纤维素酶的生产研究发展论文

纤维素酶是一种重要的酶产品，它是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，是酶制剂工业中的一个新的增长点。

产纤维素酶的微生物有很多，迄今为止国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约53个属的几千个菌株，包括细菌、真菌和放线菌。目前，用于纤维素酶生产的主要是真菌类，世界纤维素酶市场中有20%是来自于木霉属和曲霉属，其中木霉属被公认是产纤维素酶最高的菌种之一，是当前生产上应用较多的菌种。

自从第二次世界大战中Reese从美军军装上发现了木霉，木霉纤维素酶的工业化生产越来越引起人们的重视，T.ressei成为世界范围内最主要的纤维素酶生产菌株。它的优点在于具有培养粗放、适应性强的特点，适于固体培养和液态深层发酵，它的酶系纤维素酶活性高并且能生产大量的胞外蛋白，它的胞外纤维素系统由60%～80%的外切葡聚糖苷酶，20%～36%的内切葡聚糖苷酶和1%的β-葡聚糖苷酶组成，这些酶协同作用将纤维素转换成葡萄糖。

诱变选育是提高菌株酶活的一种有效方法，以T.ressei Rut C-30突变菌株为例，它是通过3步诱变得到的（覃玲灵等，2011）。首先，在代谢物抑制条件下，通过水解纤维素酶活的筛选，进行紫外线诱变，得到菌株M7；其次，通过化学诱变（亚硝基胍）和一个过程与前者相似但更严格的酶活筛选之后，从M7中分离出了菌株NG14，在胞外蛋白和纤维素酶活力方面，NG14 与亲本株以及其他可用的纤维素酶突变株相比都提高了几倍（Eveleigh et al.，1979）；最后，对NG14经过紫外线诱变，经过2-脱氧葡萄糖的抗性筛选后，得到菌株Rut C30（Kang et al.，2006；Wick et al.，1957）。Rut C30刚分离出来时纤维素酶的产量能够达到15FP units/（L·h），能产出大约20mg/mL的胞外蛋白，与它的亲本菌株NG14相比，胞外蛋白的产量多了2倍，达到2%，在工业发酵罐中的产量超过30g/L，达到了工业需求的酶产量；与其他木霉菌株相比，Rut C30产的外切葡聚糖苷酶稳定性最高，在pH5.0，50℃的条件下培养30d，只有28%的酶失活（Esterbauer H et al.，1991）。

T.ressei突变菌株QM9414，MCG77，MCG80，Rut C30，CL-847，VTT-D和SVG是生产完整纤维素酶系的优良菌株。当以上菌株在添加纤维素（如滤渣、棉、微晶纤维素等）或处理的木质纤维素（木材、秸秆）的无机盐培养基中培养时，可以分泌产生纤维素酶（H.Esterbauera et al.，1991）。以上菌株在实验室摇瓶发酵培养条件下，每消耗1 g碳源平均可产生250mg的纤维素酶蛋白，蛋白活性为0.5～1.0U/mg，产量为50～150FP units/（L·h），补料分批连续培养可增加酶的浓度和产量。

Mach和Seiboth等研究发现，以纤维素、木聚糖或者其他植物聚合物甚至乳糖等工农业副产品为培养基，木霉也可以产生高浓度的纤维素酶和半纤维素酶（Mach et al.，2003；Seiboth et al.，2007）。木霉属纤维素酶近来已经工业化生产，除国际大品牌公司Genencor，NovoNordisk外，国内有湖南尤特尔酶制剂等公司已大规模生产纤维素酶。

木霉纤维素酶的发酵生产主要有两种模式：固态发酵和液态发酵。

固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉，目前国内绝大部分纤维素生产厂家采用该技术生产纤维素酶（乞永立等，2000）。中国科学院过程研究所陈洪章等在纤维素酶的固态发酵领域进行了研究，并设计了100m3的纤维素酶固态发酵反应器及其配套设备，实现了以汽爆秸秆为原料的纤维素酶的大型生产，最高产量达210FPA/g干曲。然而固体发酵法生产的纤维素酶很难提取、精制。目前，我国纤维素酶生产厂家只能采用直接干燥法粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，其产品外观粗糙且质量不稳定，发酵水平不稳定，生产效率较低，易污染杂菌。

液体发酵生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至20目以下进行灭菌处理，然后送发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70h，温度低于60℃。采用除菌后的无菌空气从釜底通入进行通气搅拌，发酵完毕后的物料经压滤机板框过滤、超滤浓缩和喷雾干燥后制得纤维素酶产品。液态深层发酵由于具有培养条件容易控制、不易染杂菌、生产效率高等优点，已成为国内外重要的研究和开发方向。李忠兴等（1999）以T.koningii T215为菌种，在30t气升反应器中进行了纤维素酶的发酵生产，平均CMC酶活达78.3IU/mL。

南京农业大学陆兆新等研究了用覆盖不同高分子的纱布固定化木霉细胞纤维素酶的活性，其中覆盖poly（HPMA）载体固定化木霉的纤维素酶活最高，达3.5IU/mL。用固定化木霉细胞产生的纤维素酶不经提纯分离，直接水解辐射和低浓度NaOH预处理的稻麦秆，其葡萄糖产率随辐照剂量和水解时间的增加而增加，电子辐射和4%NaOH处理的稻秆葡萄糖产率达19%，而麦秆达22%，认为固定化木霉细胞酶液能很好地水解辐射预处理的稻麦秆。该研究成果“辐射和生物技术相结合提高纤维素酶水解效率的基础研究”在1999年获农业部科技进步奖二等奖。

由于纤维素酶是多组分复合物，各组分的底物专一性不同，而且不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。传统纤维素酶活测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活（FPA）测定方法、水杨苷酶活测定方法、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、羧甲基纤维素钠盐（cmC-Na）酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法等（尹娟等，2009）。利用新型传感器测定纤维素酶活性已越来越多地应用于生产过程中，生物传感器适应于复杂体系的实时及在线测定，具有快速测定、简便易携、高灵敏度、高专一性，而且检测样品一般可反复多次使用、不需另加其他试剂、不需要预处理、不要求样品清晰度等优点，在监测与控制中显示出巨大的优势。