1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。但是什么，他不清楚。 1836年，德国科学家施旺（—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质。解开胃的消化之谜。 1926年，美国科学家萨姆钠（—1955）从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。 20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。 20世纪80年代，美国科学家切赫（—）和奥特曼（—）发现少数RNA也具有生物催化作用。酶有催化作用，有3个特性，1、高效性，2、专一性，3、多样性，4、温和性。
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正常腰椎间盘是由纤维环、髓核及软骨板构成。人体椎间盘髓核是一个高度含水的组织，水分占80%～90%；干性成分中，蛋白多糖占65%，胶原约占25%，胶原纤维无定向排列成一疏松的立体网络。纤维环中水分占60%～70%；干性成分中，蛋白多糖占20%，胶原占60%。椎间盘内主要含有Ⅰ型和Ⅱ型胶原分子，从纤维环的外层到内层，胶原构成由Ⅰ型逐渐变为Ⅱ型。Ⅰ型胶原提供纤维环的张力强度，Ⅱ型胶原提供承受压力强度。当腰椎间盘突出时，髓核中的水分含量下降，胶原含量可达60%或更高。Bromley等〔5〕用狗进行的实验认为：胶原酶注入盘内剂量达400u～500u时，有纤维环内缘的轻微溶解，超过这个剂量溶解作用将增加，但也只是纤维环内缘的溶解，注入胶原酶2w之后溶解程度不再增加。孙磊等〔6〕将胶原酶注入兔椎间盘内后观察到：胶原酶注入盘内24h，可见髓核结构破坏；1w后髓核浓缩，纤维组织增生；2w时椎间盘髓核结构界线不清；4w时椎间隙狭窄，髓核结构消失。被纤维软骨替代，但纤维环的外层胶原纤维结构无变化。Sussman(1968)〔4〕首先提出并证明胶原酶可以溶解术中切取的人体椎间盘组织，证明胶原酶能迅速地、选择性地溶解髓核和纤维环中的胶原纤维。Sussman(1975)〔7〕进行的毒性试验表明：胶原酶行盘内、静脉内、腹腔内、脊柱旁及硬膜外注射有相当大的安全范围，胶原酶对透明软骨、骨及成熟的纤维组织如前、后纵韧带作用极小，对硬脊膜、马尾神经等接触也不会造成损害，腰神经根等神经实质对胶原酶不敏感，但认为胶原酶鞘内注射可引起严重的并发症。3 胶原酶用于腰椎间盘突出症治疗中的若干问题 胶原酶治疗机理 胶原蛋白水解酶(collagenase，简称胶原酶)，其化学本质是蛋白质，是一种有催化作用的高度特异性生物催化剂，是唯一能作用于胶原组织螺旋结构的酶，能在生理pH值及温度条件下水解天然胶原纤维。人体内源性胶原酶与胶原分子在细胞内共同合成，以酶原的方式处于潜伏状态〔8〕。当椎间盘内环境改变或受到机械作用时，椎间盘纤维细胞崩解，酶激活物进入基质激活处于酶原状态的胶原酶，使其具有生物活性，胶原纤维出现降解。降解的结果引起椎间盘本身出现自溶，使纤维环强度下降，出现裂隙或破裂，并引起相应的临床症状。当外源性胶原酶以酶原的形式大量注入病变的椎间盘，便被其中的酶激活物激活。胶原酶被激活后作用于胶原分子的全部3条α-链，距氨基酸端的3/4处，将胶原分子水解为3/4和1/4两个片段，使之溶解度增加，易解链变性被其他 蛋白酶水解〔9〕，最终降解为相关的氨基酸，被血浆中和吸收。由于椎间盘的总体积明显缩小，从而使突出物减小或消失，对神经组织的压迫得以缓解或消除，临床症状得以改善或消失。 胶原酶治疗对象选择 对胶原酶治疗对象的选择至今仍缺乏统一认识，国内外至今尚无统一标准，如何选择病例，提高治疗效果，是有待进一步探索和研究的课题。有作者〔10〕提出对椎间盘向侧后方突出大于10mm，椎间盘突出伴钙化、伴侧隐窝狭窄等均可列为适应症。目前国内多数学者比较一致认定的是：单侧腰腿痛有明显神经根压迫症状；经系统保守治疗无效者。凡伴有过敏体质、马尾综合征、代谢性疾病、椎间盘炎或椎间盘感染、心理变态、腰椎管狭窄或脊椎滑脱、非椎间盘源性腿腰痛、孕妇及14岁以下儿童、突出物游离于腰椎管内及突出物已钙化或骨化者均不宜列为治疗选择。适应症的选择恰当与否，直接关系治疗效果，故此笔者认为对治疗对象应慎重选择，不宜过宽。 胶原酶治疗方法 目前临床上主要有以下5种方法：(1)经皮斜刺或侧方直刺椎间盘(盘内)注射法。此法是经典注射法，适用于各种类型的椎间盘突出，尤其适用于椎间盘膨出、中央型突出或偏斜不重者。其穿刺途径安全，定位客观，精确可靠，效果确实，但操作要求准确。笔者主要采用此法，我们认为此法具有针对性强，直接溶解胶原纤维的作用。(2)经皮椎间孔硬膜外侧隐窝突出物局部(盘外)注射法。