世界卫生组织专项基金共9项项目01:课题名称:SARS vaccine development: Production and immunogenicity of spike proteinof SARS virus in Pichia pastoris.资助金额:5 万美圆起止年月:2003-2005年项目02:课题名称:A phase I randomized singled blinded single center study, comparing doses of PfCP-2.9 recombinant vaccine adjuvanted with Montanide ISA720 for safety and Immunogenicity资助金额:8.13 万美圆起止年月:2003-2004年项目03:课题名称: Construction and immunogenicity of combined malaria vaccine containging PfCP-2.9 and pre-erythrocytic stage antigens资助金额:11.1 万美圆起止年月:2002-2006年项目04:课题名称: Synthesis and expression of codon-optimised Schistosoma japonicum paramyosin(Sj-97) in Pichia pastoris资助金额:3.5万美圆起止年月:2002-2003年项目05:课题名称: pre-clinical investigation of chimeric protein consisting Plasmodium falciparum AMA-1 and 19 kDa C-terminus of MSP1资助金额:12.0万美圆起止年月:2000-2003年项目06:课题名称: Examination of two malarial antigens, the entire MSP1 and AMA-1/MSP1-19 chimeric protein as vaccine candidate资助金额:12.39万美圆起止年月:1999-2002年项目07:课题名称: Production and immunogenicity of the major merozoite surface protein of Plasmodium falciparum in Pichia pastoris资助金额:6.5万美圆起止年月:1998-2000年项目08:课题名称: Synthesis and expression of chimeric gene for malaria vaccine candidate资助金额:6.03万美圆起止年月:1998-2000年项目09:课题名称: Expression and immunogenecity of the MSP1/gp190 of Plasmodium falciparum in Salmonella typhi vaccine strain资助金额:6.25万美圆起止年月:1996-1999年瑞典KAROULINSKA研究院合作基金:课题名称:Development and evaluation of a malaria vaccine in primate model资助金额:60万瑞典克郎(其中22.4万瑞典克郎将转入本室)起止年月:2004-2006年2.国内基金项目(获基金总额:818万人民币)项目名称:疟疾红内期保护性CD4+ T细胞表位的鉴定及其应用基金来源:国家自然科学基金委资助金额:26万起止年月:2007-2009项目名称: 疟疾红内期疫苗及其免疫保护机制的研究课题编号:06XD1402基金来源:上海市优秀学科带头人计划资助金额:25万起止年月:2006.9-2008.8项目名称:基金来源: 军队十一五专项资助金额: 40万起止年月: 2006基金类别: 主办国际会议基金基金来源:国家自然科学基金委资助金额: 3 万人民币起止年月: 2005年基金类别: 主办国际会议基金基金来源: 上海市科委(白玉兰基金)资助金额: 2 万人民币起止年月: 2005年题目:重组疟疾疫苗的临床研究基金类别: 国家重大科技专项资助金额: 250 万人民币起止年月: 2003-2005题目:重组疟疾疫苗的中试和临床研究基金类别: 上海市重大科技专项资助金额: 100万人民币起止年月: 2003-2006题目:PfCP-2.9重组疟疾疫苗免疫保护作用机制的研究基金类别: 国家自然科学基金重点项目资助金额: 140万人民币起止年月: 2005-2009年题目:疟疾相关相关蛋白和防治研究基金类别: 国家杰出青年科学基金资助金额: 100万人民币起止年月: 2002-2006题目:重组疟疾疫苗的中试及临床研究基金类别: 国家863计划项目资助金额: 207万人民币(三个子课题总负责)起止年月: 2001-2003年题目:重组疟疾疫苗研究基金类别: 国家863计划项目资助金额: 40万人民币起止年月: 1999-2000年题目: SARS亚单位疫苗的研制基金类别: 上海市SARS专项基金资助金额: 40万人民币起止年月: 2003-2004题目:重组疟疾疫苗临床前研究基金类别: 军队指令性项目资助金额: 50万人民币起止年月: 2001-2003年题目:重组疟疾疫苗的临床前研究基金类别: 上海市新药基金资助金额: 50万人民币起止年月: 2001-2003年题目:利用基因打靶技术建立MSP1转基因动物模型基金类别: 国家自然科学基金项目资助金额: 19万人民币起止年月: 2002-2004年题目:重组疟疾疫苗研制基金类别: 校联合攻关项目资助金额: 50万人民币起止年月: 2000-2002年题目:恶性疟MSP1基因在人伤寒杆菌疫苗株中进行四环素诱导表达基金类别: 国家自然科学基金项目资助金额: 12万人民币起止年月: 1997-2000年五.