新疆梨火疫病研究论文

由于梨火疫病在世界各国均很重视，研究亦相对较多，其检验方法亦很多，从经典的分离培养、致病性测定、症状观察等到先进的分子生物学技术，包括DNA探针、PCR技术的应用及脂肪酸分析、单克隆抗体的应用等等，但在目前检疫上仍采用免疫荧光染色结合致病性测定确诊的方法。症状观察梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。主要区别见（Zwet和Keill1979）分离培养对于症状明显材料可直接分离病原，而症状不明显的材料如水果、幼枝等，可先进行IF（免疫荧光法）检测，再进行分离。分离可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。MS培养基这是Miller和Schroth专为梨火疫病菌设计的选择性培养基。梨火疫病菌菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方如下：琼脂20g，甘露醇10g， L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠，磷酸氢二钾，烟酸，MgSO4·，次氮基三乙酸，硫酸十七烷基钠，溴麝香草酚兰水溶液9ml，中性红，蒸馏水970ml，灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液。CG培养基这是Cross和Googman设计的高糖培养基，梨火疫病菌在28℃培养60小时后形成典型的火山口状菌落，特别是在立体显微镜下。配方如下：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫（1%乙醇溶液），放线菌酮20ml。TTC培养基该培养基是Weise(1981)设计的四氮锉-福美联培养基。梨火疫病菌在27℃培养2～3天后，可产生红色肉疣状菌落。配方如下：营养琼脂37g，蔗糖100g，酵母粉5g，葡萄糖15g,水100ml，～。灭菌后加，福美联85～250ml。CCT半选择性培养基这是Tshimaru和Kios于1984设计的。梨火疫病菌 28℃培养48小时后，形成淡紫色透明菌落，中央颜色略深，配方如下：蔗糖10g；山梨醇10g；1%SDS30ml，结晶紫乙醇溶液2ml，营养琼脂23g，蒸馏水 970ml。灭菌后加入1%硝酸铯水溶液2ml和放线菌酮。Zeller改良高糖培养基梨火疫病菌在此培养基上27℃培养2～3天后，菌落大小为3～7mm，橙红色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋黄状中心环，表面光滑，边缘整齐。配方如下：牛肉浸膏8g，蔗糖50g，放线菌酮50mg，溴百里酚兰9ml，中性红，琼脂20g，水1000ml，。另外，梨火疫病菌在NA+5%蔗糖等培养基上，典型菌落果聚糖阳性，在紫外灯下无荧光。免疫荧光染色（IF）对于呈现梨火疫病症状的材料，可直接平板分离，后免疫学试验即可确诊。对于表面健康的材料，可能携带潜伏或附生的梨火疫病菌，可先用IF法筛选，若阳性，再分离和其他生理生化试验、致病性试验确诊。取样和抽提随机选取100株不同种或品种植株上约10cm长的100根枝条为一样品。每个样品随机抽取30根枝条，其余5℃保存备用。每根枝条切成4段（共120小段）。室温下将上述小段放于烧瓶，加吐温溶液浸泡，并振荡小时。上清液经烧结玻璃滤器（Whatman1号滤纸）过滤后，在10000g离心20分钟，沉淀用1ml灭菌的PBS悬浮，其中悬浮液加一滴 Difco甘油于-20℃保存备用。间接免疫荧光抗体染色(IFAS)采用抗梨火疫病菌的抗血清，设同源抗原对照及阴性对照、正常血清对照和空白对照。在12孔载玻片上，每孔加20ml试验悬浮液，及对照孔PBS。阳性菌等，火焰热固定后，各加2?l一定稀释度的抗血清，37℃保湿孵育30分钟，用轻轻换洗3次。洗干后每孔加20?l1:10稀释的FITC标记的Ig，37℃保湿孵育30分钟，同上洗、干后，每孔加1滴 的磷酸甘油封片，并在有上荧光光源和适宜滤光片的荧光显微镜下检查。观察形态典型的荧光细胞若IF阳性，再进行分离病原及有关试验。玻片凝集试验典型形成果聚糖，无荧光的菌落在载玻片上与1滴1:20稀释()抗梨火疫病菌的抗血清进行玻片凝集试验。生理生化试验在某些特定情况下，对形成果聚糖，凝集试验阳性，无荧光菌落进行生理生化鉴定及有关鉴定是必要的。最简单的途径是用IF和API-20快速生化鉴定板。致病性实验梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108cells/ml的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于1丈长的巴黎枝条，28℃下培养，一般10～12小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。1～3天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。其他鉴定方法梨火疫病的检测鉴定技术发展较快，其中目前应用较多有脂肪酸分析，该方法在美国、英国用于鉴定菌种，并建立了相应的数据库(Zwet)。另外，DNA探针、PCR技术亦用于梨火疫病菌的检测和鉴定，特别是美国、新西兰、德国、加拿大等均已开始应用于实际检疫，特别是新西兰利用DNA探针检测水果的带菌情况。