晚期食管癌的研究进展论文

单细胞测序分析CD45+的细胞（免疫细胞）→利用经典标记对免疫细胞注释，研究免疫细胞的成分差异→阐明免疫细胞改变的分子机制→研究免疫细胞TCR序列的变化，克隆性，说明起源问题→研究髓系细胞，TAMs（肿瘤相关巨噬细胞），WCGNA研究细胞分子特征→细胞间相互作用（scTHI）

我们获得了一个详细的单细胞分辨率的食管鳞状细胞癌（ESCC）免疫细胞图谱。阐述了哪些免疫细胞处于休眠状态，哪些免疫细胞处于增值状态，以及这些细胞与免疫抑制之间的关系。

①食管癌在组织学上可分为两个亚型：腺癌（EAC）和鳞状细胞癌（ESCC）。食管鳞癌是食管癌的主要亚型，约占全世界食管癌的90% ②最近，PD-1抗体用于晚期食管癌一线化疗失败的患者显示，与化疗相比，总体生存率只有中度的改善。 ③我们用高维（high-dimensional）scRNA序列分析了从七个切除的食管鳞癌肿瘤及其邻近组织中分离的总免疫细胞。同时进行T细胞受体（TCR）测序，以获得T细胞克隆性的信息 ④相较于癌旁正常组织，肿瘤组织T细胞明显扩增。 ⑤我们在这些肿瘤中发现了耗尽的T细胞、耗尽的NK细胞、调节性T（Treg）细胞、交替激活的巨噬细胞（M2）和耐受性树突状细胞（tDCs），表明ESCC中 存在炎症但免疫抑制的TME 。 ⑥我们鉴定出了一个与预后相关的基因集

①我们分析了从7对新鲜、手术切除的肿瘤和ESCC邻近组织中分离出CD45+细胞进行单细胞测序。过滤后，共80787个细胞（每个样品3248-9078），中位基因数1170个。 ②我们将所有样本的单细胞数据进行标准化和汇总，并进行无监督聚类以识别可区分的群体，用的是Seuratv3.0 ③我们利用典型标记对这些细胞进行了注释；这些细胞类型的经典标记物的表达与注释一致

④我们发现肿瘤中的t细胞和单核/巨噬细胞增多。与此相反，B细胞和NK细胞的百分率降低

（S133、S134和S150）--在这些肿瘤中，T细胞所占的比例不到总细胞的2%。 （S135、S149、S158、S159）--这些肿瘤中，免疫谱在PCA中呈现显著变化，其中6–12%的细胞是T细胞。

①T细胞和NK细胞是TME中主要的细胞毒性免疫细胞，我们对来自所有样本的T细胞和NK细胞进行无监督聚类，我们鉴定了6个CD4 T细胞簇，7个CD8 T细胞簇，1个CD4和CD8双阴性T细胞簇和3个NK细胞簇

②在T细胞中，我们使用已知的功能性标记来提示CD4 T细胞群，包括天真、记忆、效应、耗尽的T细胞和Tregs。这些标记物还鉴定了CD8T细胞群，包括记忆、效应、细胞毒性和耗尽的T细胞。

④我们进一步分析了与GFBP2、LAG3和FOXP37表达高度相关的基因。前50个基因用于细胞毒性、衰竭和Treg的分配。然后我们使用这些特征分析T细胞簇，发现富集分数与公布的特征一致。 ⑤CD4群体中存在着谱系联系，exhaustion和Treg评分的可视化证实了这两个簇之间的重叠 ⑥细胞毒性和耗尽的CD8 T细胞都表达许多效应分子，如GnY和GZMH，而耗尽的DCD8 T细胞表达的IFNG水平高于细胞毒性细胞（图2f），这表明耗尽的T细胞仍表达高水平的某些效应分子并试图对肿瘤细胞作出反应； 这些结果提示CD8-C5-CCL5处于衰竭早期，CD8-C7-TIGIT处于衰竭期，CD8-C6-STMN1可能是CD8-C5-CCL5与CD8-C7-TIGIT的过渡期。

①我们比较了肿瘤和邻近组织中的T细胞簇。CD45+细胞中的 （Treg cluster CD4-C6-FOXP3） and （exhausted CD4 T cells CD4-C5-STMN1 ）的百分比与匹配的邻近组织相比显著增加； 流式细胞术也证实了在ESCC肿瘤中Tregs的富集。 同样，耗尽的cd8t细胞在肿瘤中富集。