专利与论文申请及授权的发明专利(1). 名称:疟原虫融合抗原及其制法和用途发明人:潘卫庆类型: 发明专利授权时间:2004年11月24日国别:中国(2)名称:Plasmodium fusion protein: preparation and uses thereof发明人:潘卫庆类型:发明专利授权国家:美国专利号:美国:US 10/467 198授权日期:2006年(3)名称:Plasmodium fusion protein: preparation and uses thereof发明人:潘卫庆类型:发明专利授权国家:欧盟专利号:授权日期:2006年(4)名称:Plasmodium fusion protein: preparation and uses thereof发明人:潘卫庆类型:发明专利授权国家:澳大利亚专利号:授权日期:2007年(5)名称:制备疟疾完整抗原gp190/MSP1的重组方法发明人:H.Bujard, R. Tolle, W. Pan类型:发明专利授权国家:中国授权日期: 2004年5月5日(6)名称:Recombinants process for preparing a complete malaria antigen, gp190/MSP1发明人:H.Bujard, R. Tolle, W. Pan类型:发明专利授权国家:澳大利亚授权日期: 2001年4月19日(7)名称:Recombinants process for preparing a complete malaria antigen, gp190/MSP1发明人:H.Bujard, R. Tolle, W. Pan类型:发明专利授权国家:美国授权日期: 2005年8月25日(8)名称:重组恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶及其制法和用途发明人:张冬梅,潘卫庆类型:发明专利申请时间:2005年7月18日申请号:200510027811.1(9)名称:重组恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区蛋白及其制法和用途发明人:潘卫庆,张冬梅类型:发明专利申请日期:2005年6月29日申请号:200510027233.12.科研成果产业化及其转让主研的基因工程疟疾疫苗已转让给上海万兴生物制药有限公司.3.代表的论文(* : 通讯作者)Qingfeng Zhang, Xiangyang Xue, Li Qu, Weiqing Pan ,Construction and evaluation of a multistage combination vaccine against malaria,Vaccine 25 (2007) 2112–2119,Kirsten Moll, Arnaud Che ne., Ulf Ribacke., Osamu Kaneko4, Sandra Nilsson, Gerhard Winter, Malin Haeggstro¨m, Weiqing Pan, Klavs Berzins6, Mats Wahlgren, Qijun Chen*,A Novel DBL-Domain of the P. falciparum332 Molecule Possibly Involved in Erythrocyte Adhesion,PLoS ONE,2007,5:477Langermans JA Hensmann M van Gijlswiik M Zhang D Pan W Giersing BK Locke E Dubovsk F Wittes J Thomas AW,Preclinical evaluation of a chimeric malaria vaccine candidate in Montanide ISA 720: immunogenicity and safety in rhesus macaques.Hum Vaccin. 