脂质体前体制剂研究论文

约30％的编码基因编码的膜蛋白（MPs）在众多生理过程中起着至关重要的作用。膜蛋白是超过FDA批准药物一半的靶标药物。需要在近乎生理条件下对功能性膜蛋白进行高分辨率的结构研究，以提供深入的机理理解并促进药物发现。随着单粒子冷冻显微镜（cryo-EM）的分辨率革命，分离的膜蛋白的结构阐明已取得了快速进展。下一个挑战是保留电化学梯度和膜曲率，以便对膜蛋白进行全面的结构阐明，而膜蛋白的生物学功能依赖于这些化学和物理特性。2020年7月17日，颜宁团队在PNAS 在线发表题为“Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome”的研究论文，该研究以特征明确的AcrB为原型，提出了一种方便的工作流程，用于对嵌入脂质体中的膜蛋白进行冷冻-EM结构分析。结合优化的蛋白脂质体分离，冷冻样品制备和有效的颗粒选择策略，以的分辨率获得了嵌入脂质体中的AcrB的三维（3D）重建。该研究方法可广泛应用于具有独特可溶域的膜蛋白的冷冻EM分析，为功能受跨膜电化学梯度或膜曲率影响的整体或外围膜蛋白的冷冻EM分析奠定了基础。生物膜包围着拓扑隔离的隔室，包括细胞和细胞器，并为各种完整的和外围的膜蛋白（MP）提供了栖息地。这些物理屏障使生命必需的电化学梯度得以生成和维持，这是由于离子和化学物质在整个不可渗透膜上的不对称分布所致。各种生理过程都取决于这些梯度，例如由质子梯度（质子动力）驱动的三磷酸腺苷（ATP）合成和依赖跨膜电场存在的动作电位。因此，许多膜蛋白，例如电压门控离子通道（VGIC）以及一级和二级活性转运蛋白，都依赖于跨膜电化学梯度来执行其生物学功能。除了驻留在膜的内部或表面之外，膜蛋白与膜之间的相互作用也对细胞寿命产生了深远的影响。例如，许多外周膜蛋白定义了细胞器形成的膜轮廓。FoF1 ATP合酶的二聚化在塑造线粒体cristate中起着重要作用。机械敏感通道通过部分由膜变形施加的机械力控制。当X射线晶体学是确定结构的主要方法时，解析膜蛋白的结构曾经极具挑战性。必须从破裂的膜中纯化出高度均质的膜蛋白，并用精心选择的去污剂取代以结晶。自2013年以来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析（SPA）已成为膜蛋白高分辨率结构解析的主流手段。已应用多种试剂将膜蛋白溶解为单个颗粒以进行分析。除了去污剂微团外，两亲，纳米圆盘和苯乙烯-马来酸脂质颗粒（SMALP）封闭的带有天然膜的纳米圆盘也已用于成功的膜蛋白冷冻-EM结构分析 。尽管取得了这些进步，但所有上述膜蛋白分离方法都破坏了膜的拓扑结构，即使在SMALP环绕的带有天然膜片的纳米盘的情况下，也消除了任何现有的电化学梯度和膜曲率。为了保留这些重要特性，使用电子冷冻断层扫描（cryo-ET）的原位结构分析可能是最终的解决方案。然而，当前的技术障碍阻止了使用cryo-ET的高分辨率原位结构测定。另一种替代策略是研究嵌入脂质体中膜蛋白的结构，该结构已广泛用于膜蛋白的功能分析。尽管使用蛋白脂质体进行了广泛的功能表征，但仅有有限的尝试将这种系统用于膜蛋白的结构阐明。在过去的十年中，已经开发了诸如随机球形约束（RSC）之类的方法来研究具有改进SPA策略的蛋白脂质体系统。但是，要在两个报告中执行精确的角度分配或信号减法，目标蛋白脂质体必须是接近完美的球体，这是很难获得的前提条件。两种方法都还需要对原始图像进行额外的预处理步骤。为了将cryo-EM用于嵌入或附着在脂质体上的膜蛋白的结构分析，有必要为膜蛋白掺入，冷冻样品制备和cryo-EM数据处理开发高度可重复且方便的工作流程。