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樊栓狮，王燕鸿，郎雪梅
樊栓狮（1965－），男，教授，主要从事水合物研究，E-mail:。
华南理工大学化学与化工学院，广州510640
摘要：水合物生长过程研究是水合物形成、利用的重要基础。本文利用显微镜对TBAB水合物的微观形貌及生长特性进行了研究，结果表明：在3℃时32％的TBAB溶液可同时形成四棱柱、六棱柱及八棱柱不同形貌的单晶；随着TBAB水合物单晶的生长，表面出现缺陷或相互碰撞，从而引起单晶生长为交叉晶体，继而簇状晶体。不同形貌的单晶其生长速度不同，四棱柱体比八棱柱体具有更高的平衡生长温度，和相同条件下更快的生长速度，四棱柱体比八棱柱体受浓度影响更多，对浓度变化更敏感。
关键词：四丁基溴化铵；水合物；微观形貌；生长动力学
Study of Hydrate Microscopy Morphology and Growth Kinetics
Fan Shuanshi,Wang Yanhong,Lang Xuemei
School of Chemistry and Chemical Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510641 ,China
Abstract:Research of hydrate growth process is the base of hydrate formation and utilization.TBAB hydrate morphology and growth properties were investigated by microscopy in this paper.The results showed that quadrangular,six-prism,eight-prism crystal wereformed in 32 wt%TBAB solution under 3℃.With the crystal increase,single crystal could grow to cross crystal and then cluster crystal due to defect on the surface or encountered.The crystal growth kinetic study found that the growth rate of various morphology crystal is different.Quadrangular crystal has higher growth temperature and grow faster than eight-prism.
Key words:tetra-n-butyl ammonium bromide (TBAB) ; clathrate hydrate;microscopy morphology;growth kinetic.
0 引言
天然气水合物是在高压低温条件下由水和天然气形成的笼状固态物，广泛分布于大陆边缘陆坡区海底和永久冻土带，是目前研究的一种极有前景的替代能源[1]。我国在南海北部神狐海域钻探取得最高饱和度达48％的均匀分散状可燃冰样品，引起国际社会关注。天然气水合物潜在的能源前景、巨大的储气能力以及在环境方面可能引起的危害等，使其成为当代科学界的一个前沿研究热点。
气体水合物生成过程研究是水合物理论体系中重要的组成部分，对其生成过程的认识和了解的程度直接关系到地层中甲烷水合物的利用以及其储气性质在油工业中的应用等。四丁基溴化铵（tetra-n-butyl ammonium bromide，简称TBAB）是一种季铵盐，它与水生成的水合物的结构和化学性质都与天然气水合物近似，它的存在能够显著降低气体水合物的生成条件[1]，在常温常压下能与水分子结合形成半包络水合物晶体[2]，目前作为添加剂被广泛用于气体水合物的研究。常见的TBAB水合物有2种类型：A型和B型，研究比较多的是B型TBAB水合物，Shimada等[3-4]指出在TBAB·38H2O晶包中有2个可容纳小分子的512孔穴，可用于储存CH4、H2分子，如图1所示。TBAB与H2形成水合物的理想分子式为2H2· TBAB·38H2O（每个512孔穴填充1个H2分子）或4H2·TBAB·38H2O（每个512孔穴填充2个H2分子）。
图1 TBAB水合物结构示意图
目前的研究大多集中于纯TBAB水合物和TBAB－气体水合物的平衡条件等热力学性能等方面：Shimada等[3-5]研究了TBAB水合物晶体的生长形态；Oyama等[6-7]也报道了TBAB水合物形态；但对TBAB水合物的生长特性及生长动力学研究较少。本文利用自行设计的显微及成像系统研究TBAB水合物生长特性及生长动力学，从微观角度探讨水合物生长机理。
1 实验部分
1.1 实验装置
