1994年9月参加工作；1993年12月加入中国共产党。1990年9月至1994年9月在北京师范大学历史系学习，获学士学位；1994年9月至1996年9月在大同高等专科学校任教；1996年9月至1999年9月在北京师范大学历史系学习，获硕士学位；1999年9月至2003年9月在清华大学人文学院任教；2003年9月至2007年9月在北京大学法学院学习，获法学博士学位；2007年9月至2009年7月在人科院博士后工作站做博士后；2009年7月至2010年7月在中国人事科学研究院公共管理研究室工作。张丽红同志思想上、行动上始终与党中央保持一致，拥护党的领导，积极参加各项政治活动，遵纪守法。张丽红同志襟怀坦荡，豁达大度，生活朴素，严于律己，识大体，顾大局。她努力学习，扎实工作，作风正派，尊敬领导，团结同志，乐于助人，深得大家的喜爱。张丽红同志在从事研究工作中，能恪守学术道德，潜心研究，注意理论联系实际，学以致用，认真完成各项研究任务。主要承担了原人事部及人力资源社会保障部、科技部委托的立法研究和政策研究等课题。独立形成的研究报告有：《专业技术人员继续教育立法研究》、《专业技术人员继续教育条例》稿及立法说明、《职业资格立法研究》、《神木县社会保险政策研究》、《郫县公共服务体制改革的研究》；参与研究报告有：《就业公共服务均等化研究》、《哈尔滨政府绩效管理立法研究》、《广东顺德检察院能力模型构建研究》、《公共就业服务机构服务规范及绩效考核体系研究》、《南通市绩效管理案例》。发表学术论文多篇，参与了《人才强国战略论》等3部书稿的部分章节写作工作。张丽红同志认真履行工作职责，在研究中能悉心求教于师长和院内同志，与课题组成员团结协作，体现了较强的团队精神。张丽红同志的逝世使我们失去了一位好党员、好同志。我们要学习张丽红同志的优秀品质和崇高的革命精神，在党的领导下，为推进全面建设小康社会和构建社会主义和谐社会的伟大事业而努力奋斗。
摘要：由于会计信息占了整个经济信息量的百分之七十以上，因而会计信息质量的好坏决定了经济信息的质量，进而影响经济工作决策的质量，因此， 有必要对会计信息的质量特征作进一步的探讨。本文从国际会计准则对会计信息质量要求的四个方面（可理解性、相关性、可靠性、可比性），深入阐述了当前会计信息应有的质量特征。关键词：会计信息 质量特征 再思考 会计信息是人们在经济活动中运用会计理论和方法，通过会计实践获得的反映会计主体价值运动状况的经济信息。一个企业的财务状况及其经营成果主要通过会计信息来反映。因而在现代经济生活中，会计信息是企业财务决策的语言,也成为国际通用的商业语言，它构成了整个社会经济有效运行的重要基础。而社会经济的平稳有效运行要求会计信息能够与它所反映的客观事实相符。会计信息在经济生活中的地位十分重要，依法整顿和规范会计秩序，提高会计信息质量，是一项迫切、繁重而又长期的任务。近几年来出现了很多财务欺诈案，如安然、世通等。这让我们从根本上认识到会计信息质量的重要性以及由于会计信息质量的低劣而带来的潜在的巨大风险。下面从国际会计准则对会计信息质量要求的四个方面，即可理解性、相关性、可靠性、可比性，再进一步充分认识当前会计信息质量特征问题。对“可靠性”的再思考会计信息可靠性是指确保信息能免于错误和偏差，并能忠实反映它意欲反映的现象或状况的质量。会计信息如果不可靠，不仅无助于决策，而且还可能导致错误的决策，所以，可靠性也是会计信息的一个主要质量特征。信息要有用必须具有可靠性。可靠性包括真实反映、实质重于形式、中立性、审慎、完整性。如上面“表一”所示，在调查中表明，认为可靠性差的占了50%；在一项对上市公司的信息质量调查中，调查结果显示：88%的被调查者认为多数上市公司存在信息失真现象。既然信息都没有了可靠性，那么信息本身对决策也就没有了价值。因此会计信息的可靠性对信息使用者的决策是非常重要的。在会计信息的处理上，人员把握的尺度不一样，即使是经验丰富的会计人员也可能对同一项交易事项有不同的处理方式和处理结果，这种情况会导致会计信息行为性失真，这是客观而不可避免的；会计人员的水平程度有差异，对会计制度和会计准则理解程度不一样；会计制度和会计准则的制定者对会计处理原则规定的太死，这样就不可能注重信息处理的合理性。