范庄小学张树高论文发表

药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1.6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆Klebsiella.pneumoniae)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，异淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 1.1蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus Var.mycodes) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 1.2嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(BaciIluS.Acidopullulyticus) 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。Bacillus.Acidopullrrlyticus呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基((pH4.8 ～5.2)上生长良好。 1.3枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为7.0～7.5，但在pH5.0时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 1.4耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的E.madi等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. 1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,Bacillus.Acidopullulyticus 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 1.6产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, pH6.0o 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 3.1单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 3.2普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量1.5%(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，pH5.8;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加14.8，麦芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均减少了26.7高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 3.3用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella.pneumoniae)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从0.069u/mL提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和4.5，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值4.0，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达350.8U/mL，最佳发酵条件下产量可达504.5-510.1U/mL .酶的最适作用温度为600C，最适pH值4.5，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到B.subtilis中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到B.subtilu:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在E.coli中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到E.coli中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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张之屏（1866～1935），字树侯，安徽寿县瓦埠乡曹家岗村西邢家岗人，生于清同治五年（1866年）。其父张子兰，中过秀才，因生活所迫，就馆寿县。树侯幼年从父兄读书，不久，父亲去世，靠兄长西园、朗轩抚养成人。树侯在求学之余，也做些杂活，如推磨种菜之类。 1890年，张树侯考上秀才。此后，他渐渐接触了反清思想，产生了革命抱负，因而放弃科举考试。为了摆脱家庭的拖累，便于进行革命活动，遂将老母、妻子迁依岳家曹氏，即曹少修烈士先人之家，在寿县瓦埠地方。1898年，张树侯与同乡数人密谋革命，创办了“强立学社”，与孙毓筠所办的“阜才学堂”共同在寿州传播反清革命思想。接着，寿州有志之士，如孙养癯、段云、权道涵、石寅生等先后东渡，留学日本，寻求出路。他为了学习军事，培养革命力量，扩大革命活动，乃于1904年和张子嘉、吕宪集、吕竣泉、孙卓如等数十人，考入安庆武备练军学堂，并与柏文蔚等革命党人相联络。1905年春，他改充安庆鸣凤学堂教习，以为接洽密会场所。原先，有皖北人郭其昌，是哥老会首领，谋在安庆起义未成，被捕下狱。树侯潜入狱中与郭其昌通气，了解到匿迹省垣的哥老会地下组织，遂与联系，集结党人，多次密商，议定外联豫皖会党，内集在省的革命志士，共谋大举；标营中以柏文蔚为内线，先夺械弹，攻占省城。其时，树侯有书愤一诗云：“昆仑东下五千年，莽莽神州我占先。太息武功凋谢尽，乘时恢复莫盘桓。”当得知同盟会于东京成立时，又有一诗云：“同盟军书传海外，三千侠士仗江流。中原从此除膻种，汉族还须再出头！”由于他的活动频繁，风声所播，为寿州豪绅孙某侦悉。孙某径向两江总督周馥告密。周馥密檄皖抚，先杀郭其昌于狱中而不布，同日晚，又派兵来围鸣凤学堂，意图逮捕他。幸为同乡卞秉粲（寿县人，当时名华章）得悉，急来鸣凤学堂通知张树侯，他立即逃走，同前来捕他的兵，相距甚近，仅隔前后门而已。其在《晚菘堂谈屑》中记有：“时将天晚，在院纳凉，悉讯后，为避人疑，手持芭蕉扇一把，伪为大便，光脊而出。”时霍邱人郑赞丞（芳荪）及李广缙（又名北申），均系淮上志士，在皖南广德筹办矿务局，遂奔就之，暂在那里隐避。清吏逮捕落空，便下令通缉，一时风声险恶。张树侯怕致郑、李受累，乃潜走杭州，依西湖韬光寺和尚，隐伏暂避，化名“尹其康”，法号“隐康”。并得与浙省革命志士相往还，一住数月。迨至缉声稍懈，始返芜湖，应李光炯之邀，还俗，就任皖江公学经学讲师，得与吴旸谷等相结识，遂参加同盟会。在离杭时曾有诗云：“骇浪惊涛卷地来，血花剑影事堪哀。武林一去几千里，浙水吴山日溯洄。”在芜湖曾有诗示同仁云：“漫言祖国凭谁挽，要识民权自有真。万里沙场三尺剑，愿将鲜血洗乾坤！”又有：“频年碌碌走风尘，车马关河总怆神。世界大千犹有憾，鸠江讲学亦论兵。”可见，他反清的革命思想是很坚决的。当时革命，南方特盛，清廷对南方更是严加戒备。张树侯分析当时形势后，认为北方还有隙可乘。适有卞秉粲、杨端甫在吉林胡殿甲处供职。胡殿甲也是寿州人，任吉林军统领，兼吉林陆军小学总办。经卞秉粲等向胡殿甲推荐，聘树侯为陆军小学教习。他于1906年秋初，毅然出塞，并约有六安彭卓甫、霍山朱则羲等人同赴东北。时柏文蔚也在东北。当时吉林省的革命活动，咸以张树侯和柏文蔚为领袖，壮志雄心，密谋大举，惜在事将成熟之时，为吉林长官达桂侦悉，派队逮捕他们，幸在胡殿甲的保护下，得以脱险。张树侯和卞秉粲两人化装夜走延吉岗，不能立足，乃潜越国境，到朝鲜清津投陈其顺。陈其顺是东北人，时招募吉林边境流民（中、朝均有）两万余人，在清津为朝鲜拆城筑路。张树侯以同胞身分投效，得为陈其顺办文牍，日渐接近，并向陈其顺解释反清革命道理，动员他率领拆城工众参加起义，深得陈其顺欣许，并把他的话，名之曰“打江山”。那时拆城工众多系赋敛所逼，生活无路而来，所以一招即应。于是，一面派卞秉粲往日本谒中山先生，商筹款械，一面又派工长某东北人与有关方面相联系，计划进扑吉林并策动胡殿甲为内应，期以吉林为根据地。不意卞秉粲到日本时，适中山先生亲赴蒙自发难，因时间较久，清津拆城筑路已告竣工，不得不将工众遣散，而柏文蔚等也都已南返，因此起义计划没有实现。张树侯嗟叹不已，作诗云：“吉林西去走车难，石子垒踉路百盘。壮志豪情余涕泪，灯光剑影照心肝。”