实验装置如图2所示，本实验装置可以对TBAB水合物的生长过程进行动态观测及记录。实验装置包括四大部分，Carl Zeiss Axio Observer倒置显微镜为主体的用于水合物微观研究的显微及成像系统；低温恒温冷台（材料不锈钢，可视区域Φ50 mm×30 mm）；图像采集及处理系统，包括：数码摄像机（IMAGING Micro Publisher 5.0RTV），电脑终端及图像处理软件（Simple PIC）；温度控制系统，包括恒温水浴（Huber-ministat 240，控温范围：－40～40℃，控温精确：0.01℃）、数据采集仪（Agilent，采样频率：次/10秒）和自制热电偶（J型，测温精度0.1℃）。
图2 TBAB水合物微观生长实验平台
1.2 试剂
实验所用材料为广州化学公司提供99%TBAB和自制蒸馏水。
1.3 实验方法
将TBAB按32％的浓度配制待用溶液。在实验前用蒸馏水将冷台反复清洗3次，并用32%TBAB溶液冲洗2遍。打开控温系统，调节水浴温度，使冷台温度达到实验预设值3℃。用量筒量取10 m L 32%TBAB溶液加入冷台，观察TBAB水合物晶体生长情况，并随时记录。
2 实验结果
2.1 TBAB水合物晶体形状
图3为实验过程中观察到的TBAB水合物单晶形貌。从图中可以看到，TBAB水合物单晶出现了四棱柱（a、b），六棱柱（c）和八棱柱（d) 3种形态。对于四棱柱型单晶根据其端面不同又可分为凹面四棱柱（a）和凸面四棱柱（b)2种。其中以四棱柱和八棱柱最为常见，六棱柱数量极少。
图3 TBAB水合物单晶形貌
2.2 水合物生长特性
图4为生长过程中拍摄的TBAB水合物生长照片。从图中可以看到，在TBAB水合物生长的同一时刻，溶液中同时存在多种晶体形态，包括柱状的单晶，交叉晶体以及簇状晶体。在生长不同时刻观察发现（统计结果）：在生长早期，以柱状单晶为主，交叉晶体数量次之，簇状晶体最少；在生长中期，柱状晶体、交叉晶体以及簇状晶体数量接近；在生长晚期，以簇状晶体和交叉晶体为主，柱状单晶数量明显减少。说明在TBAB水合物晶体生长过程中，水合物晶体最初以单晶形式出现，随着溶液中单晶的生长和数量的增加，开始出现交叉晶体，最终发展为簇状晶体。
图4 TBAB水合物微观生长照片
在TBAB晶体生长过程中还发现，从单晶向交叉晶体或簇状晶体发展有2种情况：一是单晶在不断地长大过程中晶体表面出现缺陷，而后这些表面缺陷作为基面，诱导晶体继续生长，如图5所示，称为缺陷诱导生长；此诱因生长的晶体与母晶晶体形貌相同（同为四棱柱或八棱柱）。二是随着单晶不断出现，溶液中单晶数量不断增加，在单晶自由运动过程中单晶之间或单晶与晶簇间发生碰撞而联结继续生长，如图6所示，称为嫁接生长；此诱因生长的晶体形貌各异。通常情况下，在同一单晶或晶簇上缺陷诱导和嫁接生长同时存在。
图5 缺陷诱导生长示意图
图6 嫁接生长示意图
2.3 水合物生长动力学
TBAB水合物晶体的生长是各向异性的，轴向生长快，径向生长速度缓慢。对TBAB水合物晶体的生长过程进行原位拍摄，可实现对晶体生长过程的观察。图7为一组TBAB水合物生长前后的叠加照片，1、2、3分别标出了其中3个晶体生长前后的端面位置。从照片中可以明显看到TBAB水合物晶体沿轴向的生长。在生长的不同阶段，水合物晶体的生长速度也有所差异。记录不同时刻晶体的生长，可以得到在一定时间内TBAB晶体生长的长度，列于图8。
图7 TBAB水合物晶体生长前后叠加图
图8 TBAB水合物晶体长度
由于生成的六棱柱晶体极少，故其生长过程未拍摄到。因此，本文主要针对四棱和八棱晶体进行生长动力学分析。图8为拍摄时间内晶体的四棱、八棱晶体的生长长度，图中一条直线表示一个晶体长度随时间的变化，故每条直线的斜率则代表该晶体的生长速度。根据不同时间TBAB水合物晶体生长长度l可计算出晶体生长速度dl/dr，其中τ为时间。将拍摄时间内的晶体生长视为匀速，可获得晶体平均生长速度，见图9。
图9 TBAB水合物晶体生长速度
如图9所示，四棱和八棱晶体的生长速度随时间而减慢。水合物开始生长初期，四棱晶体最大生长速度为0.7893μm/s，八棱晶体的最大生长速度为0.7104 μm/s。随后，2种晶体生长速度呈线性降低的变化趋势，至300 min时，四棱、八棱晶体生长速度分别降低至0.0354 μm/s、0.0410μm/s。Shimada等[5]在其报道中指出TBAB晶体的生长速度与过冷度的关系为：
南海天然气水合物富集规律与开采基础研究专集
依据这一关系可知，本研究中晶体在10℃条件下的生长速度（0.0354μm/s～0.7893μm/s）明显小于通过式（1）计算所得的速度。显然，造成这种差别的原因主要是本研究中TBAB溶液浓度明显低于文献报道的溶液浓度。而且，晶体生长过程中，浓度会影响质量传递，从而会影响晶体生长的速度[8]，这也是造成生长速度变化的原因。
从图9通过线性拟合可得四棱、八棱TBAB水合物晶体的生长速度表达式（2），其中dlT/dt表示四棱晶体的生长速度，dlO/dt表示八棱晶体的生长速度。
南海天然气水合物富集规律与开采基础研究专集
