研究论文裸鼠黑色素瘤细胞株

就是BRAF基因第15号外显子上第600位的氨基酸由缬氨酸（简称为V）突变为了谷氨酸（简称为E），带由这一突变的肿瘤患者对达拉菲尼、维罗非尼这一类的靶向药物敏感。

BRAF 基因突变与消化道肿瘤

【关键词】 BRAF 基因

［关键词］BRAF 基因；基因突变；消化道肿瘤；文献综述

［中图分类号］Q754; R735

近年来，BRAF 基因在肿瘤中的作用越来越受到重视。BRAF 基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶(a serine/theroninespecific kinases) ，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路(MEK: mitogen/extracellular signalregulated kinase； ERK: extracellular signalregulated kinase； MAPK: mitogenactivated protein kinase) 重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等［1］。因此，在以往的研究中，人们对RAF 蛋白功能的关注多集中在将其作为RAS 蛋白关键的效应分子来研究。1988年，Ikawa 等发现该基因能诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞的转化，首次确定其为一种癌基因［2］。2002年，Davies 等发现，约66%恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中BRAF 基因存在体细胞错义突变［3］。这个令人振奋的发现第一次使人们意识到，在人类肿瘤的发生和发展过程中，BRAF 蛋白可能独立于RAS 蛋白而发挥作用［4］。此后，BRAF 基因引起了人们极大的关注与重视，尤其是该基因的生物学行为和临床意义更是成为研究热点。

1 BRAF 的结构与激活

BRAF 基因是RAF 家族的成员之一，RAF 家族还包括ARAF 和RAF1(CRAF)基因。

BRAF 基因位于7q34，长约190kb ，转录mRNA 长2.5kb ，编码783氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000~95000［5］。BRAF 蛋白由783个氨基酸组成，功能上从N 端到C 端为RAS 结合区、富半胱氨酸区(Cys)、甘氨酸环(Gloop)和激活区。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF 是MEK/ERK最为关键的激活因子［68］。它主要有CR1、CR2和CR33个保守区。其中CR1区含RBD 区(ras banding domain ，为RAS 蛋白结合区) 和富含半胱氨酸区(Cys)；CR3区为激酶结构域，含甘氨酸环(Gloop)，为A TP 结合位点和激活区，该区T598和S601两个位点的磷酸化对BRAF 蛋白的激活至关重要。BRAF 蛋白的主要磷酸化位点为S364、S428、T439、T598和S601。BRAF 蛋白的完全活化需要T598和S601两个位点的磷酸化，这两个位点氨基酸的置换将导致激酶持续性激活。此外，该两个位点的磷酸化对于ERK 的BRAF 诱导性激活以及NIH3T3的转化亦很重要［9］。

2 BRAF 突变的类型

研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF 突变。BRAF 突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第1799核苷酸上，T 突变为A(T1799A以前认为是T1796A) ，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E以前被认为是V599E) 。此外，仅不到1％的癌组织同时存在BRAF 突变与RAS 突变，且在这1％中，BRAF 突变几乎均为非V600E 突变。以上两种类型的突变均能使BRAF 激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更为重要。

V600E 突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活［3］。

3 BRAF 突变性激活的生物学效应

BRAF 蛋白激活后导致MEK/ERK的激活，通过转录物或非转录物的方式影响肿瘤进展：在胞浆，ERK 能磷酸化并激活p90RSKs ，继而通过使凋亡诱导因子BRD 失活或激活CREB(cAMP response elementbinding protein，一种能诱导与细胞生存有关基因表达的转录因子) 而影响细胞凋亡［10］。激活的ERK 还能影响肌球蛋白轻链激酶(MLCK)活性，导致组织侵袭和转移。激活的ERK 转位到胞核后能够影响多种恶性肿瘤相关基因的表达：Cyline D 表达增加使细胞生长能自我满足；原凋亡蛋白Bim 家族表达下降使细胞凋亡减少；VEGF(vascular and endothelial growth factor)表达增加促进血管生成；cmyc 表达增加使细胞对抗生长信号不敏感；β3整合素表达增加促进组织侵袭和转移；ERK 还能诱导mdm2的表达，后者能够抑制P53活性。

BRAF 激活后依次激活MEK 和ERK ，ERK 活性增加对黑色素瘤细胞的生物学效应已基本清楚，包括促进细胞增殖和侵袭、改变整合素的表达、降低E 钙黏素表达以及增加基质金属蛋白酶(MMP)分泌［11］，采用RNA 干扰(RNAi)技术抑制BRAFV600E 的表达，能够有效降低MAPK 活性，抑制细胞生长和促进凋亡［12］。将突变的BRAF 基因转染到黑色素细胞中，能使其表型发生恶性转化，将该细胞株接种到裸鼠体内，发现其呈侵袭性生长，并导致肿瘤形成［13］。体内和体外试验均证实，人黑色素瘤细胞株对特异性MEK 激酶抑制剂普遍敏感［14］，针对由BRAF 突变引起的下游信号通路的激活，采用特异性MEK 激酶抑制剂阻断该通路，能够有效抑制鼠恶性黑色素瘤的肺转移，并能使已产生的肺转移灶缩小甚至消失［15］。Houben 等［16］的研究还发现，BRAF 的突变状态与恶性黑色素瘤的预后有关，存在BRAF 突变者预后不良。这些都表明BRAF 突变对于肿瘤的发生、发展有关键性作用，是潜在的诊断标记和治疗靶点。

4 BRAF 突变与消化道肿瘤

近两年来，BRAF 突变与消化道肿瘤关系渐受关注，其中以结直肠癌(CRC)研究最为广泛。现有文献表明，多数消化道肿瘤中均存在不同频率的BRAF 基因突变。除突变类型外，较为一致的是，在同一肿瘤中，BRAF 和Kras 突变具有互相排斥的性质，两者突变从不同时出现，可能是相互独立的遗传事件［1720］。