为此，研究人员选择了来自大肠杆菌的经过充分研究的耐多药转运蛋白AcrB作为方法开发的原型。质子梯度驱动的AcrB是一种三聚体，分子量约为350 kDa。它是即使在低纯度和低浓度下也最易于结晶的膜蛋白之一。因此，AcrB的结构是在早期确定的。到目前为止，在蛋白质数据库（PDB）中使用X射线晶体学和单颗粒冷冻EM方法测定的AcrB结构超过100种，为结构验证提供了极好的参考。在这项研究中，报告了一种工作流程，该流程具有优化的脂质体分离，低温样品制备，深层二维（2D）分类，用于数据处理。使用该研究的简化方法，获得了分辨率的蛋白脂质体中AcrB的重建。该工作流程可轻松推广到蛋白脂质体中膜蛋白的结构测定中，并为使用蛋白脂质体系统在受控的电化学势或膜曲率存在下膜蛋白的结构分析奠定基础。

大量关于药物制剂的新技术、新方法的出现为中药现代化提供了有效的技术手段,为实现中药的“三小”(剂量小、毒性小和不良反应小)“三效”(速效、高效、长效)和“五方便”(生产、运输、贮存、携带和服用方便)提供了可以借鉴的思路。笔者对近年来研究较多的分子包合技术、脂质体技术、固体分散技术、固体脂质纳米粒( SLN)技术、聚合物纳米粒技术、微乳技术等药物制剂新技术及其在现代中药研究中的应用作一综述。 1分子包合技术 分子包合技术主要指的是环糊精包合技术。环糊精( cyclodextrin , CD)的结构为内径016～110 nm环状中空的内疏水外亲水的圆筒状分子。形状和大小适合的亲脂性分子或基团能进入空腔,通过弱相互作用力形成超分子包合物。这种超分子包合物一方面可改善药物的多种理化性质和提高药物的生物活性,如增加药物的水溶性和稳定性、提高靶向性、促进透膜吸收、减少不良反应和刺激性、提高生物利用度等 ,另一方面环糊精分子使药物处于纳米级的分散状态,扩大了药物的吸收面积,并且具有缓释的效果。 许多从中药材中提取的有效成分和有效部位为疏水性物质,环糊精分子的内疏水外亲水结构可显著地增加这些物质的溶解度。齐墩果酸的β-环糊精包合物可使溶解度提高12倍,累积溶出率增大6倍。挥发油是中药中常用的一类化合物,但由于其高挥发性使其应用受到限制,利用环糊精分子的包合功能可有效地克服该缺点。缬草油是中药痉痛定的主要成分之一,但其挥发性强,对光敏感,对光和热不稳定,且油状液不易制粒。采用β-环糊精包合后,在加速试验的条件下其稳定性明显提高。环糊精不仅可以单独用于制备纳米载药系统,也可与其他载药系统联合应用,以达到进一步提高疗效,降低毒性的目的。环糊精在聚合物纳米载药系统中的应用也可得到类似的结果。可以预期,这些技术在中药疏水性有效成分或有效部位的应用同样会取得良好的效果。 2脂质体技术 脂质体用于药物载体的研究已经有三十余年的历史,技术已相对成熟。脂质体给药系统同样具有药物的缓释和靶向特性,增加药物在体内外的稳定性,降低药物的毒性,提高药物治疗指数的作用。与其他载药系统相比,脂质体所具有的结构可修饰性使开发具有特殊功能的载药系统如靶敏感脂质体、隐形脂质体、免疫脂质体成为可能。脂质体的粒径一般在几十纳米到几十微米之间, 纳米尺度的脂质体具有很高的稳定性。 20～50 nm的单层脂质体进入人体后,能增加药物在靶区的聚集,并能延长其在血液中的半衰期。脂质体的制备方法主要有超声分散法、微乳法、注入法及逆相蒸发法等。 脂质体用于中药制剂中的研究有一些报道。张中冕等制备了猪苓多糖脂质体并进行抗肝转移癌的研究,结果表明,脂质体包裹同等剂量的猪苓多糖能显著减少转移性肝癌结节的数目( P < ) 。采用适当的脂质材料还可以制备成靶向性强的脂质体。例如用含有pH敏感基团的脂质如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等制备的pH敏感脂质体不仅可增加脂质体的靶向性还可使其具有长循环特征。