式中：k为结晶速率常数，t为结晶时间，C是与水合物形成环境有关的常数，本研究中则主要受浓度影响，n为反应级数，c为溶液浓度。溶液浓度随时间变化。如图10所示。图10为不同时刻水合物生长过程中TBAB的浓度。溶液浓度c随着水合物生长时间t的增加而逐渐降低，拟合得到浓度随时间的变化关系为
南海天然气水合物富集规律与开采基础研究专集
图10 TBAB水合物生长过程溶液浓度变化
将式（3）代入（2）中，最终可得：
四棱柱晶体：
kT=23.1250,
CT=-0.6619,
nT=0.9251；
八棱柱晶体：
kO=17.0780,
Co=-0.6618,
nO=0.8686。
可见，四棱柱晶体的结晶速率常数大于八棱柱晶体，即kT> ko，通过反应动力学基本理论可知，四棱体比八棱体具有更高的平衡生长温度，且相同条件下具有更快的生长速度。由图9可知，随TBAB溶液浓度的降低，四棱晶体的生长速度比八棱晶体降低的快，这是受反应级数n影响。反应级数是反应浓度变化对反应速率影响程度的常数。显然，四棱晶体的反应级数大于八棱晶体，说明四棱晶体生长速率受浓度变化的影响更大，因此，当浓度降低时，四棱晶体的生长速度则降低的更快。依据式（2），本研究计算了浓度为40wt％时TBAB晶体的生长速度，与Shimada等[5]研究中提供的数据比较接近。
3 结论
1）本文利用显微经观察了32%TBAB溶液中水合物的形貌及其生长。TBAB水合物晶体出现四棱柱、六棱柱和八棱柱单晶。在水合物不同的生长阶段，不同形状的晶体共同存在，统计计算在生长初期以单晶为主，生长中期以交叉晶体居多，生长后期主要出现簇状晶体。根据水合物生长的成因可分为诱导生长和嫁接生长2种。
2）不同形貌的单晶其生长速度不同。四棱柱体比八棱柱体具有更高的平衡生长温度，和相同条件下更快的生长速度，四棱柱体比八棱柱体受浓度影响更多，对浓度变化更敏感。
参考文献
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高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
显微镜的发展历史：最早的显微镜是16世纪末期在荷兰制造出来的。发明者是亚斯·詹森，荷兰眼镜商，或者另一位荷兰科学家汉斯·利珀希，他们用两片透镜制作了简易的显微镜，但并没有用这些仪器做过任何重要的观察。后来有两个人开始在科学上使用显微镜。第一个是意大利科学家伽利略。他通过显微镜观察到一种昆虫后，第一次对它的复眼进行了描述。第二个是荷兰亚麻织品商人列文虎克，他自己学会了磨制透镜。他第一次描述了许多肉眼所看不见的微小植物和动物。1931年，恩斯特·鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。这使得科学家能观察到像百万分之一毫米那样小的物体。1986年他被授予诺贝尔奖。显微镜是人类20世纪最伟大的发明物之一。在它发明出来之前，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
20世纪30年代，电子显微镜的发明使神秘的病毒终于现出了真身，只是电子显微镜的原理决定了它无法用于活细胞的观察及获取生物活动的动态信息，而攻克致病病毒，需要深入了解病毒在活细胞内感染、复制及释放的动态过程。大部分高级光学显微镜及电子显微镜中都配置了相衬部件。相衬显微镜在细菌学、病理学等方面应用广泛，生物学研究因此有了极大突破(泽尼克因论证相衬法及发明相衬显微镜的贡献获1953年诺贝尔物理学奖)。1935年，奥地利的马克斯·海廷格(Max Haitinger)等人改进了生物组织标本的染色技术，用荧光色素染色来标记不能自发荧光的特定组织成分、细菌和其它病原体，标本的荧光亮度增强了，在荧光显微镜下可观察到生物组织的续发性荧光。20世纪50年代，随着荧光抗体标记方法及荧光显微镜装置的改进，荧光技术的应用逐渐推广。1958年，唐尼斯与亚瑟·肖洛(Arthur Schawlow)在《物理评论( Physical Review )》杂志上发表论文，阐述了研制激光器的可能性以及所需的条件，指出这种激光具有亮度极高、单色性好、方向性好的特点。1960年5月16日，梅曼在自己研制的红宝石激光器上成功获得了波长为694.3纳米的激光。7月7日，休斯公司正式宣布了这个消息。此后，不同工作物质的激光器陆续研制出来，如氦氖气体激光器、二氧化碳激光器等，激光在各领域的应用研究也迅速展开。1978年，德国的托马斯·克里默(Thomas Cremer) 和克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)兄弟首次提出了共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope，简称CLSM) 的设计方案：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，用激光聚焦逐点扫描方式结合荧光标记生物样品的三维探测方法，通过计算机处理手段重构生成三维图像(与扫描电子显微镜类似)。