2006 Sep-Oct;2(5):222-6.D. M. ZHANG, W. Q. PAN*, L. QIAN, M. DUKE, L. H. SHEN, & D. P. MCMANUS, Investigation of recombinant Schistosoma japonicum paramyosin fragments for immunogenicity and vaccine efficacy in mice. Parasite Immunology 2006, 28(3):77-84Dongmei Zhang and Weiqing Pan*(2005)Evaluation of three Pichia-expressed Plasmodium falciparum merozoite proteins as a combination vaccine against blood-stage parasites. Infection and Immunity,73(10):6530-6536Ballou WR, Arevalo-Herrera M, Carucci D, Richie TL, Corradin G, Diggs C, Druilhe P, Giersing BK, Saul A, Heppner DG, Kester KE, Lanar DE, Lyon J, Hill AV, Pan W, Cohen JD(2004). Update on the clinical development of candidate malaria vaccines. Am J Trop Med Hyg. Aug;71:239-47Pan Weiqing*, Daqing Huang, Qingfeng Zhang, Li Qu, Dongmei Zhang, Xiaoli Zhang, Feng Qian, Fusion of two malaria vaccine candidates enhances product yield, immunogenicity and antibody-mediated inhibition of parasite growth in vitro. Journal of Immunology 2004,172:6167-6174Feng Qian, Weiqing Pan*(2002). Construction of a tetR-Integrated Salmonella enterica Serovar Typhi CVD908 strain that Tightly Controls Expression of the Major Merozoite Surface Protein of Plasmodium falciparum for Applications in Human Vaccine Production, Infection and Immunity, 70(4):2029Weiqing Pan, Elidabetta Ravot, Ralf Tolle, Rainer Frank, Raphael Mosbach, Ivana Turbachova and Hermann Bujard(1999), Vaccine candidate MSP-1 from Plasmodium falciparum: a redesigned 4917 bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full-length protein from Escherichia coli and mammalian cells, Nucleic Acids Research, 27(4): 1094Weiqing Pan, Ralf Tolle, and Hermann Bujard(1995), A direct and rapid sequencing strategy for the Plasmodium falciparum antigen gene gp190/MSA1, Molecular and Biochemical Parasitology, 73:241Petra Burghaus, Peter Gerold, Weiqing Pan, Ralph Schwarz, Klaus Lingelbach, Hermann Bujard(1999) Analysis of recombinant merozoite surface protein-1 of Plasmodium falicparum expressed in mammalian cells, Molecular and Biochemical Parasitology, 104:171-83(QIAN Feng, NIE Ben-yong, YANG Xiao-ping, ZHANG Long-xing and PAN Wei-qing. Sequence variation and naturally acquired antibody recognition of apical membrane antigen 1 of Plasmodium falciparum in endemic area of China. Chin Med J (revised)2004.潘卫庆,杨树桐,邓海琳,陆德如(1993),中国海南省恶性疟原虫P190抗原变异的研究,中国科学,23:1070张冬梅,潘卫庆*,陆德如(2002).重组裂殖子表面蛋白1特异抗体有效抑制恶性疟原虫体外生长,生物化学与生物物理学报,34(3)(SCI 收录杂志)钱锋,潘卫庆*(2001).Cre/loxP介导的伤寒杆菌染色体上插入基因的切除, 生物化学及生物物理进展,28,732 (SCI 收录杂志)张青锋,潘卫庆*,曲莉(2003).N端9个氨基酸缺失对恶性疟融合抗原免疫原性的影响,生物化学与生物物理学报,35(4):345-349(SCI 收录杂志),5.