②在ESCC中，PD1在CD8 T细胞中的表达一直较高（图3f）。肿瘤组织中Tregs和耗尽的DCD4和CD8 T细胞显著增加表明存在免疫抑制环境 ③我们还观察到，与匹配的邻近组织相比，肿瘤组织中的NK细胞显著减少； NK-C1-NCR3表达高水平的NCR3、CD266、NKG7和LAMP1（图3h）。 相反，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1簇高水平表达KLRC1和ITGA1抑制性受体（图3h）。 流式细胞术分析证实，与邻近组织相比，ESCC中NKG2A（KLRC1）在NK细胞中的表达增加（图3i）。事实上，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1的细胞毒性分数极低；相反，衰竭分数升高（图3j），这表明在ESCC中NK细胞不足，功能受损

①根据TCR结果我们共观察到15654个独特的tcr序列。观察到克隆扩展，克隆大小从2到2600（图4a）。 如预期的那样，患者之间没有发现共享克隆。与其他癌症类型的研究一致，大多数TCR是独特的。然而，TCR基因型的组成在患者中是高度可变的

②S149和S150肿瘤中有65%和68%的T细胞具有两个以上细胞共用的TCR，这表明这些肿瘤中T细胞的高度克隆性扩增（图4b）。与匹配的邻近组织相比，7名患者的肿瘤中有4人的扩增克隆数增加。

④CD8 T细胞的克隆性细胞明显多于CD4 T细胞，并且幼稚的CD4-C1-CCR7簇显示出非常有限的克隆性扩增（图4d）。 ⑤CD8-C1-NKG7是CD8 T细胞中的细胞毒性簇，在邻近组织中具有较高的频率，在邻近组织中也显示出比肿瘤组织中更高的克隆扩增（图4e）。

⑥然而，与邻近组织相比，肿瘤中的Tregs克隆数增加（图4f），这表明特异性克隆细胞的扩张可能是肿瘤中Tregs高百分比的原因。 ⑦我们在CD4细胞的所有簇（包括Tregs）和CD8细胞的所有簇（C2除外）中发现了TCR序列的共享（图4g，h） ⑧CD8-C7-TIGIT与CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1共有的克隆数分别为166（9.0%）和156（8.4%）（图4i）。 ⑨Treg簇CD4-C6-FOXP3在肿瘤中也有相同的趋势，与CD4-C1-CCR7共有的克隆型占14.4%，在邻近组织中占40.7%（图4j和补充图8c）

①接下来，我们对髓系细胞进行无监督聚类。十四个簇被鉴定，包括9簇单细胞/巨噬细胞和5簇树突状细胞（图5a）。 ②利用已发表的信号特征：单核细胞（Mono）、经典活化巨噬细胞（M1）、交替活化巨噬细胞（M2）和髓源性抑制细胞（MDSCs）； ③我们使用Monocle，一种无监督的推断方法，来构建细胞转化的潜在发展轨迹。另一种算法Slingshot的结果（s9b）； 巨噬细胞中M1和M2信号之间的显著相关性（补充图。9c），表明ESCC中存在一个复杂的巨噬细胞极化过程，这与其他研究一致 Mono-C1-VCAN显示出强大的单核细胞信号（图5b）。

④我们用wgcna对单核/巨噬细胞进行加权相关网络分析 我们发现绿松石模块与单核细胞簇、单核细胞C1-VCAN和单核细胞C2-IL1B正相关，与M2簇宏C3-CSF1和MDSC簇MDSC-C1-C1QC、MDSC-C2-APOE负相关（图5d，e）;我们进一步分析了这个模块中的基因以及它们与Mono-C1-VCAN的关联（图5f），以选择最相关的前50个基因，形成一个特征集； 有趣的是，这一特征与ESCC（图5g）以及宫颈鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌（补充图9g）的高无进展生存率密切相关，这表明这一特征可作为ESCC和其他组织鳞状细胞癌的预后生物标志物。

①五个DC簇表达热图（图6a）;DC-C3-LAMP3癌旁组织中富集（图6b）。

②发现LAMP3+DC与其他树突状细胞亚群相比具有更高的活性和迁移能力，同时其还富集到了耐受性特征（图6c）

④流式显示：LAMP3+DC表达的CD83、CCR7和PDL1明显高于LAMP3 DC（图6e，f）、提示LAMP3+DCs的成熟、迁移和调控能力。 ⑤多色ihc染色也证实了肿瘤组织中CD11C+LAMP3+PDL1+IDO+DCs的存在（图6g）。 ⑥我们进一步用IFNγ和LPS治疗dc。有趣的是，我们发现IFNγ和lps刺激诱导dc表达PDL1和IDO（图6h）； 当DCs与CD4+CD45RA+幼稚T细胞共培养时，诱导FOXP3表达的能力增强（图6i）。 提示IFNγ和LPS可能在体外诱导耐受性DCs