原理：显微镜以显微原理进行分类可分为光学显微镜与电子显微镜和数码显微镜。光学显微镜通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。无疑光学部分是最为关键的，它由目镜和物镜组成。早于1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜（普通光学显微镜）、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜。电子显微镜电子显微镜有与光学显微镜相似的基本结构特征，但它有着比光学显微镜高得多的对物体的放大及分辨本领，它将电子流作为一种新的光源，使物体成像。自1938年Ruska发明第一台透射电子显微镜至今，除了透射电镜本身的性能不断的提高外，还发展了其他多种类型的电镜。如扫描电镜、分析电镜、超高压电镜等。结合各种电镜样品制备技术，可对样品进行多方面的结构 或结构与功能关系的深入研究。显微镜被用来观察微小物体的图像。常用于生物、医药及微小粒子的观测。电子显微镜可把物体放大到200万倍。台式显微镜,主要是指传统式的显微镜,是纯光学放大，其放大倍率较高，成像质量较好，但一般体积较大,不便于移动,多应用于实验室内,不便外出或现场检测。显微镜的使用方法：利用自然光源镜检时，最好用朝北的光源，不宜采用直射阳光；利用人工光源时，宜用日光灯的光源。镜检时身体要正对实习台，采取端正的姿态，两眼自然张开，左眼观察标本，右眼观察记录及绘图，同时左手调节焦距，使物象清晰并移动标本视野。右手记录、绘图。镜检时载物台不可倾斜，因为当载物台倾斜时，液体或油易流出，既损坏了标本，又污染载物台，也影响检查结果。镜检时应将标本按一定方向移动视野，直至整个标本观察完毕，以便不漏检，不重复。显微镜的重光为对光，接物镜的转换及光线的调节。观察寄生虫标本时，光线调节甚为重要。因为所观察的标本如虫卵、包囊等，均为自然光状态的物体，有大有小，色泽有深有浅，有的无色透明，而低倍、高倍接物镜转换较多，故须随着镜检时对不同标本和要求，需要随时调节焦距和光线，这样才能使观察的物象清晰。在一般情况下，染色标本光线宜强，无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱，高倍镜观察光线宜强。注意事项：（1）使用显微镜之前，应熟悉显微镜的各部名称及使用方法，特别应掌握识别三种接物镜之特征。（2）寄生虫学实习中所观察的标本，大多数为无色和颜色较浅，因此必须注意光线的调节。（3）新鲜标本观察时，须加盖玻片，以免标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀接物镜，同时可使标本表面匀平，光线得以集中，有利于观察。
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. 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【显微镜的主要构造】 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 1.机械部分 （1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 （2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 （4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 （5）物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 （6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 （7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 ①粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 ②细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。 2．照明部分 装在镜台下方，包括反光镜,集光器。 （1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 （2）集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 ①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 ②光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。 3.光学部分 （1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。 （2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。 