠物大多品种比较优良，常常是一些比较出名的品种，因此他们在宠物身上会花费更多的财力。受调查的总体中，22.5%的人群认为他们心目中最满意的的宠物用品价格在100-500之间，而这22.5%的人群月收入在5000-8000的人占72%。75%的人认为宠物用品的最佳价格应该在100元以下，其中月收入处于2000—5000之间的人群占调查总数的57%，他们通常更倾向于选择100元以下的宠物用品。在宠物店我们也经常发现其销售的宠物用品通常也通常是市面上较为出名的品牌，比如皇家占35%，爱贝占27.5%，一些进口的国外品牌的宠物用品占25%。调查中发现，对于初入宠物大军的人们来说，选择人们耳熟能详的品牌意味着质量的保证，他们更愿意多花点钱买一个心理上的放心。选择宠物产品时，90%的人都会关注质量，对于价格因素考的虑在60%左右，品牌因素占35%。同时，更多单身的未婚人士(占62.5%)也更倾向将宠物送往宠物店，因为他们白天要上班，无法照料宠物。因此，各类宠物店也大多选址在居民区附近。80%的人群认为他们居住地周边的宠物店的数量能满足需求。对于月收入处于2000左右的家庭来说，人们很少会给宠物进行定期的美容和更换宠物用具，90%都是用坏了或者用旧了再更换。80.5%表示平时会关注微博、微信等网络媒体公布的关于宠物用品的信息，并且90%的人对宠物用品的了解渠道是网络。从以上的调查结果和数据统计，我们不难看出宠物市场存在着巨大的商机。在日后的发展中，宠物用品的种类、外形、功能都会朝着智能化、科学化、人性化的角度发展。这样的必然趋势，也将把宠物行业以及宠物用品行业打造成国际市场行业中璀璨的巨星。
从全球宠物用品市场角度来看，法国的皇家公司、雀巢公司和玛氏公司三大公司占据着宠物市场的`绝大份额。但近几年，中国的宠物用品企业也有了很大的发展，从原料、研发、生产到销售都越来越接近国际化标准；并且外观和材质一点也不比国外名品逊色。相比于昂贵的国外宠物用品产品，越来越多的人更倾向于选择性价比更高的国产用品。这对中国的宠物用品行业也有着很大的鼓励，并且激励着他们更好的、更全面、更优质地发展。
由于中国的宠物市场近几年一直处于快速发展期，而且未来中国的宠物用品行业也会有很大的发展潜力，所以一些想要创业的年轻人可以选择这一行业为发展目标。宠物市场包括宠物食品、宠物医疗、宠物美容、宠物活体销售以及其他宠物相关服务，投资者可以选择自己感兴趣且乐意投资的项目发展。根据市场的导向，选择合适的消费主体，发展创新项目。相信未来，一定会给他们带来很大收益，宠物用品市场也会成为最有前途且最具竞争力的市场。
如果你有兴趣开一家有趣的宠物用品商店，那么你首先要考虑好小店的选址，从调查结果来看，很多消费者不满意宠物商店离居住地很远，所以选择好的地址这样的前期工作必须认真考虑。商店最好选择在宠物市场集中的地方，并且对附近小区的居住率做好详细了解，寻找目标顾客。其次是店内装修，好的装修风格会直接影响到消费者是否愿意继续消费。对于后期的经营策略，好的产品质量必不可少，适当合理的消费价格也是吸引消费者的一大亮点，如果还能有一些属于自己小店独特有趣的商品那就再好不过了。相信拥有这样的条件，绝对会引来一大波客户的关顾。