此法适于突出物偏向一侧，而且突向神经根管，临床有神经根刺激症状者。此法针对突出物，准确性要求高，术中需造影确定，效果可靠。(3)经椎板外切迹或小关节内缘行硬膜外侧隐窝穿刺法。此法系盘外注射的改进法，由宋文阁等〔11〕提出并应用于临床。此法进路骨性标志清楚，定点明确，进针角度和方向固定，可变范围小，但其应用时间较短，目前临床报道较少。(4)经皮棘突旁硬膜外注射法。它是经椎板间隙利用硬膜外套管注射法。适用于多间隙突出或老年体弱有明显骨质增生并有骨桥形成者。在操作时需在最高位间隙穿刺插管，并将硬膜外导管送到最低突出间隙，边退管边向突出区域注药。此法简单、安全，但效果不如其他方法 。(5)经皮切吸与胶原酶注射联合法。此法是先将椎间盘髓核组织吸出，使椎间盘内压力降低并有一定空隙，再注入胶原酶，使药液均匀地渗透到纤维环部，髓核及纤维环得到充分溶解。但其操作复杂，外套管针较粗，创伤相对较大。目前国外均采用盘内法注射，国内盘内、盘外均有使用。 胶原酶临床疗效及与手术疗效对比 目前国内报道胶原酶治疗优良率在60%～84%，有效率在83%～96%。笔者治疗25例，优良率为74%，有效率为92%，基本上报道一致。经过比较，盘内法与盘外法治疗疗效并无明显差异。Weinstein(1986)〔12〕将胶原酶注射与手术组进行了详细比较，其结果为：化学溶核组治疗后近期疼痛缓解者为51%，手术组为41%；3个月后疼痛缓解者化学溶核组为75%，手术组为70%；1年后化学溶核组为86%，手术组为80%；2年以上无需其他治疗者分别为86%与88%。治疗后第一年度复发率化学溶核组12%，手术组18%；10年后化学溶核组为32%，手术组为39%，需再次手术。治疗后短期感觉良好，恢复工作者化学溶核组为90%，手术组87%。根据比较，化学溶核组的有效率高于手术组，而复发率却低于手术组。化学溶核术显得更为优越。 胶原酶治疗的副反应与并发症 副反应 ①疼痛反应。一般在治疗后3～10天疼痛可比治疗前加重，但笔者体会往往多在注药后1～2h后即开始出现疼痛加重。其原因是胶原酶的注入增加了盘内容积，同时胶原纤维在胶原酶作用下出现降解。导致椎间盘内容物增加，使盘内压升高及降解过程中的化学刺激反应，窦椎神经受到激惹后出现的〔13〕。 ②尿潴留和肠麻痹。是由于盘内压力增高后窦椎神经受到激惹引起植物神经功能紊乱所致〔13〕。 ③脊柱失稳性腰背痛。椎间盘溶解后椎间隙变窄，小关节将出现重叠，对窦返神经的刺激，出现反射性腰背部不适和疼痛。 并发症 ①过敏反应。胶原酶作为一种生物制剂，存在过敏反应的可能。杨述华等〔14〕报道1例二次注射发生过敏反应；谢国华等〔15〕报道1例于注射后8h出现过敏性休克。 ②椎间隙感染。主要表现为腰肌痉挛，腰痛加剧，有深压痛，白细胞计数和分类可正常或升高，血沉增快。高翔等〔16〕报道1例椎间隙感染。 ③神经损伤。多为穿刺针刺伤脊神经根或穿刺过程中误伤脊膜或神经外膜，高浓度胶原酶使神经根发生脱水、变性，一旦误入蛛网膜下腔，轻者出现化学性脑膜炎，重者可发生截瘫。高翔等〔16〕报道2例神经损伤致腓骨长、短肌瘫疾，经治疗后一个月恢复。汤华丰等〔17〕报道全麻下2例产生腰神经根症状，半年后随访尚未完全恢复。鞠作金等〔18〕报道1例出现化学性脑膜炎及严重的神经根损伤，术后1年随访肌力仍未完全恢复。 ④继发性腰椎管狭窄。 尚未解决的问题 胶原酶用量问题 目前报道盘外注射胶原酶用量基本一致，都为1200u；但盘内注射用量尚未完全统一，各家报道有400u、600u、1200u三种规格。另外，椎间盘病变程度与所用胶原酶剂量问题尚未达成统一标准。 有关造影剂使用问题 目前盘外注射一致使用造影剂进行定位，而盘内注射定位时是否非要使用造影剂问题并未达成一致，各家观点不一。临床上有单纯靠腰椎正、侧位定位的，也有在此基础上注射造影剂行椎间盘造影定位。另外，造影剂是否对胶原酶的溶解作用产生影响这一问题仍未见有系统研究报道。 副作用和并发症问题 如何有效地预防和治疗胶原酶注射产生的副反应及并发症，目前尚未达成一致的方案。另外，对所有治疗的病例进行系统、完整的CT及X线复查结果方面，仍未见有完整、准确的临床报道。 综上所述，只要严格掌握适应症以及正确熟练的操作方法，胶原酶注射溶解术不失为一种有效的治疗方法。且疗效与手术治疗无明显差异。它住院时间短、操作较简单、并发症少、痛苦小、病人负担较轻且安全有效，即使失败也不影响再次手术，为腰椎间盘突出症增加了一种可供选择的治疗方法。相信随着胶原酶基础研究的不断深入及临床应用的进一步开展，胶原酶注射法必将成为继传统保守治疗之后首选的治疗方法，值得临床推广应用。