显微镜的成像原理】 当把待观察物体放在物镜焦点外侧靠近焦点处时，在物镜后所成的实像恰在目镜焦点内侧靠近焦点处，经目镜再次放大成一虚像。观察到的是经两次放大后的倒立虚像。【显微镜的分类】 显微镜分光学显微镜和电子显微镜。 光学显微镜是在1590年由荷兰的杨森父子所首创。现在的光学显微镜可把物体放大1500倍，分辨的最小极限达0.2微米。光学显微镜的种类很多，除一般的外，主要有暗视野显微镜一种具有暗视野聚光镜，从而使照明的光束不从中央部分射入，而从四周射向标本的显微镜.荧光显微镜以紫外线为光源，使被照射的物体发出荧光的显微镜。 电子显微镜是在1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。这种显微镜用高速电子束代替光束。由于电子流的波长比光波短得多，所以电子显微镜的放大倍数可达80万倍，分辨的最小极限达0.2纳米。1963年开始使用的扫描电子显微镜更可使人看到物体表面的微小结构。 光学显微镜的分类，根据照明方法，有透射型与反射(落射)型二种。透射型显微镜是应用透射照明通过透明物体的打光方法。反射型显微镜是以物镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。另一种分类方法，系根据观察方法的差异，分为明视野显微镜、暗视野显微镜、相位差显微镜、偏光显微镜、干涉相位差显微镜、荧光显微镜等。每种显微镜一般又各有透射型和反射型二种。在这些显微镜中，特别是明视野显微镜是构成所有显微镜中组成最基本的基础。通过这种显微镜观察的物体，穿过透过(吸收)率、反射率，因场所不同而各不相同，这种物体被称为随照明光强度(振幅)变化振幅物体，无色透明物体只有在照明相位改变时，才能被肉眼观察到，由於明视野显微镜不能改变相位，所以对透明不染色标本不能被观察到。 光学显微镜是为了使肉眼看不清楚的标本影像，人们设想经过一种装置，使肉眼能够观察到该标本组织形态和其间的结构。这种设想的装置就被后人创造问世了。当前广泛应用在各种微小物体的观察、测定、分析、分类、鉴定等。在波长范围上也不限於可见光波段(4000~7000 )而且(＞2000 )到红外(1~2u)以及用眼睛观察、显微、摄影和一般辐射检测器放大。 显微镜的综合倍率是物镜倍率G1与目镜倍率G2的乘积，G＝G1×G2。G1是1~100倍，G2是5~20的范围。 数值孔径(Numerical Aperture)N.A.是决定物镜的分辨率、焦深、图像亮度的基本数据，当物镜焦点对好后，物镜前透镜最边缘处的倾斜光线与显微镜光轴所交角成α，此即该物镜的半孔径角设标本数据空间的折射率为n，则N.A.＝n×sinα。 n通常在空气中为1，在物镜与标本间浸入水、甘油、油脂时，该标本折射率，即随浸液不同而异。这种物镜称为浸液系物镜；如是空气时，称为干燥系物镜。 在显微镜上，限制视野的装置是视野光圈。以物镜侧观看这种视野光圈时的直径以mm单位表示的值称为视野数。实际视野＝视野。 实际视野＝视野数／物镜倍率 例如，视野数为20，则10×物镜就观看2mm视野范围。应用聚光镜时，根据可变的视野光圈，再决定选用聚光镜的N.A.值，其值是取决於可变聚光镜孔径光圈来确定。 显微镜的发明，使人看到了许多以前从未看到过的生物，如细菌、病毒等，也使人看到了生物的许多微小结构，如线粒体的结构，从而对生物学的发展起着重要的推动作用。显微镜是生物学研究的重要仪器之一。在医学、工农业生产中显微镜也有着重要用途，例如在医学诊断上，可对人血液中的红细胞进行计数等。 十九世纪中期，人们发明了光学显微镜。 1665年，英国学者虎克(Robert Hooke)设计制造了首架光学显微镜，当时放大倍数为40~140倍，并用此首次观察并描述了植物细胞，同年发表《显微图谱》一书。 此后，荷兰学者列文·虎克(A。V。Leeuwenhoek)用自己设计的更先进的显微镜观察了动物细胞，并描述了细胞核的形态。直到今天，光学显微技术已从普通复式光学显微技术发展为荧光显微技术、共焦点激光扫描显微镜技术、数字成象显微镜技术、暗场显微镜技术、相差和微分干涉显微镜技术和录像增加反差显微镜技术等等。 可见，光学显微技术已成为人类认识微观世界的必要工具，借助它，使人们认识了细胞。然而，准确的理论计算表明，光学显微镜质量无论无何改善--不论是用多少组镜片，使用油镜头还是加强光源，放大率至多1000~1500，分辨本领至多 。这就成为人类认识更小的物体：病毒和分子、原子的瓶颈问题。 著名物理学家海仑霍尔等人在理论上证明：限制光学显微镜分辨本领及放大率的因素是光的波长。因而人们转向寻找一种成像媒介--波，它具有可视、可拍摄照片、波长短、且能用装置改变波的运动路线的特点。 20世纪初，恰伊斯发明了紫外光显微镜，使分辨率有了大提高 ，这是一次质的飞跃，但紫外线仍不是最好的成像媒介，不能满足科研和生产需要。 1926年，德国科学家蒲许指出，具有轴对称性的磁场对电子束起着透镜作用。可惜研究者没有考虑到利用它放大物体。 