天然产物扩血管作用研究进展论文

1980年，一位科学家完成了一个精巧设计的实验，并据此发表了一篇论文。这不是一件多么重大的事情，但对于一氧化氮来说却是个转折点，虽然这一年科学界并不知道那种特别的物质就是一氧化氮。这位美国药理学家的名字叫做罗伯特·F。佛契哥特，他在著名的《自然》(Nature)杂志上发表论文，指出乙酰胆碱(ACh)的舒张血管作用依赖于血管内皮释放的某种可扩散物质。随后他们又发现缓激肽(BK)等多种物质扩张血管的作用也是遵循类似的机理，并将该物质命名为血管内皮舒张因子(EDRF)。佛契哥特发现有一种物质可以舒张血管，这并不是他的独到之处，早在19世纪70年代，人们就发现有机硝酸酯对缺血性心脏病有良好的治疗作用，但当时并不了解其作用机理。19世纪末，在诺贝尔以研制高性能炸药(TNT)闻名和发迹的同时，人们惊奇地发现，用于治疗缺血性心脏病的硝酸甘油(GTN)竟是高性能炸药的主要活性成分，人们对此困惑不已。既然这种舒张血管的发现并不特别，那么佛契哥特的论文为什么会引起科学界的关注呢？原因就在于他用精巧设计的实验证明了这种物质的存在。表面上看来，佛契哥特的研究与一氧化氮并无直接关联，而是关于乙酰胆碱等血管活性物质的作用机理。1953年他发表了首篇关于乙酰胆碱和组胺致兔离体血管条收缩的论文，这与当时公认的对整体动物静注乙酰胆碱或组胺会引起血管舒张的观点恰恰相反。但他坚持自己的实验重复性良好，且观察无误，并在1955年发表的《血管平滑肌药理学》综述中提出假设，认为犹如肾上腺素能有α和β两种受体，血管平滑肌上也同时含有运动性和抑制性两种胆碱能受体——现在看来这一结论是错误的，然而在当时这一观点一直被当做权威而被认可。接下来的问题是，为什么刺激内皮细胞可引起血管平滑肌舒张？这次似乎是单刀直入，他们首先想到的是血管内皮细胞受刺激后会释放某种物质，该种物质扩散至平滑肌并导致其收缩。佛契哥特像是受到某种特殊的启示，他回忆道：“那天早晨我刚醒来，一个漂亮的实验设计突然闯入我的脑海。于是我来到实验室，立即按照这一方案进行了实验。”实验结果被撰写成论文发表于1980年的《自然》杂志上，论文的名字是《内皮细胞是乙酰胆碱诱发动脉平滑肌舒张的必需因素》。值得一提的是，在《自然》杂志上的这篇文章当时还没有明确提出内皮舒张因子，直到1982年，他们发表于《美国国家科学院院刊》(PNAS)上的关于缓激肽内皮依赖性舒张血管作用的论文中，才正式提出内皮舒张因子这一名词。这篇论文在学术界引起了广泛关注，吸引了包括加州大学洛杉矶分校的伊格纳罗(LouisJ.Ignarro)教授在内的许多科学工作者从事有关内皮舒张因子的研究。内皮舒张因子是一种不稳定的化合物，能被血红蛋白及超氧阴离子自由基灭活。长期研究亚硝基化合物的药理作用的伊格纳罗与佛契哥特合作，针对内皮舒张因子的药理作用以及化学本质进行了一系列实验，发现内皮舒张因子与一氧化氮及许多亚硝基化合物一样能够激活可溶性鸟苷酸环化酶(SolubleGuanylateCyclase，sGC)，一氧化氮主要通过环磷鸟苷(cGMP)途径扩张血管。穆拉德博士的发现 20世纪50年代，环磷鸟苷作为一种天然产物标志在尿中发现，相关酶类包括作用于环磷鸟苷的合成的鸟苷酸环化酶(GuanylateCyclase，GC)、水解环磷鸟苷的磷酸二酯酶和选择性地被环磷鸟苷激活的蛋白激酶。