当然我们不排除许多公司管理当局为了特定的利益存心的扭曲会计信息的真实性，欺投资者，值得我们注意的是，在中国现阶段，市场诚信意识还没有建立起来，在失去诚信不用付出巨大成本的情况下，人为主观的扭曲报表信息的现象是不可能消除的。朱元午在《会计信息质量：相关性和可靠性的两难选择——兼论我国现行财务报告的改进》中选择了一条折中的道路，得出结论：在可靠性得到基本保证的前提下尽可能的提高相关性，进而实现会计信息的有用性，可能是一种比较好的选择。相关性和可靠性都是提高会计信息质量的关键，它们与会计信息质量存在正相关的关系。广大的会计信息使用者拥有评判权利，他们的标准就是是否有用。在现阶段的中国，相关性和可靠性必须都要在很大程度上得到加强。随着最近全球资本市场爆发的会计诚信危机，学术界和实务界对会计信息质量提出了新的要求，即透明度要求。会计信息透明度这一信息质量特征概念不仅涵盖了可靠性和相关性，还进一步要求公司披露更多的信息，以恰当的方式披露恰当的信息，可以说会计信息透明度是衡量信息质量的全面概念，其中包括会计准则的制定和执行、会计信息质量标准、信息的披露和监管等。会计信息的基本特征能否实现以及这些特征的执行效果是否有效率，其实就是看它是否有用，有用的关键取决于信息使用者。这种关系将会计信息制造者和会计信息使用者用一根无形的线连接起来，形成一个搏弈的整体。1、注释[1] 潘琰，辛清泉.解读企业信息需求.中国论文下载中心，2005年1月2、主要参考文献：[1]葛家澎．会计信息-会计热点问题．北京：中国财政经济出版社，2001年1月．22～23；[2]吴联生．当代会计前沿问题研究．北京：北京大学出版社，2005年5月．148～150；[3]张丽红．论我国会计信息质量特征体系的构建．财会月刊，2006年第１期：9页；[4]崔晓钟．会计信息相关性与可靠性比较研究．金融经济，2006年第2期：18页；[5]孙铁强．会计重要性原则的理论和实务探析．会计之友（下），2006年第1期：12页；[6] 孙永芹．关于如何提高会计信息质量的若干问题的探讨．中国管理信息化
张丽红 ，管理学博士，任教前曾在汽车集团公司，从事企业管理等工作，有丰富的实际工作经验。现为管理与经济学院工商管理系副主任，讲师，硕士生导师。研究方向：现代企业理论与方法、人力资源管理在中的企业员工关系管理。为本科生开设课程：《运作管理》（双语）、《经营管理》、《专业英语》等课程；为研究生开设课程：《运作管理》、《员工关系管理》。主持和参与了原国防科工委多项科研项目和纵向企业项目。以中英文在核心期刊发表学术论文20余篇。主编内部教材1部，作为主要参编人，编写公开出版教材2部，其中《生产与运作管理》（第2版）列入国家十一五规划教材。
张丽红，女，1966年10月生。1988年毕业于中山大学图书馆学系，从2003年12月起担任广东省委党校图书馆副馆长，2006年12月被评为研究馆员。现任广东图书馆学会、广东社科情报学会理事，广东省党校文献信息学会副理事长、常务理事。二十多年来一直致力图书馆学方面的研究、教学、实践工作。曾主编《中小型图书馆数字化建设应用读本》等著作，公开发表《现代网络信息活动的道德调控》《加快我国信用信息体系建设的若干思考》等论文多篇。主要研究方向：文献资源建设、信息服务。
【摘要】 目的探析标准化护理运用在消化内镜室护理质量管理中的临床效果。方法随机将150例行消化内镜检查患者分为两组，其中对照组行常规管理，而观察组则运用标准化护理，对比两组管理效果。结果两组护理满意度和知识知晓率比较差异有统计意义（P＜0.05）。结论在消化内镜室护理管理中运用标准化护理，能够确保护理质量，提高患者满意度。
【关键词】 质量管理；消化内镜室；标准化护理
随着现代医学事业的不断发展，再加上诊疗水平的提高，越来越多患者接受内镜检查，对消化内镜室护理质量的要求也明显提高，在一定程度上给护理质量管理带来了新的挑战［1］。在护理管理中，护理质量管理作为其中的一个重要组成部分，在一定程度上对提高护理满意度有重要的意义［2］。因此，本文探讨消化内镜室护理质量管理运用标准化护理的临床价值，报道如下。
1资料和方法
1.1一般资料
选择我院收治的行消化内镜检查患者150例为研究对象，随机分为两组，每组75例。观察组中40例为男性、35例为女性，年龄19～72岁，平均（45.5±10.6）岁；对照组年龄20～74岁，平均（45.6±10.7）岁，其中女性33例、男性42例。两组的一般资料如性别、年龄等差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2方法