用聚乙二醇( PEG)修饰可制成温度敏感脂质体、通过单抗与脂质体连接可制成免疫脂质体。并可联合应用制成具有双重功能的脂质体如pH敏感的免疫脂质体等。这些研究为中药脂质体的研究提供了广阔的思路。药质体作为特殊的脂质类物质,药物通过共价键与脂质结合形成脂质前药,再按上述制备方法得到SLN。在药质体中药物与脂质形成的复合物既是活性成分又是载体,因而具有良好的生物相容性,可有效提高药物对生物膜的穿透能力。通过制备中药药质体的方法可促进某些中药的吸收,从而提高其生物利用度。 3固体分散技术 固体分散技术是指运用固体分散技术将药物高度分散于惰性的载体中,形成一种以固体形式存在的分散体。药物在载体中以分子聚集体、微晶或无定形形式存在。固体分散技术可显著地增加难溶性药物的溶出,提高其生物利用度。ER-34122是一种新的脂氧合酶和环氧化酶双重抑制药,但其水溶性非常差, Kushida等将其制备成羟丙基甲基纤维素(HPMC)的固体分散体,其溶解速度和溶出率均显著高于其物理混合物和纯化合物。近年来,随着技术的进步,具有各种功能的辅料被用于固体分散技术中,使其应用领域大大地拓展。单纯应用水溶性的辅料如聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 、聚乙二醇( PEG) 、尿素等可以__改善难溶性药物的溶出。加入难溶性的高分子材料如硬脂酸、乙基纤维素等可以使制备的固体分散体具有缓释的特征,同时水溶性的药物也可采用这种方式制备其缓释剂型,扩大了固体分散技术的应用对象。采用肠溶性的辅料如丙烯酸树酯、HPMC等可以制备定位于小肠释放的固体分散体。固体分散体常用的制备方法有共沉淀法、熔融法和溶剂熔融法,近年来一些新的方法也被用于固体分散体的制备,如超临界流体技术等。固体分散体为中间剂型,制备成固体分散体的药物可根据需要进一步制成片剂、胶囊、滴丸等制剂。 固体分散技术在中药的研究有着较广泛的应用,一般用于制备固体分散体的原料为中药的有效成分和有效部位。水飞蓟宾( silibinin) 是菊科植物水飞蓟(S ilybum m arianum Gaertn.)果实中的一种黄酮成分,具有保肝、降血脂、抗氧化等诸多药理活性,但由于它难溶于水,口服生物利用度低。邓莉等以尿素、PVP、泊洛沙姆188等为载体,用熔融法和共沉淀法制备水飞蓟宾固体分散体,显著提高了水飞蓟宾的溶解度和溶出速度。固体分散体由于制备工艺相对简单,效果明显已引起国内中药生产企业的广泛关注,并在临床上有广泛的应用。 4微乳技术 微乳由油、水、表面活性剂和助表面活性剂4部分组成,是一种粒径在10～100 nm之间的乳滴分散在另一种液体中形成的各向同性热力学稳定胶体分散系统。体系中表面活性剂的量一般> 10%。微乳液中同时存在水相和油相,具有良好的溶解性能,既能溶解非极性的疏水性药物,又能溶解极性的亲水性药物。根据油相和水相及乳化剂的性质和配比的不同,分别能形成油包水(W /O)和水包油(O /W)两种微乳液形式。因此,微乳作为纳米给药系统,可以增加难溶性药物的溶解度,提高水溶性药物的稳定性,提高药物的生物利用度,同时使药物具有缓释功能,降低药物的毒性。如Brime等制备了两性霉素B 的微乳,其半数致死量较同等剂量的常规制剂提高1倍多。 微乳的制备理论上不需要外力做功,即使在实际制备中也只需施加适当的外力即可,从而避免了高速搅拌、高剪切及高温等剧烈的条件,可有效地防止不耐高温的药物等的降解,并适合于工业化的制备。微乳具有较高的扩散性和皮肤渗透性,使其在透皮吸收制剂的研究方面受到极大关注。