1932年，柏林科工大学压力实验室的年轻研究员卢斯卡和克诺尔对阴极射线示波器做了一些改进，成功得到放大几倍后的铜网图像，这大大鼓舞了人们，确立了电子显微法。 1933年底，卢斯卡制成了能放大一万倍的电子显微镜，并拍摄了金属箔和纤维的放大像。使电子显微镜的放大倍数超过了光学显微镜。 1937年，柏林科工大学的克劳塞和穆勒成功的制出了分辨率为纳米级（10-9m）的电子显微镜，西门子公司得知后，将主要精力转到适用电子显微镜的制造上，并聘请了卢斯进行研究。次年，西门子公司第一批分辨率为 的电子显微镜上市。 随后，在人们的研究下，电子显微镜的质量不断提高。如今，其分辨率和放大倍数使人们能更准确地认识了病毒、分子、原子和夸克。 【暗视野显微镜】 暗视野显微镜由于不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不可能观察到任何物体，当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。在暗视野观察物体，照明光大部分被折回，由于物体(标本)所在的位置结构，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的变化。 【相位差显微镜】 相位差显微镜的结构： 相位差显微镜，是应用相位差法的显微镜。因此，比通常的显微镜要增加下列附件： (1) 装有相位板(相位环形板)的物镜，相位差物镜。 (2) 附有相位环(环形缝板)的聚光镜，相位差聚光镜。 (3) 单色滤光镜-(绿)。 各种元件的性能说明 (1) 相位板使直接光的相位移动 90°，并且吸收减弱光的强度，在物镜后焦平面的适当位置装置相位板，相位板必须确保亮度，为使衍射光的影响少一些，相位板做成环形状。 (2) 相位环(环状光圈)是根据每种物镜的倍率，而有大小不同，可用转盘器更换。 (3) 单色滤光镜系用中心波长546nm(毫微米)的绿色滤光镜。通常是用单色滤光镜入观察。相位板用特定的波长，移动90°看直接光的相位。当需要特定波长时，必须选择适当的滤光镜，滤光镜插入后对比度就提高。此外，相位环形缝的中心，必须调整到正确方位后方能操作，对中望远镜就是起这个作用部件。 【视频显微镜】 将传统的显微镜与摄象系统，显示器或者电脑相结合，达到对被测物体的放大观察的目的。 最早的雏形应该是相机型显微镜，将显微镜下得到的图像通过小孔成象的原理，投影到感光照片上，从而得到图片。或者直接将照相机与显微镜对接，拍摄图片。随着CCD摄象机的兴起，显微镜可以通过其将实时图像转移到电视机或者监视器上，直接观察，同时也可以通过相机拍摄。80年代中期，随着数码产业以及电脑业的发展，显微镜的功能也通过它们得到提升，使其向着更简便更容易操作的方面发展。到了90年代末，半导体行业的发展，晶圆要求显微镜可以带来更加配合的功能，硬件与软件的结合，智能化，人性化，使显微镜在工业上有了更大的发展。【荧光显微镜】 在萤光显微镜上，必须在标本的照明光中，选择出特定波长的激发光，以产生萤光，然后必须在激发光和萤光混合的光线中，单把萤光分离出来以供观察。因此，在选择特定波长中，滤光镜系统，成为极其重要的角色。 萤光显微镜原理： (A) 光源：光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。 (B) 激励滤光源：透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。 (C) 萤光标本：一般用萤光色素染色。 (D) 阻挡滤光镜：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光，在萤光中也有部分波长被选择透过。【偏光显微镜】 偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。 （1）偏光显微镜的特点 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。 （2）偏光显微镜的基本原理 偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台。 【超声波显微镜】 超声波扫描显微镜的特点在于能够精确的反映出声波和微小样品的弹性介质之间的相互作用，并对从样品内部反馈回来的信号进行分析！图像上（C-Scan）的每一个象素对应着从样品内某一特定深度的一个二维空间坐标点上的信号反馈，具有良好聚焦功能的Z.A传感器同时能够发射和接收声波信号。一副完整的图像就是这样逐点逐行对样品扫描而成的。反射回来的超声波被附加了一个正的或负的振幅，这样就可以用信号传输的时间反映样品的深度。用户屏幕上的数字波形展示出接收到的反馈信息（A-Scan）。设置相应的门电路，用这种定量的时间差测量（反馈时间显示），就可以选择您所要观察的样品深度。【解剖显微镜】 解剖显微镜，又被称为实体显微镜或立体显微镜，是为了不同的工作需求所设计的显微镜。利用解剖显微镜观察时，进入两眼的光各来自一个独立的路径，这两个路径只夹一个小小的角度，因此在观察时，样品可以呈现立体的样貌。解剖显微镜的光路设计有两种： The Greenough Concept和The Telescope Concept。解剖显微镜常常用在一些固体样本的表面观察，或是解剖、钟表制作和小电路板检查等工作上。