1.2.1对照组对照组行常规护理管理，即合理安排日常工作，叮嘱医护人员认真落实各项规章制度，在日常护理中，坚持无菌原则，做好本职工作，保持认真负责态度等。
1.2.2观察组观察组则行标准质量管理：（1）制定护理质量标准：由1名主管护师+3名护师组成标准化护理小组，组长由主管护师担任，小组成员将之前护理管理的不足和经验作为基本依据，再结合科室的实际情况，制定一套完善的.护理质量标准，动态管理、指标明确，从而实现有规可循、有据可依；（2）落实消化内镜室标准：①日常工作标准化：在实际工作中落实优化后的质量标准、工作流程以及规章制度，使护理安全提高，并且将内镜感控管理作为基本依据，对各项标准化工作流程进行检查，包括急救物品措施、意外事件以及配合护理等，对每个步骤进行规范，运用质量评分表对清洗消毒室、诊疗室、麻醉恢复室以及愉悦登记室等各项工作进行评价，对容易出错的地方进行记录，每周进行安全修改，并且对工作方法步骤进行统一管理。同时，质控小组定期对工作完成情况进行检查，一旦发现问题，及时提出来，并且对问题原因进行分析，督促改正，提高护理质量；②治疗配合标准化：对支架置入术、胃底组织胶治疗、静脉曲张套扎术、息肉治疗术中配合、病理采取配合以及胃镜检查等护理配合进行规范管理，按照开展新技术、加深记忆、分阶段考核以及计划回顾性培训等方法对发生率低的治疗配合项目进行授课，集体培训，制定相应的规章制度，使护士的理论和操作水平提高，从而增强内镜护理的专业性和规范性；③知情同意书标准化：对结石碎石术、支架置入术、内镜下扩张术、肠镜以及胃镜等知情同意书进行标准化管理，耐心给患者及家属讲解知情同意书和各项检查内容，获得患者及家属的理解和同意，并且由患者本人签署知情同意书，不能获得患者意见时，应该尊重家属选择，避免发生护患纠纷；④环境维护标准化：制定病区环境标准，对物品摆放进行规范化管理，包括专人清点、分类摆放、定期检查等，诊疗区内严禁家属进入，在候诊区等候，准备卫生纸、坐垫、薄被子等，满足患者需求，为患者提供全方位护理服务，从而提高病区环境质量［3］。
1.3观察指标
运用自制调查表评价患者的知识掌握情况，分为不清楚、基本掌握以及掌握三个等级，并且统计患者护理满意度。
1.4统计学分析
采用SPSS17.5统计软件分析数据，计数资料比较运用2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1两组知识知晓率比较
观察组2例不清楚、20例基本掌握、53例掌握，知晓率为97.33%，而对照组9例不清楚、40例基本掌握、26例掌握，知晓率为88.0%，组间对比差异具有统计学意义（P＜0.05）。
2.2两组护理满意度对比
观察组2例不满意、10例基本满意、63例满意，满意度为97.33%，而对照组12例不满意、38例基本满意、25例满意，满意度为84.0%，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3讨论
有研究发现，临床上将标准化护理管理模式运用在消化内镜中心，不仅可以使患者及家属正确认识相关检查知识，还能使护理工作质量合格率提高，增强患者满意度［4］。在消化内镜室护理质量管理中，运用标准化护理，在规定位置摆放器械、药品以及物品等，有助于取用快捷、准确，可以使工作效率提高［5］。同时，采用标准化护理，护士保持严谨的工作态度，规范知情同意书签署，使患者对检查和治疗的效果有一个正确的认识与了解，能够提高患者的配合依从性，为检查的顺利进行提供有效保障［6］。在本次研究中，观察组的知识知晓率为97.33%，高于对照组的88.0%，并且与对照组比较，观察组的护理满意度高，这一结果与李艳萍［7］、代丽萍［8］研究报道一致，提示标准化护理运用在消化内镜室护理管理中效果显著。综上所述，在消化内镜室护理管理中，采用标准化护理模式，可以使护理质量提高，增强患者满意度。
参考文献
［1］伊学珉，朱学玲.“质量控制小组管理”模式在手术室护理管理中的应用效果研究［J］.中国医药科学，2013，3（11）：140-141.