①我们基于已知配体-受体对在任何两种肿瘤浸润性免疫细胞中的共同表达，对潜在的细胞-细胞相互作用进行了系统分析 scTHI--另一种广泛使用的方法--分析巨噬细胞和Tregs的相互作用 ②我们发现巨噬细胞和Tregs之间TNF-TNFSF1B、CCL4-CCR8和IL-1β-IL1R2的相互作用具有较高的相互作用得分，并且Tregs在肿瘤中表达高水平的TNFSF1B、CCR8和IL1R2（图7a–c）

③肿瘤中分离的树突状细胞中IL1R2的表达高于癌旁组织，多色IHC也证实了IL1R2在Tregs中的表达。（图7d）

通过scrna-seq分析巨噬细胞中LILRB1的表达，并通过FACS进一步验证。我们发现，与邻近组织相比，ESCC中巨噬细胞中LILRB1的表达增加（图7h，i和补充图7）。

①在这里，我们结合了深链RNA序列和TCR序列，并阐明了整个免疫景观，包括ESCC和邻近组织中固有的和适应性的免疫细胞图谱；描述了ESCC免疫细胞的分类、比例、功能变化及机制、细胞间相互作用 ②ESCC富含免疫抑制细胞：Tregs, exhausted CD8 T,CD4 T and NK cells, M2 macrophages, and tDCs；促进免疫逃避和肿瘤进展 ③我们证明耗尽的CD4、CD8 T细胞和NK细胞是主要的肿瘤内增殖免疫细胞室，尽管这些细胞富含耗尽基因。 与耗尽簇（CD8-C7-TIGIT）相比，预耗尽簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1可能是更好的免疫治疗靶点，因为耗尽簇处于永久性和不易逆转的耗尽阶段，由于其表观遗传变化，使其更耐检查点抑制。 ④发现肿瘤浸润的NK细胞不仅在ESCC中普遍减少，而且还表达高水平的检查点分子，包括NKG2A和CD49d，提示处于耗尽状态；据报道，抗NKG2A和抗CD49d是促进抗肿瘤活性的检查点抑制剂 ⑤T细胞的TCR序列共享，提示T细胞启动后有着广泛的分化。 ⑥衰竭的CD8 T细胞（CD8-C7-TIGIT）与其他CD8簇具有更高比例的共享克隆，尤其是衰竭前簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1，这与这些簇的相关状态和多步衰竭假说相一致。 相反，CD8-C1-NKG7是细胞毒性最强的CD8 T细胞簇，在肿瘤中克隆性T细胞明显减少 最近在膀胱癌中也有类似的发现，细胞毒性cd8t细胞（FGFBP2+clusterin）在正常组织中的克隆性比在膀胱癌中的克隆性强。 另一方面，食管细胞毒性细胞的克隆扩增可能是由于食管中的非肿瘤抗原的偶然暴露，并且相邻组织中的大多数CD8-C1-NKG7细胞表达低水平的CD39，这表明它们是旁观者CD8 T细胞。 幼稚的CD8 T细胞可能不常渗入食管或被局部环境激活，因此不太可能被检测为独立的群体。 ⑦单核细胞/巨噬细胞在肿瘤中的关键作用已经在肝癌、乳腺癌和肺癌中用scRNA-seq进行了描述； 通常，巨噬细胞的活化分为炎症前M1状态或与炎症溶解相关的M2状态； 我们的分析显示单核细胞/巨噬细胞存在于单核细胞、M1和M2状态的光谱中；M1相关基因和M2相关基因经常在同一细胞中共同表达；M1和M2信号的共存表明TAMs比经典的M1/M2模型更复杂，这种现象在乳腺癌和肝癌中也有发现 当使用WGCNA分析单核/巨噬细胞的基因相关性时，我们发现一组基因与单核细胞呈正相关，在ESCC和其它类似的病理类型肿瘤有着较好的预测预后能力 ⑧cDC2特别参与MHCⅡ类介导的抗原提呈和cd4t的活化和扩增细胞.cDC1也是抗肿瘤免疫所必需的。最近，一些文献报道了TME中的DCs，发现大多数与我们的数据一致。 比较了不同癌肿之间的这种差异，对分析出来的细胞做了些功能分析。 ⑨我们的工作进一步证实了树突状细胞与巨噬细胞之间的相互作用； 在Treg上表达的IL1R2可能通过阻断IL1β依赖性效应T细胞的活化而增强Treg的功能; IL1R2在活化的肿瘤树突状细胞上表达，并与肺腺癌的预后不良相关。 我们的研究还表明，Tregs可能通过hhla-A、B、C和LILRB1相互作用调节巨噬细胞的功能。 研究TAMs中这种免疫抑制MHC类I-LILRB1信号轴的机制将有助于开发恢复巨噬细胞功能的疗法。 总之，我们的ESCC和邻近组织免疫细胞的转录图谱提供了一个了解免疫状态的框架，并揭示了ESCC环境中免疫细胞的动态特性。此外，我们还从多个方面阐述了食管鳞癌的免疫抑制状态，这些都是食管鳞癌及其他癌症免疫治疗的潜在新靶点

