液体活检的发表论文

2022年2月15日，非因生物以第一作者和通讯单位、联合美国纽约圣约翰大学陈哲生教授等在《Molecular Cancer》杂志上（ IF：27.401 ）发表了题为“Proteomics technologies for cancer liquid biopsies”的综述性文章，回顾了包括RPPA在内的多种高通量蛋白质组学技术在肿瘤液体活检中的研究进展及临床转化应用策略。 本文简要介绍了能够从液体活检样本中同时检测至少数百种蛋白质的高内涵蛋白质组学技术原理（图1），包括：RPPA反相蛋白微阵列技术（非因生物提供）、质谱技术、抗原/抗体阵列技术、基于核酸适配体（Aptamer）的检测技术和邻位延伸技术（PEA），并比较了上述各技术的优劣势（表1，嫌长不看也要看的表），同时介绍了各技术在癌症液体活检研究领域和临床转化方向的应用进展。（ 原文链接： ） 蛋白组学液态活检生物标志物研究背景 与肿瘤诊断的“金标准”组织活检相比，液体活检可通过最小入侵方式获得检测样本，同时克服异质性，实现动态监测。目前用于液体活检的体液主要为血液和尿液，但理论上，液体活检适用于任何人体内循环或其他人体相关的液体（图2）。作为大多数细胞功能的直接执行者和当前大多数癌症治疗中的直接药物靶标，多重蛋白质组学数据的分析，可能会在癌症进展的所有阶段实时提供更加宝贵的临床相关信息。液体活检样本中的蛋白质组具有巨大复杂性，如蛋白质丰度和翻译后修饰持续且快速的变化，同时蛋白质组技术与高度复杂的测序技术相比仍存在一定局限性，导致蛋白质组学的探究仍然落后于基因组技术，且目前临床转化效率极低，仅通过40多个基于液体活检的蛋白组生物标志物。因此，迫切需要新的蛋白质技术来实现在癌症液体活检中发现生物标志物的目标。 各技术比对 一、 质谱技术（MS） 由于体液样本中蛋白的复杂性，现代质谱技术通过不断优化样本制备方法、开发蛋白定量技术以及改变质谱扫描模式来提高检测精度。质谱法无需假设驱动，可以无偏倚地对样本中的蛋白进行扫描，因此可作为癌症体液样本早期生物标志物发掘的首选方法。目前基于质谱的生物标志物策略主要有：（1）在发现、核实、验证三个阶段，样本数量递增，而检测蛋白范围逐渐缩小的 “三角策略” ；（2）在发现和验证阶段均用“鸟枪法”在大样本队列检测尽可能多的蛋白，平行分析显示共同显著差异的蛋白可作为准生物标志物的 “矩形策略” 。目前基于质谱的液体活检已应用于卵巢癌、泌尿系统癌症、结直肠癌等多种癌症。但如想将质谱应用于广泛的临床试验，还需简化和标准化检测流程、提高检测的通量、精度和鲁棒性，并突破对翻译后修饰蛋白的检测局限性。 二、抗原/抗体阵列技术 抗体阵列 是将特异性抗体固定到带有修饰的平面基质上，通过荧光、化学发光或寡核苷酸标记的方式对样本进行多重靶标（通常为几百种）检测的方式。适用于血清学分析，如肿瘤相关的低丰度分泌蛋白的检测。但受到检测通量、检测动态范围、以及批次效应和信号饱和度、定量精确度的限制，抗体阵列仅可作为基于体液的蛋白组学分析的方法学之一。 抗原阵列 又称功能蛋白阵列，可作为抗原检测平台来检测抗体组成的细微变化，其早期热点应用是通过血清自身抗体（AAB）来进行生物标志物的研究。最全面的人类抗原阵列覆盖超过81%的蛋白，是血液蛋白全景分析的强有力的工具。但抗原阵列的靶点扩展、可重复性、批次效应和高昂的成本，仍使抗原阵列的应用有所局限。 三、 基于适体的检测 SOMAscan是目前高通量蛋白组检测的“新贵”工具，基于能够与不同蛋白质进行紧密结合的慢速率修饰的蛋白质适体（SOMAmer）进行检测。SOMAmer是寡核苷酸配体，结合上可光解的接头或荧光标签，通过构象识别与待测靶标结合，经生物素介导的纯化后，紫外光照射洗脱SOMAmers，并对其进行表征和定量已反应待测样本内的蛋白丰度。该方法具有超高特异性和亲和力，以及较低的批次间差异，目前可平行分析7000+种蛋白质，在结直肠癌和非小细胞肺癌的临床相关的生物标志物筛选中起到关键作用。但与抗体检测相比，现阶段可供研究使用的适体种类有限，尤其是翻译后修饰蛋白为导向的适体开发仍处于初期阶段。同时由于适配体对抗原决定簇的超高亲和力，在蛋白标志物研究的进程中会受到大量信号干扰，影响检测准确度。 四、邻位延伸技术（PEA） PEA结合了基于抗体的免疫分析（ELISA）和PCR或二代测序（NGS）技术，与质谱检测相比，实现了用更低的样本量检测更广泛的动态范围，高灵敏、高准确、可重复且高保真识别。最先进的PEA检测目前由Olink商业化，可对3072个靶标进行标准测量。PEA首次应用于结直肠癌血液预后标志物的鉴定，后续应用于卵巢癌、前列腺癌等癌种的早期检测、伴随诊断和疾病监测。PEA检测与读取方式（qPCR、NGS）相关，当进行大队列样本分析时，仍需考虑实验误差和批次效应，其次翻译后修饰蛋白的研究对于抗体对开发具有很大瓶颈，对其捕获受到一定限制。 