穆拉德博士于1970年结束了在美国国立卫生研究院(NIH)的训练后，决定将更多的研究精力从环化腺核苷一磷酸(cAMP)转移到环磷鸟苷，并着力解决两个问题：第一，激素类配基如何与它们的受体结合来调控鸟苷酸环化酶？第二，其分子偶合事件是什么？对受体鸟苷酸环化酶偶联的了解，有助于使用制剂或药物来增强或抑制激素在某些临床疾病中的影响。在得州大学医学院，多年来一直独立从事硝酸甘油扩张血管作用研究的药理学家穆拉德博士早在1977年就发现硝基酯类药物及外源性一氧化氮均可使环磷鸟苷的含量增高，他们甚至提出硝基酯类药物可能是通过形成一氧化氮或某种活性物质来增加细胞内环磷鸟苷的含量，进而使血管扩张和抑制血小板。至此，众多研究汇聚到一个焦点——硝基类活性物质。早在20世纪70年代，穆拉德博士与合作者就系统地研究了硝酸甘油及其他具有增强血管活性的作用的有机硝基化合物的药理作用，发现这些化合物都能使组织内环鸟苷酸、环化腺核苷一磷酸等第二信使的浓度升高。这类化合物有一个共同的性质，可以在体内代谢产生一氧化氮。1977年，穆拉德博士发现硝酸甘油等必须代谢为一氧化氮才能发挥扩张血管的作用，由此他认为一氧化氮可能是一种对血液流通具有调节作用的信使分子，但当时这一推断还缺少实验证据。穆拉德博士在前期工作中发现，在不同组织匀浆中(包括高速离心上清液和匀浆颗粒部分)都能检测到鸟苷酸环化酶的活性。但在这两种组织制备中，酶活性的动力学特征是不同的，最显著的特征就是匀浆颗粒部分对基质三磷酸鸟苷(GTP)就活性呈现协同催化动力学，而可溶性鸟苷酸环化酶的活性被证实为典型的米曼氏动力学，这个发现提示可溶性鸟苷酸环化酶的活性代表一个三磷酸鸟苷的催化位点。尽管推测鸟苷酸环化酶有不同的亚型，但由于粗制备物也含有竞争底物或产物的核苷酸酶、磷酸酶和磷酸二酯酶而无法剔除不可靠的虚假数据，穆拉德花费了整整12年的时间纯化、验证、克隆、表达和再验证这个酶，才彻底解决了这个问题。通过实验，穆拉德博士发现某些物质包括叠氮钠、亚硝酸盐和羟胺，能激活鸟苷酸环化酶。在不同组织包括气管平滑肌制备物中，叠氮钠、亚硝酸盐和羟胺也能提高环磷鸟苷的水平。这些环磷鸟苷水平的提高与平滑肌舒张有关，显示为直线的剂量应答关系。硝酸甘油，一种从18世纪70年代起应用于临床心绞痛的药物，也可活化可溶性鸟苷酸环化酶，在不同的组织包括气管平滑肌中提高环磷鸟苷的水平，引起平滑肌舒张。穆拉德博士称这些不断增长的可溶性鸟苷酸环化酶激活剂名单中气管、肠胃和血管平滑肌的弛缓剂为“硝基血管舒张剂”，确信它们能被转化为一氧化氮，因为用化学法产生的一氧化氮能激活所有测试中的可溶性鸟苷酸环化酶制备物。这些一氧化氮前药物质的作用机制因此确定。穆拉德博士提出了一氧化氮能起到调控激素和药物的细胞内信使的作用的假说，即一个自由基激活一个酶，且这个自由基是一个内源信使分子。由于被纯化的可溶性鸟苷酸环化酶的激活作用发生在纳摩尔浓度下，并且由于一氧化氮及其氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐的测定法不敏感，在一氧化氮分析测定的新技术发展后的七八年，这个当年遭到学术界怀疑的假说才被决定性地证实和接受。穆拉德博士表示，人体内的一氧化氮有两个来源：一为非酶生，来自体表或者摄入的无机氮的化学降解与转化；一为酶生，由一氧化氮合酶催化L-精氨酸脱胍基所产生。