TCR测序方法简介 TCR测序干货 WGCNA

癌症无治，只能靠药物维持生命，如果有钱的话找个好医院度过余生吧

我从不相信有任何药可治食道癌.不吃以下食物,油榨,腌制,可乐,牛奶,糖,汉堡,坚果,豆类,荤菜.多喝水日3000毫升,多吃青菜.自会慢慢好转,乃至康复.

受访专家：

中国医学科学院肿瘤医院胸外科主任高树庚

北京大学肿瘤医院胃肠肿瘤中心一病区主任李子禹

中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科主任吴健雄

天津医科大学肿瘤医院结直肠肿瘤科主任孔大陆

北京大学肿瘤医院消化内科主任医师张晓东

根据2017年国家癌症中心公布的数据，我国恶性肿瘤发病率排在前五位的分别是：肺癌、胃癌、肝癌、肠癌和食管癌。这5种癌不分性别，男女都会发病。本期我们一起来关注，在治疗五大癌的道路上，人类走了多远？

肺癌：精准靶向 治疗

肺癌已成为我国第一大癌，发病率和死亡率很高且增长最快。肺癌的五年生存率不到15％，大部分病人到医院看病时，都已是中晚期了。要提高肺癌生存率和治愈率，就得从早诊早治入手。中国医学科学院肿瘤医院胸外科主任高树庚告诉《生命时报》记者：“早期发现、合理治疗、延长中晚期肺癌患者的生存期，是医护人员努力的方向。”

应对肺癌的重点是做好预防。高树庚说，要研究肺癌的发病机制，争取在没有发生肺癌的时候，进行基因筛选。通过人为进行基因干预，去除自身致癌因素，防患于未然。在治疗方面，精准医疗在肺癌诊疗上日益受到关注。高树庚介绍，精准治疗是一种个体化的治疗手段，它通过活检的方式进行精准检测，了解肿瘤标志物的改变，进而有针对性地进行靶向治疗。这种方法能够更加准确地针对个体差异、不同肺癌类型进行治疗。“过去我们边治边看，现在要看准了再治，用最小的创伤、最低的耗费，达到最佳治疗效果。”性格决定命运，这句话也适用于肺癌病人。在临牀工作中高树庚发现，对肺癌有着正确认识，又能够积极配合治疗，性格开朗的病人，明显恢复得快。未来，他希望通过研究来证实这一发现。

胃癌：力求早期发现

我国胃癌发病率和死亡率都很高。全球每10位胃癌患者，就有约5位是中国人。北京大学肿瘤医院胃肠肿瘤中心一病区主任李子禹说：“胃癌最大的特点是异质性比较强，简单来说就是每个病人的肿瘤都不一样，同样的肿瘤组织里面不同的部分也有差异，给治疗带来很大难度。”

胃癌在日本和韩国也同样高发，但目前胃癌早诊早治率在这两个邻国可达60％以上，而在我国还不到20％。这是胃癌诊疗面临的巨大挑战。李子禹表示，提高胃癌的早诊率是未来需要攻克的主要难题之一。

病理分期较早的胃癌，通过规范治疗，治愈率能达到95％，技术已相当成熟。晚期胃癌主张以系统治疗为主，包括化疗和靶向药物等，但效果欠佳，患者五年生存率不到10％。针对晚期胃癌，医生们仍在寻找更为有效的治疗方法。

李子禹表示，目前药物研究未能实现很大突破，免疫治疗现在还处在研究阶段，没有实际用到临牀上，但值得期待。未来，对于中晚期的病人，若能通过一些联合药物治疗，如化疗、靶向药物，进一步提高治疗效果，不仅延长患者生命，更重视他们的生活质量，才是胃癌诊疗真正的春天。