［2］钟丽梅，徐旭，孙延君.临床护理路径管理在消化内镜手术中的应用效果［J］.哈尔滨医药，2015，35（z1）：89-90.
［3］周丽华，蒋蓉，邓琼，等.PDCA循环模式在消化内镜护理风险控制中的应用［J］.护理实践与研究，2014，11（3）：105-106.
［4］巩玉艳，丁瑞东，庞丽，等.“五常法”护理模式对提高消化内镜护理质量的影响［J］.中国地方病防治杂志，2014，29（S1）：26-27.
［5］翁海风，胡坚方，杨建英，等.护理风险管理在急诊消化内镜诊疗中的应用［J］.南昌大学学报（医学版），2014，54（11）：91-93.
［6］李蕾蕾.质量控制小组管理模式在手术室护理管理中的应用价值以及效果评析［J］.中国社区医师，2015，31（10）：167-168.
［7］李艳萍.PDCA模式在消化内镜护理风险控制中的应用观察［J］.中外医学研究，2015，13（25）：105-106.
［8］代丽萍.标准化管理在护理质量管理中的应用［J］.中国社区医师（医学专业），2011，13（36）：367，369.
张丽红，女，1966年10月生。1988年毕业于中山大学图书馆学系，从2003年12月起担任广东省委党校图书馆副馆长，2006年12月被评为研究馆员。现任广东图书馆学会、广东社科情报学会理事，广东省党校文献信息学会副理事长、常务理事。二十多年来一直致力图书馆学方面的研究、教学、实践工作。曾主编《中小型图书馆数字化建设应用读本》等著作，公开发表《现代网络信息活动的道德调控》《加快我国信用信息体系建设的若干思考》等论文多篇。主要研究方向：文献资源建设、信息服务。
张丽红 ，管理学博士，任教前曾在汽车集团公司，从事企业管理等工作，有丰富的实际工作经验。现为管理与经济学院工商管理系副主任，讲师，硕士生导师。研究方向：现代企业理论与方法、人力资源管理在中的企业员工关系管理。为本科生开设课程：《运作管理》（双语）、《经营管理》、《专业英语》等课程；为研究生开设课程：《运作管理》、《员工关系管理》。主持和参与了原国防科工委多项科研项目和纵向企业项目。以中英文在核心期刊发表学术论文20余篇。主编内部教材1部，作为主要参编人，编写公开出版教材2部，其中《生产与运作管理》（第2版）列入国家十一五规划教材。
状态图基础
状态图类别
在我们开始讨论状态图设计方法以前，分清楚两种常用的状态图是很重要的。状态图（StateDiagrams）和扩展状态图(StateCharts)（后者是前者的一个扩展）。这两种类型我们都将讨论。和BetterStatePro都支持这两种类型，不过，我们关注的主要是扩展状态图。
传统上，有限状态机（FSMs）和它们的图表副本、状态图用来详细说明和设计交互（子）系统。因为它具有高度可视化和直观的特性，所以被普遍接受。FSMs可以描述有限和无限序列，这一特性再加上它的可视化功能，使它成为电子工业最受欢迎的形式之一。
传统的状态图
状态图比相应的文本解决方案更易于设计、理解、修改和文档化。传统的状态图在过去几年一直没有大的变化，因此，在今天的交互系统应用中存在局限性。在本节的后面，你将发现扩展状态图弥补了这些缺陷。传统状态图的局限性包括：
传统状态图很单调，它们不适合自顶向下的设计和信息隐藏。而且，自顶向下的设计概念需要能够交互的软件，这样可以让用户通过操作和浏览复杂的设计来获取信息。
传统的有限状态机必须是完全顺序的。然而，应用程序并不是这样。现代的交互子系统（我们称它为控制器）必须能够对环境中大多数实体发出的信号进行响应。考虑一个电话应答机控制器在接第一个电话时第二个电话等待的情况。一个传统的FSM需要计算第一个和第二个打电话者所有可能的状态组合，这会导致我们通常所说的状态溢出现象。
扩展状态图
为了弥补状态图设计的这些限制，DavidHarel在他的论文“扩展状态图：解决复杂系统的可视化方法”中描述了扩展状态图。该论文发表在计算机编程科学（1987）上。在增加了层次、并行、优先级和同步等功能的同时，扩展状态图保留了有限状态图的可视化、直观等特性。
下文讨论可用于传统状态图和扩展状态图的基础设计方法。后一部分讨论的是扩展状态图特有的设计方法。
状态图符号
状态图的主要组成部分是状态和代表状态改变和转换的箭头。状态通过大量不同类型的符号图形化表示。这些符号包括圆、矩形、圆角矩形等。BetterState使用圆角矩形来表现系统状态。
系统状态
在Webster的NewWorldDictionary（新世界字典）中对“状态”的定义如下：
“在给定时间、方法和行为的情况下，与某人或某件事相关的一组环境变量或属性集”
目前主要从事计算机图形图像处理、模式识别等方面的研究工作,主要研究领域包括人工智能、软件开发技术等。主持完成项目：河南省科技攻关项目《谷物害虫实时监测与分类识别系统》，该项目获2007年河南省科技进步三等奖；河南省科技攻关项目《医用多媒体诊断系统》；河南省自然科学基金项目《人工神经网络应用于仓储物害虫的声音识别研究》；河南省科技攻关项目《基于内容的谷物害虫图像检索系统》(项目编号：0424220188)，该项目获2008年河南省信息产业厅科技进步一等奖；河南省基础与前沿技术研究项目《基于图像处理技术的面包烘焙品质检验方法研究》。另外还参与完成了国家 “十五”科技攻关项目两项。主持在研项目：河南省科技厅重点攻关项目《基于Bag of Words模型的昆虫分类识别系统》；郑州市科技局工业攻关项目（项目编号：0910SGYG23258-3 《基于图像处理技术的小麦粉加工精度自动检测系统》。近期发表的论文主要有：“基于支持向量机的仓储物害虫分类识别研究” 计算机工程与应用 2005第41卷；“基于数字图像处理技术的储粮害虫分类识别研究” 河南工业大学学报（自然科学版）2005 第26卷 第1期；“谷物害虫图像识别中数理统计特征的提取” 计算机应用与软件 2005年3月；“支持向量机在仓储物害虫分类识别中的应用” 微电子学与计算机 2005 1月；“面包烘焙品质检验中纹理特征的提取” 计算机工程与设计 2005年9月；主编和参编教材主要有：《数据结构教程》，西安电子科技大学出版社；《C语言程序设计》，科学出版社；《 Visual Basic 程序设计教程》机械工业出版社；《 AutCAD中文版建筑制图100例》电子工业出版社等六部。