显微镜属于一种常用的实验仪器，在我们使用显微镜的过程中有些是需要我们注意的事情，稍不注意就容易造成显微镜的损坏。（1） 初次使用显微镜，首先应了解显微镜的基本原理及各部件的作用，详细了解其操作规程。（2） 显微镜的物镜和目镜是显微镜的主要光学部件，装卸时应格外小心，不得用手摸透镜。对于透镜上的灰尘、油脂、污垢，不能用手或手帕去擦，以免在镜头上留下划痕及赃物，而应用软毛刷或镜头纸轻轻擦拭；难于除去的玷污可用药棉签沾二甲苯擦拭。注意不能用酒精或乙醚等溶液，以为镜头上的粘接胶会被这些溶液溶解掉。油浸系物镜使用后，也要及时用二甲苯清洗。（3） 作显微观察用的样品要干净，不得残留有酒精和腐蚀剂，以免腐鉵物镜。（4）调焦时，应先粗调，后微调。为了避免试样与物镜碰撞，应先使物镜靠近试样（但不能接触），然后一面用双手调焦，使物镜慢慢离开试样，直至看清楚为止。（5） 显微镜使用完毕后，应将载物台降到最低点，这样可避免粗调和细调螺丝因长期受载发生变形，增加磨损。（6） 显微镜对潮湿、高温、灰尘、腐鉵气体、震动等因素十分敏感，因此放置显微镜的房间应该清洁、干燥、通风、并远离震源。
自己写吧，我给你举个栗子：发现问题】今天早晨，我去学校大操场打扫卫生。因为是初秋，不断地有梧桐树的叶子往下落。我无意中发现一个有趣的现象，那就是——落在地面上的梧桐树的叶子绝大部分都是背朝上？这是为什么呢？【提出猜想】我随手从地上捡起一片落叶，仔细地观察起来：只见叶面比较光滑，而叶背却很粗糙。我猜想：会不会是叶面密度大，叶背密度小的原因？因为地球引力的作用，树叶落地时，它密度大的一面先着地，叶背就朝上了。回家后我把这个发现告诉妈妈，妈妈说：“你的猜想有一些道理，但必须通过实验来验证。”在妈妈的帮助下，我开始行动起来，【实验过程】动手剪一剪我首先找来几张画画用的的厚素描纸，又问妈妈要了几张薄薄的彩纸，然后剪成一片片树叶的形状，再分别把一片厚的纸树叶和一片薄的纸树叶涂上胶水，并重叠着用粘贴在一起，就这样，一共做了20片双层纸树叶。上楼抛一抛我紧紧地握着这20片纸树叶爬上学校的三楼，妈妈站在楼下大声喊：“一、二、三，扔！”我立即松开手掌，把手中纸树叶向空中撒去，只见纸树叶像漂亮的大蝴蝶，轻盈地飘向大地，五彩缤纷，好看极了，惹来了一群看热闹的同学。认真数一数我跑下楼，开始认真数了数，我一共抛下20片纸树叶，其中有18片用厚素描纸剪的那一面都是朝上的。我兴奋极了！妈妈说：“一次实验并不能说明什么问题，同样的实验，至少做三次。”于是，我捡起地上的纸树叶，又一次跑上了三楼，开始了第二、第三轮实验。用笔记一记我把三次的实验结果记录了下来：实验次数 抛下的纸树叶片数 厚素描纸一面朝上的片数第一次 20 18第二次 20 19第三次 20 17动脑想一想根据三次的统计结果，每次抛下20片纸树叶，每次厚素描纸一面朝上的平均几率是18片。由此可见，我的猜测是有道理的，落叶的背面一定比正面轻。再次看一看教我们科学课的马老师对我的小研究很感兴趣，为了再一次验证我的想法，他主动借了一架显微镜给我，并指导我进一步观察落叶的组织构造。我通过显微镜观察发现：叶面的细胞呈长方形，排列规则；而背的细胞呈块状，排列不规则。上网查一查马上去带着我上网查阅了一下资料，资料上说：“叶面的细胞叫栅栏组织；叶背的细胞叫海绵组织。栅栏组织排列紧密，含有大量的叶绿素，他们主要用于接收光能，利用空气中的二氧化碳制造大量的有机物，密度较大；海面组织排列疏松，叶绿素较少，主要用于贮存植物内部产物和水，密度较小。因此不仅叶面的颜色通常比叶背鲜艳，它的重量也比较大。”【得出结论】哈哈，现在我终于明白了：植物的落叶大多数是叶背朝上，叶面朝下，这并不是秋风玩的把戏，而是由叶子的内部特殊结构造成的。【图片资料】清晨，我在校园里扫落叶，发现了一个奇怪的现象。为什么大多数落叶都是背朝上呢？我用厚素描纸和彩色薄纸做纸树叶数一数，一共做了20片我把20片树叶从楼上抛下来哇！奇迹发生了，绝大部分纸树叶都是厚素描纸的一面朝上。采集一片落叶作标本，我要仔细观察一下叶片的构造。哈哈，我终于看到了叶面细胞和叶背细胞的不同构造。
夏天，在路边、在草丛中，经常可以看到一种形体像蛇，身体有鳞片的四脚蛇。听人说，四脚蛇有毒，要是被它咬了，皮肤会红肿，继而腐烂。四脚蛇是不是真的有毒呢？为了探个究竟，我们兴趣小组进行了研究。首先，我们捉来一条四脚蛇，把它麻醉后，放在解剖盘上固定。然后用一次性针筒在它的嘴里吸取0.5ml唾液，倒入烧杯再加入3ml水，使唾液和水均匀混合，接着将一只小青蛙放入其中，一小时后，青蛙安然无恙。是不是时间太短？就让它呆一晚上吧。结果第二天早上，我们发现小青蛙还没死，自由自在地在水中游，挺惬意的。是不是浓度太低了呢？为了使我们的实验准确可靠，我们又到太田野里抓了四条四脚蛇，按昨天同样的方法进行了实验，结果，小青蛙还是没死。由此看来，四脚蛇对小青蛙没有致毒作用。