肝癌：微创技术为主

肝癌被称为“癌中之王”，其恶性程度极高，且因为肝脏血管丰富，手术治疗难度很大。中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科主任吴健雄说：“目前肝癌的治疗难点是手术后复发率高，重要原因一是就诊病人里早期病例少，二是高危部位的中央型肝癌治疗难度大，三是肝癌容易侵犯脉管导致转移。”

治疗肝癌，目前以微创技术为主，联合全身系统的综合治疗，这也是今后很长时间内肝癌治疗的重要措施。微创技术主要包括外科手术、局部消融及放疗等精准治疗。更精细的“超选介入治疗”，依然是重要研究课题。系统治疗主要是免疫治疗、靶向治疗以及中医药的进一步研究应用。吴健雄表示，还应注重病人精神和心理的关怀及辅导，以及对机体的扶正调理。

要提高肝癌病人的治愈率和生存率，必须强调早诊早治。吴健雄说，肝癌诊治未来有4个努力方向：对高危人羣的普查、随诊；有效防控乙型和丙型肝炎的感染；宣教良好生活方式；提高多学科协作的诊治水平。

肠癌：最大程度保肛

结肠癌和直肠癌统称为结直肠癌，俗称大肠癌。早期大肠癌的临牀治疗手段已经很完备，但仍有约1／5的患者发现时已属于晚期。天津医科大学肿瘤医院结直肠肿瘤科主任孔大陆教授介绍，目前1期肠癌治愈率可达90％，2期可达80％，3期有60％左右的五年生存率，即使到了4期，仍有10％以上的五年生存率。从生存率来讲，相比其他癌症，肠癌已经算“仁慈”了，但它也有十分危险的一面。孔大陆解释，大肠癌的发生发展有一个特点：大约有超过50％的患者都会出现肝转移。很多人得了结肠癌之后，发现癌细胞转移到肝脏上了，给后续治疗带来很大麻烦。对于大肠癌容易肝转移的原因，业界看法不一，这是未来的重要研究方向。孔大陆说：“将来，我们希望能摸清究竟哪种类型的大肠癌是高危的，并采取预防措施，让患者生存期更长、生活质量更好。”

近年来，大肠癌发病年轻化趋势明显，很多病人保肛意愿强烈。但有些直肠癌离 *** 比较近，若直接手术，保肛较为困难。对此，孔大陆主张先放化疗再手术，通过术前联合放化疗让癌灶进一步缩小，再施行手术切除，这样能最大程度保留 *** 。

此外，肠道息肉困扰很多人，也确实有恶变可能，但据相关统计，大肠息肉恶变机率仅0．75％～5．6％。孔大陆提醒，息肉一般分两种，一种是带蒂的息肉，像茄子把一样，良性的多；还有种像小山丘一样的息肉，需要提高警惕。但这些都不可怕，因为现在肠镜治疗技术提高了，通

过微创手术都可以解决。目前，大肠癌的诊断和治疗已取得很大进步，以外科手术为主的综合治疗大放异彩。手术、放化疗、靶向治疗、生物治疗、微创介入和中西医结合治疗等手段打起组合拳，这种多学科联合诊治的模式，能够显著提高大肠癌患者的生存期以及生存质量，让他们活得更有尊严。

食管癌：晚期不要放弃

在我国，食管癌主要是中、上段食管鳞癌。早期治疗效果最好，五年生存率可达70％～90％，但80％的食管癌患者一经确诊就是局部晚期或全身转移，治疗难度较大。北京大学肿瘤医院消化内科主任医师张晓东说：“目前食管鳞癌的治疗主要还是三大基本手段：手术、化疗和放疗。由于近几年提倡多学科综合治疗，通过这三大治疗手段适时、适度、适量的结合，使食管癌治疗有了很大进步。

曾有位77岁时患晚期食管鳞癌的患者，颈部和腹膜后淋巴结转移，失去了手术机会。但经过放化疗，患者现在已经5年多没有复发转移，实现了临牀治愈。张晓东感慨：“这样幸运的患者并非个例。在我们曾经进行的一项研究中，58例晚期食管鳞癌患者有8例获得临牀治愈。晚期食管癌经过多学科综合治疗，有10％左右的患者可以获得治愈，如何筛选出这些生物学行为较好、可能治愈的患者，是我们研究的方向。”医学界不会停止对食管癌研究的步伐。今后对食管癌的研究将更多关注多学科综合治疗、靶向治疗和免疫治疗，也更重视针对每个患者的个体化治疗。

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