五、反相蛋白微阵列技术（RPPA） RPPA起源于20年前，是将完全变性的蛋白裂解液固定在特殊载玻片上，通常每种裂解液会进行浓度梯度稀释，接下来用验证好的高度特异性的抗体孵育点样后的载玻片，通过信号放大化学显色或荧光检测捕获定量信息（图3）。RPPA可广泛应用于几百到超过一千个大样本的超稳健平行分析，定量精准，可对500+种细胞表面受体蛋白、细胞信号关键蛋白及蛋白修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）、蛋白酶类、转录因子等各类代表性靶标进行分门别类的系统深度检测，包括直接和间接的上下游蛋白网络分析。基于以上特征，RPPA广泛应用于癌症基因组图谱项目（TCGA），其公共数据集可在线获取（TCPA，）。RPPA由于其最小的批次差异，可以作为蛋白质生物标志物验证的强大工具，并已成功应用于肺癌的新型生物标志物验证。另外，对外泌体蛋白的检测也成为RPPA在癌症液体活检中的另一项热点应用。 非因生物在国内搭建了基于MD安德森金标准的RPPA分析技术平台，先期完成了一系列工作流程的开发、验证及优化，不断扩展抗体库，并且建立了完备的生信分析体系。帮助国内科研，临床及工作者及广大药物研发相关用户快速高效开展疾病，尤其是肿瘤相关信号通路全景分析、分子机理挖掘、肿瘤相关药理学研究及靶向药物开发。RPPA复杂的技术流程和严格的抗体筛选过程将不再成为国内科研工作者的开展基础和转化医学研究的绊脚石。（点击下方“ 阅读原文 ”，了解详情） 展望 未来，在蛋白质组学技术不断发展的前提下，各技术之间的联合互补应用可以作为可行的、基于肿瘤体液活检的生物标志物正交验证策略(如图4所示)。非因生物依托RPPA技术等各项新型组学技术，将肿瘤精准治疗研究和转化作为核心使命，我们期待着一个更加精简但连贯且标准的蛋白类生物标志物开发流程的出现，并最终应用于癌症转化医学研究。

靶向治疗在驱动基因阳性的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中疗效显著，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)已经成为NSCLC的常规治疗。随着临床研究的深入，EGFR的突变状态也已发展为全病程多次监控，以应对不断变化的病情。循环肿瘤DNA(ctDNA)是药物伴随诊断、反映疾病实时进展的优秀标志物，但其含量少、背景噪音高，对于检测方法有极高的挑战。数字PCR技术具有极好的灵敏度和特异性，搭配通量更高、位点更全、成本更低的检测试剂，将能更全面更快速的解析ctDNA，未来能更好的服务于临床。 近日，沧州中心医院宋翔教授团队和河北中医学院中西医结合肝肾病证研究省级重点实验室楚立教授团队与艾普拜生物合作，对“数字PCR panel检测”技术的各项性能进行了全面的评估，并用临床样本验证了其在ctDNA疗效监测上的实战效果，相关学术成果于2020年8月12发表在British Journal of Cancer杂志上(IF:5.791)。   研究方法:  本研究使用艾普拜生物研发的“dEGFR39”数字PCR panel检测试剂，可单次检测EGFR的39个突变位点，包括L858R、19Del和T790M等常见突变位点，以及L861Q、S768I、G719X、C797S(cis/trans)和20ins等罕见突变位点。本研究收集了30例NSCLC患者的回顾性FFPE组织和33例NSCLC患者的配对组织、血浆样本进行分析。   研究结果:   ▼“dEGFR39”试剂分析灵敏度达到0.01% “dEGFR39”检测试剂具有极高的灵敏度，远超ARMS-PCR方法。该研究比较了预期突变丰度(0.01%、0.05%、0.1%、1%、10%)与实测丰度的线性关系，R2接近1。 ▼“dEGFR39”试剂具有更高的血浆游离DNA突变检出率 以33例晚期NSCLC患者的组织样本突变检测结果(ARMS-PCR法)为对照，使用“dEGFR39”试剂盒测试配对血浆样本，T790M的检出率提高了60%。 持续采集33例患者血浆样本，同时用dPCR技术和SuperARMS PCR技术进行检测，“dEGFR39”发现8例患者的13份血浆样本为T790M突变，而SuperARMS PCR仅能检出69%(9份)的T790M突变。 ▼“dEGFR39”液体活检指导肺癌个性化治疗，提早数月提示肿瘤进展 在埃克替尼治疗368天的患者P-15血浆中，除了原L858R突变外，dEGFR39已检测到耐药位点T790M的出现，比影像学疾病进展提前121天。类似的，在具有19Del突变的P-25患者身上，也提前影像学43天观测到耐药突变位点的出现。患者P-23中，随着埃克替尼的治疗，dEGFR39检测到的L858R的突变丰度不断下降，CT也显示患者治疗有效。之后发现T790M丰度上升，及时更换治疗方案后患者病情又趋于稳定。   优势:   基于Naica数字PCR技术的“dEGFR39”panel检测方法可靠、灵敏、快速、位点多，在预测EGFR-TKIs治疗后的耐药、治疗监控及临床预后等方面体现了明显的优势。