那么四脚蛇对其他动物是否有影响呢？我们抓来一只花猫，把0.9ml唾液涂在猫的身上，观察是否有异常情况，结果，两天之后，我们发现猫毫发未伤。至此，我们开始对人们关于四脚蛇的危言有所放松，并进一步增加 对四脚蛇毒性研究的决心和信心。我们决定在自己身上做实验，研究四脚蛇对人是否用影响。我们从四脚蛇的嘴里吸取了0.5ml唾液涂在自己身上，刚开始觉得皮肤有点凉，但一会儿，就什么感觉也没有了，无不良反应。半小时后，皮肤仍旧无反应。由此说明，四脚蛇对我们人类皮肤没有致毒作用。通过以上实验与研究，我们明白了四脚蛇对人类并没有毒。经过查阅《小博士知识库》，我们还知道四脚蛇其实就是蜥蜴和石龙子，它们主要分布在我国广东、浙江等地，以食用蚊子、苍蝇、螳螂等害虫为主，是人类的好朋友，我们应该保护它们。[点评]：四脚蛇有毒，那时听别人说的，是否真是这样，小作者用自己的实际行动探了一个“究竟”，本文叙述的是自己“探”的过程。因为四脚蛇有无毒性不清楚，所以先选择在动物的身上实验，目的是为了确保实验者的安全，说明小作者的安全意识很强。也只有在动物的身上得出没有毒性的初步论断，才能在人的身上进行实验。对一系列的实验数据分析之后，最终得出的结论是四脚蛇对人类并没有毒。当然，“涂”并没有与血液接触，其结论是否成立还有待于进一步实验。实验后，小作者并没有结束探究活动，而是继续查阅资料，发现“夏天，在路边、在草丛中，经常可以看到一种形体像蛇，身体有鳞片的四脚蛇”其实就是蜥蜴和石龙子，它们是人类的好朋友，还呼吁我们应该保护它们。试想，文章的小作者如没有对人们的这一说法产生质疑、好奇，而是听之任之，他永远不会认识真相。科学的真实性需要我们像小作者一样，勇于实践。启示一；先对其他动物实验，再以身试“毒”，这是智慧加勇气的体现，可敬可佩！但以身试“毒”还是不提倡。启示二：《小博士知识库》等书籍是我们的好朋友，在这当中肯定还有“为什么四脚蛇形体像蛇，身体有鳞片等特点”的知识，小朋友想知道的话，你知道该怎么做了。
这个星期三下午第一节课是科学课，在课前科学唐老师让我与另外几个同学把她办公室里的显微镜全部搬进教室，当教室里的同学看见我拿着显微镜踏进教室便开始交流起来：“这次我们要用显微镜观察什么呢？”上课铃响了，唐老师示意大家安静，然后说：“进行今天的活动前先回顾一下上一节课的内容：显微镜分为哪几个部分？细胞是谁命名的？显微镜的发明者是谁？”还没等老师问完，大家就齐声说出了一连串的答案：“显微镜分为镜座，镜臂，目镜，物镜，转换器，载物台……”“嗯，答得不错。今天我们来用显微镜观察动物表皮细胞，观察后画在记录本上。”大家领到显微镜和切片后，我与同桌熟练地完成了对光调焦工作，动物表皮细胞出现在我的眼前：许多像细毛的线状物由中心向外发散，这样的小个体在我观察的区域中就有数十个，这些对动物起到了很好的保护作用。将观察结果认真地画在记录本上后，唐老师又发给大家一个彩色的切片，上面写着“植物茎秆切片”。刚拿到这个切片时，我心想：“植物茎秆切片与之前的两个切片又有什么不同之处呢？”把切片放到显微镜的载物台上，用压片压好，调整好目镜、物镜和准焦螺旋后定睛一看，直径一厘米左右的切片被淡色的线分成了三个主要部分，最外面的环形一共有三排小的管道，中间的环形有两排小的管道，最里面的环形有一排相对较粗的管道。原来就是这些小管道为植物输送着水分、养料，植物才能蓬勃地生长，枝繁叶茂。而这些“功臣”，平常用肉眼是根本看不见的。电子显微镜下的世界更加神奇美妙。将一根头发放大100倍左右就可以看见层叠的波纹。厨房的抹布放大后更像森林，彩色的细菌、真菌、酵母菌和霉菌组成了它。鹅的羽毛则更像活力无限的小草，细毛成了一片片叶子。一颗海盐是由一颗颗极小的方块颗粒组成的……这神奇无比的显微镜把微观世界放大了，让人们领略到一种别样的美丽。没有它们，精细的手术将无法完成，一些特殊的实验同样不能完成，它已经成为科学、医学等研究领域不可缺少的工具。
在动物世界里有许多奇怪的现象， 如兔子的眼睛为什么是红色的？鱼睡觉 为什么睁着眼？许多许多，但我觉得变 色龙会变色很神奇，所以我对它进行了 研究。 变色龙一般身长25—30厘米，舌头 比身子还长，它有一个特殊的本领那就 是会变色，这样它就可以很好地把自己 伪装起来，就好像穿了一件迷彩服一 样，既可以避免敌人的侵害，又可以迷 惑它要捕捉的食物，便于采取突然袭 击。 这是为什么呢？我上网查了一下， 原来它的皮肤内有许多不同的色素细 胞，有黑色素细胞.红色素细胞.金色素细 胞。这些色素细胞受神经和激素控制。 当环境中的光线.温度.湿度等发生变化 时，或是受到惊吓时，神经系统立即会 做出反应，引起各种色素细胞的收缩或 舒张的变化，产生不同的组合，像我们 绘画时用“三原色”可以调出许多种不同 颜色一样，变色龙的身体就呈现出不同 的颜色变化。 变色龙能随环境变化改变体色，长 期对自然环境适应的结果。有不少动物 都有这种本领，如海边的招潮蟹；有的 外形也可以随环境变化，如枯枝碟，颜 色与形状与一片枯叶几乎没有区别。动 物的这种对环境的适应性成为“拟态”。 知道了这个道理，我一点也不足为 奇了。 分享到：QQ空间 QQ好友 腾讯微博