4.1 结直肠癌

多数报道CRC 中BRAF 突变率在15％左右，且90％以上为V600E 突变，并与Kras 突变负相关［2122］。Nagasaka 等［20］发现9％(21/234)的CRC 存在BRAFV600E 突变，31％(72/234)的CRC 存在Kras 突变，且同一肿瘤中两者从不同时存在。而Ikenoue 等［1,23］认为，在结直肠癌中，BRAFV600E 突变能提高ERK 、NFκB活性和NIH3T3转化能力，但Gloop 区的点突变及D593V 、G595R 等突变则降低激酶活性，对NFκB活性和NIH3T3转化能力无影响。

通常认为CRC 按腺瘤―腺癌的顺序演变而来，但越来越多研究表明可能存在另一条途径，即由齿状息肉包括HP 、MP 、SA 等演变而来。Kambara 等［24］研究发现，在无蒂齿

状腺瘤(SSA)和混合性息肉(MP)中，BRAF 突变较齿状腺瘤(SA)、增生性息肉(HP)和腺瘤(AD)频发；高CpG 岛甲基化表型(CIMP)的齿状息肉和CRC 较CIMP 低或阴性的齿状息肉和CRC 常见。他们认为高度微卫星不稳定(MSIH)的散发性CRC 可能起源于SSA 而非AD 。Chan 等［25］报道，36％(18/50)的HP 、20%(2/10)的MP 、100%(9/9)的SA 存在BRAF 突变，90%(26/29)为V600E 突变。他们推测，HP 向SA 演进可能与BRAF 获得性突变有关，CRC 可能循HPSA 腺癌演变而来。

此外，Yuen 等［17］研究还发现，BRAF 突变与结直肠癌分期显著相关(Dukes’A、B 期>C、D 期) ，且具有统计学差异，但与性别、年龄、肿瘤分化状态、部位无关。

4.2 胰腺癌

最近的两项研究发现，在胰腺癌临床标本和胰腺癌细胞株COLO357中均能检测到BRAF V600E突变［2627］。Calhoun 等［27］检测了9例Kras 野生型的胰腺癌组织，发现3例含有BRAF V600E突变，突变率为33%(3/9)，而在74例含Kras 突变的胰腺癌组织中则未检测到BRAF 突变，且在BRAF 和Kras 均为野生型的胰腺癌组织中均未发现其信号通路成员MEK 、ERK 、RAP1B 等的突变。

4.3 胃癌

在胃癌的发生、发展过程中，BRAF 突变是稀有事件。Wu 等［28］检测了16例胃癌细胞株和62例胃癌组织标本BRAF 和Kras 的突变情况，发现无一例细胞株存在BRAF 突变，仅1例胃癌组织存在BRAFV600E ，而31％的细胞株及1.6%的组织标本存在Kras 突变。 Oliveira 等［19］发现，124例微卫星稳定性(MMS)胃癌仅1例存在V600E 突变。37例MSI 胃癌无一例突变，但Kras 突变频率较高，提示BRAF 突变可能与胃癌的发生无关，而Kras 突变可能与伴DNA 错配修复(MMR)缺陷的胃癌的发生有关。

4.3 其它

在其它类型的消化道肿瘤方面，Tannapfel 等［29］认为BRAF 突变在胆管癌(CC)中较常见，而在肝细胞癌(HCC)中少见，CC 中BRAF 和KRAS 的突变率分别为22％(15/69)和45％(31/69)，且两种突变不同时出现在同一CC 中。而25例HCC 均未检测到RAF 和Kras 突变。Blaker 等［30］发现在21例散发性小肠腺癌中13例存在突变，12例为Kras 突变，1例为BRAF 突变，他们认为在小肠癌的发生发展过程中，RASRAFMEKERKMAPK 通路的激活常由Kras 突变引起，偶由BRAF 突变引起。Perren 等［31］检测了130例胰腺、胃肠道、肺等内分泌肿瘤中BRAF 的突变情况，发现47％的乳头状甲状腺癌、1例分化良好的胃肠道内分泌癌存在V600E 突变，而其它肿瘤中则未发现。

5 结束语

如前所述，BRAF 突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关，可能是一种新的恶性肿瘤相关基因、一个新的基因治疗靶点。就消化道肿瘤而言，虽然现有研究证实存在不同频率的BRAF 突变，但由于对BRAF 突变的研究只有短短几年时间，尚缺乏大规模、系统而深入的研究，仍然有很多问题需要进一步阐明。例如BRAF 突变率和突变类型究竟怎样；BRAF 获得性突变是否发生在肿瘤进展过程的早期阶段，究竟是否具有确切的病理学意

义，是否是良性肿瘤恶变的先兆；BRAF 突变的生物学效应及其分子机制，其与消化道肿瘤发生和发展的关系；除V600E 突变外，其它类型的突变是否具有相应的生物学效应；在细胞周期调控过程中，是否象其它癌基因一样，需要“二次打击”；能否通过干预BRAF 突变来治疗消化道肿瘤等这些问题仍有待进一步论证。但BRAF 作为一种癌基因，BRAF 蛋白作为一种重要的信号转导分子，在细胞内参与广泛的细胞事件，其重要性是无疑的。对BRAF 突变研究的深入，必将丰富现有对恶性肿瘤分子机制的认识，可望为阐明消化道恶性肿瘤致病的分子机制，寻找新的治疗途径与靶点提供思路，为有效干预消化道肿瘤、降低患者死亡率提供理论依据。