1907年，张树侯遄返家乡，就芍西学堂教务，仍以反清革命思想灌输学生，曹蕴真、曹渊、方运炽、曹鼎等均是他学生，深受其影响而走上了反清革命道路。同时与家乡革命同仁相联系。次年春，熊成基、范传甲安庆举义失败。熊成基来寿县，就访于芍西学堂。树侯意欲留熊成基在寿，约同仁举民团以应之，而熊成基认为皖省环境险恶，乃远走省外，不幸在吉林就义，范传甲亦在安庆牺牲，一时皖省反清革命转向低潮。1909年春，树侯离芍西教职，与郑赞丞同赴上海，在沪组织革命机构，寓李少川家。李家为苏、皖间反清人士的联络机关。树侯专任各方联络工作。1910年间，在沪同志咸以内地发展为重要，一旦首义，才有群众基础。树侯遂与张汇滔、管鹏等先后转回寿县，组织力量，来往城乡各地，联络乡里武装，为辛亥的淮上军开创了基础。1911年春，各方同仁，群集广州，将谋大举。张树侯与董少亭动身前来，及至九江，得悉广州起义失败，乃复回里门。是年秋，武昌起义，淮上军崛起寿州。树侯与瓦埠的方振九率乡里子弟自瓦埠湖东，迂回到湖西各集镇，城乡均兵未血刃而光复。十月初，淮上军出师毗邻各县时，他先则率众到合肥与孙品骖相会，继则时而寿县，时而六安，时而阜、颍，与张汇滔、权道涵等人，共策整军安民计划。据权道涵生前谈，淮上军所到之处，军政府印均为张树侯所手刻。民国成立以后，有些人争官、争利，喧嚷一时，而张树侯一向是奔走劳瘁，决不钻营宦途。1912年自题小照诗云“试把余生付金石，更将遗恨托芸编”，大有借书画以了天年之慨。袁氏称帝之际，各地酝酿倒袁，他为黄少泉写了一些诗，这里录二首。诗云：“汉上军声卷地来，江淮千里战云开。浔阳九派岩关壮，赖有将军筑炮台。”“帝业于今已化羊，一肩行李莫还乡。溯风凛冽方凄紧，漫把良弓一例藏。”这时，倪嗣冲督皖，仇视党人，东南五省通缉张树侯的命令齐下，被迫匿于肥西童茂倩家。时川督陈宦，系童茂倩的学生，藉此渊源，张树侯离开合肥，潜走六安，偕同徐迂亭经鄂入川。未几，云南护国军起，他和迂亭指陈利害，策动川督归附，以讨袁军。1916年，张树侯返回家乡。继此，北洋军阀当道，国事日非，他决心不参与军政活动，打算隐居教学。1918年，张树侯曾受聘在北京女子师范大学任教，讲授经学与书法。时值五四运动，他目击时艰，再次愤然归里，匿迹于寿州、六安、合肥等地乡间。大革命伊始，设帐于肥西童茂倩家，每与童老谈及时政，追怀中山先生，曾有句云：“北上燕京拯故国，遗留三策共千秋（指联俄、联共、扶助农工三大政策）。”当“四·一二”惨案消息传来，曾以书愤诗二十首加以抨击，兹记其一首云：“风云义烈感沧桑，痛哭血花溅沪江。新义三民嗟幻影，神州暗淡恨茫茫。”此时，其子张曙云（原自上海大学随周总理至广州，进黄埔，从军北伐，加入共产党）在北伐军总部任编辑，来信问时事，复信中根据他自己的见解，有云：“当今青年，如大海孤舟，方向为主，一时逆风起处，澎湃狂澜，则飘荡中流，不知所止，尔曹其勉乎哉。”并有诗云：“应识庐山真面目，漫将璞玉当石沙！”1925年，袁子金北伐驻军石家庄，于民间得戚继光遗砚。袁归里后，以示张树侯，属为之铭。此砚为广东端砚，长方形，抄手式。长17 厘米，宽11厘米，厚6.5 厘米。石质细腻，雕琢精巧，又系名人用砚，为端砚中之珍品。左侧行书戚继光铭文，曰：“他山之石，允文允武，决疑定计，取君之府，军书飞驰，日傍午，传檄天下惟赖汝，四海一，与汝息。继光铭。”右侧张树侯隶书曰：“民国十四年，袁子金师长北伐驻军石家庄，得戚南塘少保遗砚于民家。归里后，以示张树侯，属为之铭。铭曰（篆书）：‘明季多难，少保以生，今复多难，赉在将军，古人往矣，此传薪。’”1930年，张树侯应友人李少川约去上海，居沪二载，多结翰墨之缘。1932年，张树侯以自己在燕京大学习字科教学讲义为基础著述的《书法真诠》在上海出版，《书法真诠》与以往的书法理论著作相比，呈现出思想解放认识超前、思辨深刻见解独具、语言精练立说严谨等特点。 1934年，应前安徽省烈士省葬委员会之请，为辛亥以来安徽死难烈士撰刻碑文而回居安庆。朋辈为之欢欣，各省友人，咸以诗文寄颂，陈独秀、段祺瑞、汪兆铭、孙科、柏文蔚、于右任、翁文灏、齐白石等均寄有贺幅，达近千件之多。甚至有从海外寄画者。1935年4月18日拂晓，张树侯在安庆南庄岭省葬委员会内住处逝世。先生身后，纸笔一束，清风两袖。老友柏文蔚、权道涵、孙养癯、江彤侯等缅怀旧谊，为之集资公葬于安庆城西烈士祠后院内（老火药库的旧址）。张树侯在书法、篆刻艺术上均享有盛名。书法各体兼优，隶书更擅其长。客居省城安庆，《学风》杂志载文称“求书者日夕盈门，有洛阳纸贵之势”。晚年喜画梅花。《申报》于1933年发表过他的一幅梅花图，并附之以跋云：“先生沉酣八法，指研篆刻，以倒海屠龙之手，写暮年伏枥之心……”