著作出版:(1)潘卫庆,汤林华主编,《分子寄生虫学》,上海科技出版社 2004获第十八届华东地区科技出版社优秀科技图书二等奖(2)潘卫庆 主编 《寄生虫生物学研究与应用》,化工出版社,20076.奖励:2006年: 入选上海市优秀学科带头人计划2004年: 解放军总后勤部科技银星2003年:第二军医大学校长奖2003年:享受军队首批优秀专业人才岗位津贴2002年:国家杰出青年科学基金获得者2002年 获得军队院校育才奖银奖2001年 荣立个人三等功2000年 获得明治乳业生命科学 科学奖2000年 获得金润奖励基金 优秀科研奖六,学术交往以世界卫生组织临时顾问身份出席WHO学术会议:2003年6月:出席世界卫生组织全球SARS会议会议地点:马来西亚,吉隆坡2003年11月:出席世界卫生组织全球SARS疫苗专家咨询会议会议地点:瑞士 日内瓦2003年10月:出席世界卫生组织血吸虫病疫苗会议会议地点: 菲律宾 马尼拉2003年6月:世界卫生组织疫苗与新型佐剂会议会议地点: 法国 安呢斯2003年6月:世界卫生组织全球疫苗会议会议地点:南朝鲜,汉城2002年1月:出席世界卫生组织疫苗与新型佐剂会议会议地点: 法国 安呢斯2002年3月:出席世界卫生组织全球疫苗会议会议地点:瑞士 日内瓦1999年6月:出席世界卫生组织疟疾及血吸虫疫苗会议会议地点: 菲律宾 马尼拉1998年3月:专题报告:疟疾疫苗候选抗原MSP1研究进展报告地点:瑞士 日内瓦世界卫生组织总部学术会议报告(国际会议部分)2005年7月:第12届国际原生动物大会报告类型:主题报告(Keynote speaker)报告题目:Research and development of combination vaccine against malaria parasite会议地点:中国2005年11月:2005国际寄生虫学与媒介生物学大会报告类型:主题报告(Keynote speaker)报告题目:Research and development of combination vaccine against malaria parasite会议地点:中国2000年2月:疟疾分子生物学大会报告类型:特邀报告(invited speaker)报告题目:Examination of two malaria antigens,the entire MSP1 and Plasmodium falciparum Chimeric protein as vaccine candidate.会议地点:澳大利亚2002年1月:世界卫生组织新型佐剂会议报告类型:特邀报告报告题目:Immunogenicity of P. falciparum Chimeric protein 2 adjuvanted with Montanide ISA720 in rabbits and monkeys会议地点: 法国 安呢斯2003年10月:世界卫生组织血吸虫病疫苗会议报告类型:特邀报告报告题目:Example from Malaria vaccine research and development会议地点: 菲律宾 马尼拉2003年6月: 世界卫生组织疫苗与新型佐剂会议报告类型:特邀报告报告题目: Combined malaria antigen adjuvanted with Montanide ISA720会议地点: 法国 安呢斯2000年12月:比尔盖茨基金会MSP1疫苗会议报告题目:Production of MSP1-42 and Plasmodium falciparum Chimeric protein in Pichia pastoris会议地点:美国 华盛顿2001年6月:第11届亚太地区军事医学大会报告类型:分题报告报告题目:Malaria vaccine development: Bulk production and pre-clinical investigation of Plasmodium falciparum Chimeric Protein as vaccine candidate.会议地点:新西兰3.专题报告(国外部分)2000年12 月:报告题目:Examination of Plasmodium falciparum Chimeric proteinas vaccine candidate报告地点:美国NIH;美国椰鲁大学;美国纽约大学1998年3月:报告题目:Synthesis and expression of entire merozoite surface proteinof Plasmodium falciparum报告地点:瑞士 日内瓦2003年9月:报告题目:PfCP-2.9 vaccine candidate: research and development.报告地点:瑞典 Karolinska 研究所2004年2月:报告题目:PfCP-2.9 vaccine candidate: research and development.