微乳技术在中药的外用制剂中具有较广阔的应用前景,吴永良等将含有红花、川芎、乳香、没药、当归 onmouseover="’hand’" onclick=当归_search11() value="当归">当归、樟脑、冰片等成分的油搽剂制备了用于外用的稳定的微乳剂型。注射用的中药乳剂如榄香烯乳注射液、薏以仁注射用乳剂等已有研究和应用报道,但注射用中药微乳笔者尚未见报道,根据微乳的特点,制备注射用的中药微乳应是可行的。 5SLN技术 SLN是由固体脂质制备的粒径在50～1 000 nm的纳米及亚微米载药系统。SLN常温下为固态,非毒性的表面活性剂如泊洛沙姆、卵磷脂等可用来稳定其结构。可采用已成熟的高压乳匀法进行制备,适用于工业化生产。另外,这种方法不使用有机溶剂,可以避免因有机溶剂残留而导致的潜在毒性。同时, SLN还具有药物控释和靶向特性,较高的载药量,改善药物的稳定性等优点。用于SLN制备的类脂材料有各种饱和脂肪酸如硬脂酸、棕榈酸、癸酸及其三酰、二酰、单酰甘油酯;表面活性剂有各种卵磷脂、泊洛沙姆系列、聚山梨醇酯、胆酸类、丁醇等。SLN的制备方法有超声或高剪切乳匀法、高压乳匀法、溶剂乳化蒸发法、微乳法等。陈大兵等以硬脂酸为载体材料制备了长循环的紫杉醇Brij固态脂质纳米粒(Brij-SLN)和PoronicF68固态脂质纳米粒( F68-SLN) ,延长了紫杉醇于体内的滞留时间。 6聚合物纳米粒技术 聚合物纳米粒是以人工合成或天然的可生物降解的高分子材料为载体制成的粒径在1～1 000 nm的载体系统。聚合物由于结构的可修饰性,在纳米给药系统的研究中占有重要的地位。药物包裹于载体材料中所形成的高分子纳米粒可以改变药物的体内分布,具有控释和靶向特性,增加药物的稳定性,提高药物的生物利用度。纳米粒在进入体循环后主要被网状内皮系统(RES)所吞噬,这为治疗RES系统丰富的器官和组织如肝、脾、骨髓的疾病创造了条件。另一方面,对于非RES系统的靶向给药,可以通过亲水性高分子链段修饰等隐形技术、抗体包裹技术或体外磁性导向技术等方法,减少RES系统对纳米粒的吞噬,延长体内的循环时间。 作为聚合物纳米粒的材料有聚乳酸( PLA) 、聚乙交酯( PLG) 、聚氰基丙烯酸酯系列( PCA) 、聚己内酯( PCL) 、聚乳酸2乙醇酸共聚物( PLGA) 、清蛋白、凝胶和壳聚糖等。制备方法主要有高分子分散法和单体聚合法两大类,包括溶剂乳蒸发法、超临界流体法、界面聚合法、盐析法等。Storm等用可生物降解的聚酐制备的喜树碱聚合物经颅内植入,可显著地延长神经胶质瘤大鼠的存活时间。聚合物粒子经过适当的修饰,还可制成能根据人体昼夜节律的变化而发挥作用的脉冲给药系统和自调节给药系统,如pH反应性及糖反应性的给药系统。也可修饰成受外界条件调节控制的给药系统如磁控制、热控制、超声控制给药系统等。 7结束语 综上所述,利用药物制剂新技术,开发中药的新制剂,可望解决中药剂型存在的生物利用度低、毒性等问题,目前所研究的药物制剂新技术对现代中药的研究在一定程度上具有可移植性。同时,由于这些技术中诸如脂质体技术、分子包合技术、固体分散技术及微乳技术和SLN中所采用的高压乳匀技术等已较为成熟,将这些技术应用于中药纳米新剂型的开发,技术上是可行的。

脂质体应该算是现在比较先进的药物载体技术，是有双层磷脂构成的小球，药物可以注入小球的中空部分。因为磷脂层与细胞膜的结构类似，可以与细胞膜融合，而将药物送入细胞核中。采用脂质体技术进行药物开发目前比较热门，如ALZA公司开发了阿霉素脂质体注射液，APHIOS公司开发的紫杉醇脂质体制剂等。脂质体药物普遍具有精确的靶向性和较强的缓释作用，使药物效力明显增强，并解决了很多药物伴随毒性以及特殊部位给药难的问题。