主持项目：1、河南省高校青年骨干教师基金“室内无线定位中的TOA估计技术研究”2、河南省基础与前沿技术研究项目“MIMO系统信号处理算法研究”3、河南省教育厅自然科学基金项目“MIMO-OFDM系统信道估计与检测算法研究”发表主要论文杨铁军，靳婷.一种动态整周模糊值求解算法及仿真分析[J]. 系统工程与电子技术，2007，Vol.39,No.1, p 28-31。编写教材1. 梁义涛，傅洪亮，杨铁军等，现代DSP技术及应用，清华大学出版社，2012年3月。2. 管爱红，张红梅，杨铁军等，MATLAB基础及应用教程，电子工业出版社，2009年8月。
【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 (13.2% to 86.7%), HLADR (38.9% to 97.9%), CD83 (0.9% to 97.1%), CD86 (31.2% to 92.5%) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(61.3±8.1) ng/L to (287.4±29.3) ng/L, P＜0.05〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(13.2%上升至86.7%)，HLADR(38.9%上升至97.9%)，CD83(0.9%上升至97.1%)，CD86(31.2%上升至92.5%)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(61.3±8.1→287.4±29.3，P＜0.05)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 R739.41 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 1.1材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 1.2方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 1.2.1转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 1.2.2细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 1.2.3CTL效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 10.0统计软件分析.2结果 2.1HepG2GFP总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 2.2流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 13.2%，HLADR 38.9%，CD86 31.2%，CD83低表达，仅0.9%；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 86.7%，HLADR 97.9%，CD86 92.5%，CD83 97.1%，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 2.3ELISA检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（287.4±29.3) ng/L vs (61.3±8.1) ng/L； n=6，P＜0.05〕. 2.4CTL介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（62.6±2.9）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(20.8±1.5)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(20.8±1.5)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜0.05）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(37.7±1.8)%和(26.8±1.1)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜0.05）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors 〔J〕. J Clin Invest, 2002, 109(3):409-417. 〔8〕 Kalady MF, Onaitis MW, Emani S, et al. Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells 〔J〕. J Gastrointest Surg, 2004, 8(2):175-181.