报告地点:美国疾病控制中心2006年10月:报告题目:Malaria Vaccine Discovery报告地点:日本长崎大学主办或承办国际会议2005年11月23-26日:2005国际寄生虫学与媒介生物学大会(主办)大会主席:潘卫庆,L.Miller(NIH)1998年12月7日-10日:世界卫生组织疫苗研究国际会议(承办)会议地点:上海; 时间:4天柳叶刀最新一期国际顶级学术期刊《柳叶刀·传染病》杂志以论著形式，在线发表潘卫庆团队最新科研成果，并配发了美国约翰·霍普金斯大学彭博公共卫生学院克莱夫·席夫教授的评论：“该研究团队从全基因组范围筛选出敏感的诊断分子，将极大改进血吸虫检测技术，从而为全球血吸虫病流行程度作出全面客观评估。”中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所所长周晓农认为：“这项研究围绕我国当前血吸虫病从控制走向消除这一需求，对血吸虫病筛查正确率和监测敏感性的提升起到了积极推动作用，是依靠科学研究解决防治中关键技术问题的一个典范。”潘卫庆教授率领“疟疾、血吸虫病防治基础研究”团队，包括同济大学医学院、江西省寄生虫病防治研究所、苏州大学医学院、第二军医大学热卫系等单位的科研人员，从全基因组水平筛选血吸虫病诊断的标识分子。该团队首先建立融合分泌蛋白高通量筛选的技术平台，再从基因组范围大规模筛查具有诊断价值的标识分子，从200多个血吸虫分泌蛋白中鉴定出一个具有诊断价值的标识分子（即SjSP-13），其诊断敏感性比传统方法提高了6倍。潘卫庆教授说，当前我国血吸虫病防控总体策略是以传染源控制为主的综合防治策略。控制传染源的重要途径是及时准确发现感染者，并对所有感染者加以有效治疗。由于血吸虫病流行特点是以低度感染为主，诊断低度感染者需要高敏感度的技术，因此SjSP-13诊断分子的发现解决了现有诊断技术敏感性不足这一根本问题，该分子的应用必将为血吸虫病总体防控策略的实施提供重要的技术支持，为我国血吸虫病防控乃至消除将产生积极影响。
【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 (13.2% to 86.7%), HLADR (38.9% to 97.9%), CD83 (0.9% to 97.1%), CD86 (31.2% to 92.5%) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(61.3±8.1) ng/L to (287.4±29.3) ng/L, P＜0.05〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(13.2%上升至86.7%)，HLADR(38.9%上升至97.9%)，CD83(0.9%上升至97.1%)，CD86(31.2%上升至92.5%)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(61.3±8.1→287.4±29.3，P＜0.05)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 R739.41 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 1.1材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 1.2方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 1.2.1转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 1.2.2细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 1.2.3CTL效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 10.0统计软件分析.2结果 2.1HepG2GFP总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 2.2流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 13.2%，HLADR 38.9%，CD86 31.2%，CD83低表达，仅0.9%；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 86.7%，HLADR 97.9%，CD86 92.5%，CD83 97.1%，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 2.3ELISA检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（287.4±29.3) ng/L vs (61.3±8.1) ng/L； n=6，P＜0.05〕. 2.4CTL介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（62.6±2.9）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(20.8±1.5)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(20.8±1.5)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜0.05）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(37.7±1.8)%和(26.8±1.1)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜0.05）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. 