非酶生性的一氧化氮，大部分来自硝基血管舒张剂家族，包括硝普盐、有机或无机亚硝酸盐和硝酸盐、亚硝胺、氮芥、联氨等。比如有名的硝酸甘油和硝普钠的扩张血管、治疗心脏病的功能都是通过非酶生性产生的一氧化氮起作用的。酶生性的一氧化氮，来自于一氧化氮的前体物质，例如精氨酸。摄入人体的富含精氨酸的食物，在体内通过酶生性产生一氧化氮并发挥其生理功能。酶生性一氧化氮产生机理(L-精氨酸在内皮型一氧化氮合酶的作用下生成L-瓜氨酸并释放一氧化氮)穆拉德博士的研究集中于由非酶生性产生的一氧化氮的化合物对于一氧化氮合酶的影响，这不仅阐明了一氧化氮在体内扩张血管的作用机制，而且也为新型的药物和化妆品研发开辟了道路。穆拉德博士所参与的生物科技公司所应用的技术是一种能够产生一氧化氮的组合，分别为氮剂和酸剂，其中氮剂为亚硝酸盐或富含亚硝酸盐的植物提取物，酸剂为维生素C、柠檬酸等足够强度的有机或者无机酸。使用时，先清洁皮肤，涂抹适量的氮剂化妆品，再涂抹酸剂化妆品，两者缓慢反应释放出一氧化氮，渗入皮肤，提高毛细血管血流量，促进胶原蛋白的合成，从而改善肤质。值得一提的是，早在19世纪末，德国学者格里斯(Griess)就研究和发表了亚硝酸盐的检测方法，但当时对其与一氧化氮的关系并不了解。由于亚硝酸盐是一氧化氮在水溶液中进行氧化代谢的终产物而相对稳定，改良后的格里斯法至今仍是实验室间接检测一氧化氮含量最简单、最常用的方法之一。 一氧化氮与核酸的研究20世纪80年代，世界生命科学领域建立了“传递生命信息3个信使”的学说，即生命体的各种活动都是在3个信使体系的控制和调节下进行的。我们都知道蛋白质与核酸等生物大分子是生命的主要体现者，但不是生命本身。生命的本质是这些生物大分子之间，以及它们之间复杂而有序的相互联系和相互作用，这是信息传递研究的基本任务。生命信息传递的真谛，就是细胞间通讯的细胞外第一信使以及外界环境因子作用与细胞表面或胞内受体后，通过跨膜传递形成胞内第二信使的级联传递，以及其后的核内第三信使诱导基因表达和引起生理反应的过程。生命信息传递在应答环境刺激和调节基因表达、生理反应的同时，不仅维持着细胞正常代谢，而且最终决定细胞增殖、生长、分化、衰老和死亡等生命的基本现象。传递生命信息3个信使第一信使是指各种细胞外信息分子，又称细胞间信号分子即细胞因子，诸如内分泌激素，前列腺素，气体信号分子(NO)以及免疫细胞产生的免疫细胞因子。这些生物活性分子由体内各种不同的细胞产生后，能够通过血液、淋巴液、各种体液等不同途径，作用到细胞膜表面，引起细胞内的特定反映。第二信使是指细胞外第一信使与其特异受体结合后，通过信息跨膜传递机制激活的受体，刺激细胞膜内特定的效应酶或离子道，而在胞浆内产生的信使物质。这种胞内信息分子起到将胞外信息传导、放大、变为细胞内可以识别的信息作用。第三信使又称DNA结合蛋白，是指负责细胞核内核外信息传递的物质，能调节基因的转录水平，发挥转录因子的作用。这些蛋白质是在细胞胞质内合成后进入细胞核内，发挥信使作用，因而称这类核蛋白为“核内第三信使”。所以核酸是细胞内的具有遗传功能的物质，NO属于细胞间的通讯物质，没有NO，再多的细胞无法协同工作，相互发挥作用，生命信息传递不出去毫无意义，只有两者有机结合起来才能共同承担人体新陈代谢的任务。