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知网是国家知识基础设施的概念,由世界银行于1998年提出。CNKI工程是以实现全社会知识资源传播共享与增值利用为目标的信息化建设项目。由清华大学、清华同方发起。知网收录的期刊，比如《上海国土资源》、《西北水电》、《船电技术》、《中华辞赋》等。
1、《上海国土资源》是围绕国土资源诸领域的重点、难点、热点问题，及时反映相关的学术研究与实践工作成果，促进科技交流与成果展示，为经济和社会发展提供服务。
2、《西北水电》是国家电力公司西北勘测设计研究院主办的技术性期刊。1982年创刊，国内外公开发行。《西北水电》杂志为陕西省优秀科技期刊；中国学术期刊综合评价数据库来源期刊；中国科技论文统计源期刊；中国科学引文数据库来源期刊。
3、《船电技术》（月刊）创刊于1981年，由武汉船用电力推进装置研究所、中国造船工程学会轮机学术委员会主办。它是中国造船工程学会轮机学术委员会的会刊，我国船电界唯一公开发行的刊物。刊载有关于各类船舶、港口、石油平台的电站、电机、电子控制、化学电源、微机应用及自动化等方面的理论研究。
CNKI中心网站及数据库交换服务中心每日更新5000~7000篇，各镜像站点通过互联网或卫星传送数据可实现每日更新，专辑光盘每月更新，专题光盘年度更新。
中国期刊全文数据库(CNKI)是目前世界上最大的连续动态更新的中国期刊全文数据库，收录国内8200多种重要期刊，以学术、技术、政策指导、高等科普及教育类为主。
同时收录部分基础教育、大众科普、大众文化和文艺作品类刊物，内容覆盖自然科学、工程技术、农业、哲学、医学、人文社会科学等各个领域，全文文献总量2200多万篇。
CNKI概述：
1、产品分为十大专辑：理工A、理工B、理工C、农业、医药卫生、文史哲、政治军事与法律、教育与社会科学综合、电子技术与信息科学、经济与管理。十专辑下分为168个专题和近3600个子栏目。
2、收录年限：1994年至今(部分刊物回溯至1979年，部分刊物回溯至创刊)，8200种全文期刊的数据完整性达到98%。
3、数据库应用：CJFD除了可用于信息检索、信息咨询、原文传递等常规服务外，还可以用于以下一些专项服务：引文服务，生成引文检索报告；查新服务，生成查新检索报告；期刊评价，生成期刊评价检索报告；科研能力评价。
生成科研能力评价检索报告；项目背景分析，生成项目背景分析检索报告；定题服务，生成CNKI快讯。
是。因为新闻出版署可查的期刊不一定是正规期刊，正规期刊必须在邮政期刊订阅网上可查 1、正规期刊内容均将通过不同的网络载体呈现。 2、作为一本面向海内外公开发行的正规期刊，在拥有国家新闻出版总署所批复刊号的同时，需要有各地邮政部门确认的邮发代号，没有刊号及邮发代号，无法在邮局（或在中国邮政报刊订阅网上）订阅，此类出版物在职称评定过程被视为非正规出版物，不予认定。因此，正规的期刊，必须拥有国家新闻出版总署所批复的刊号和各当邮政部门确认的邮发代号。
可以。万方可以做新闻期刊。集纳了70多个类目共7600种科技类期刊全文。方数据库是由万方数据公司开发的，涵盖期刊、会议纪要、论文、学术成果、学术会议论文的大型网络数据库，也是和中国知网齐名的中国专业的学术数据库。
可以在网上搜一下核心期刊要目总览，核心类别叫中国医学；CSCD的名单网上也有的。
中国科学引文数据库（CSCD）分为核心库和扩展库，其中，核心库期刊：669种(以*号为标记)；扩展库期刊：378种。
CSCD已被中国科学院院士主席团指定为中国科学院院士推选人查询库，被国家自然科学基金委员会列为国家杰出青年基金申请项目、基金资助项目后期绩效评估、国家重点实验室评估等指定查询库。
扩展资料
注意事项：
1、刊物选择：一般发表核心期刊都是要求发到专刊上面，所以投稿的时候一定要选对，如发的是教育类的，教育类专刊CN刊号一定要带有G4的标志。
2、格式字数：不同的刊物对格式字数等要求都不同，字数只能多不能少，如图教育探索征稿要求。
3、科学性：文章一定要有科学依据，真实的数据真实存在的。
4、可读性：可读通过数据图表等有一定的启发，专业术语语言规范性都有要求。
参考资料来源：百度百科-核心期刊
《时珍国医国药》《重庆医科大学学报》（此刊是CSCD+北大核心）,审稿1-2周。需要速联
01/官网查询。中国科学院文献情报中心情况分区查询链接：自从2020年12月起，中科院已启用升级版查询系统。登陆进入系统后，输入刊名/issn即可检索。02/小程序查询.中国科学院文献情报中心公众号—服务—分区表—2020年升级版—输入刊名/ISSN即可检索。04/LetPub查询百度搜索LetPub，点击进入首页，输入期刊名即可检索。点击想要查询的学科，还可以根据研究方向查看中科院分区。需要投稿却不清楚分区的，可以根据目录来选择哦！
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