参考文献1 Mixter WJ,Barr of the intervertebral disc with involvement of the spinal Eng J Med,1934,211:2102 Hirsh on the pathology of low back Bone Joint Surg,1959,41B:2373 Smith dissolution of the nucleus pulposus in (2):1374 Sussman clisolysis with Natal Med Assoc 60(may),1968:1845 Bromely JW,Varma AJ,et evaluation of collagenase injection for herniated lumbar 孙 磊，宁志杰，王培杰，等.胶原酶椎间盘内注射后的形态观察.中国矫形外科杂志，1997，4(5)：3947 Sussman NeuroSurg,1975,42:389～3958 张昌疑.主编.生物化学.第2版.人民卫生出版社，1984：85～1169 Smith of York:Mc Graw-Hill,1983:22310 王执民，王义清，吴智群，等.注射胶原酶治疗腰椎间盘突出症的临床应用研究.实用放射学杂志，1997，13(8)：458～46011 宋文阁，傅志俭，马 玲，等.硬膜外腔侧隐窝穿刺的研究.中华麻科学杂志，1998，18(4)：25012 Weinstein JN,Lehman TR,Hejna versus open discectomy-a ten year follow-up Orthop,1986,206:5013 刘 伟，杨 华，雷云坤，等.注射用胶原酶治疗腰椎间盘脱出症疗效及影像学分析.云南医药，1999，20(1)：29～3014 杨述华，杜靖远，罗怀灿，等.化学溶核术治疗椎间盘突出症的临床研究.中华骨科杂志，1996，16(7)：415～41715 谢国华，蒋慧娟.胶原酶盘内注射治疗腰椎间盘突出症.江苏中医，1999，20(2)：3216 高 翔，李加坤.胶原酶注射治疗腰椎间盘突出症.中国厂矿医学，1999，1：7～817 汤华丰.丁鑫昌.髓核化学溶解(胶原酶)治疗腰椎间盘突出症30例近期随访报道.中华骨科杂志，1989，9(2)：88～9018 鞠作金，吴旭东，赵勇进.胶原酶溶解术治疗腰椎间盘突出症严重并发症1例.骨与关节损伤杂志.1997，12(6)：325
从碱性土壤中分离得到一株高产碱性果胶酶的菌株S-2,对该菌株进行形态特征和生理生化鉴定,确定其为革兰氏阳性,杆菌,有芽孢;并用16SrDNA方法分析,该菌株与吉氏芽孢杆菌DSM 8722（Bacillus gibsonii DSM 8722）的序列相似性为99%,因而鉴定其为吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）。 对吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）S-2菌株产碱性果胶酶的固态发酵条件优化表明:甜菜渣是最适碳源和酶的诱导物,酵母膏为最适氮源;最佳固体培养基的组成为:甜菜渣5g,酵母膏 30mg,MgSO4·7H2O 27mg,水15mL;对吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）S-2的培养条件进行优化的结果为:种龄为24h,接种量2ml,培养温度35℃,发酵周期48h。在此条件下产酶率为3700u/g。 对发酵后酶的提取工艺研究表明:用30倍体积的的Na2
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果蔬汁加工技术的应用进展
摘要 ：果蔬经过制汁后比原果更容易贮藏，含有丰富的营养成分，且在减少果蔬原料的损失的同时提高其附加值。本文综述了果蔬汁加工过程中破碎榨汁技术、过滤澄清技术、均质技术、浓缩技术和杀菌技术的应用进展。
关键词 ：果蔬汁 加工技术 应用进展
近年来，随着人们生活水平的逐步提高，对日常饮品的“营养、安全、健康”更为关注和重视。果蔬汁在口感及营养方面都接近新鲜果蔬，并且和具有一定的保健价值，受到各年龄阶段人们的喜爱。不同果蔬汁的加工方法不同，但某些关键技术是相似的。本文主要介绍果蔬汁加工技术中破碎榨汁技术、膜分离技术、超高压技术、高压脉冲技术和酶技术的应用进展。
1. 破碎榨汁技术
根据果蔬不同的形状、特性及加工需要，选用合适的破碎设备，并结合相适宜的破碎工艺进行破碎。常用的破碎工艺可分为热破碎和冷破碎。通常情况下，为了生产得到组织形态好、具有一定粘稠度的果蔬汁，可以运用热破碎，通过抑制和破坏某些酶的活力，如果胶分解酶、脂肪氧化酶等，从而达到破碎效果。[1]果蔬汁榨汁过程中，果蔬中所含有的果胶、淀粉、纤维素等物质会影响果蔬的出汁率，导致果蔬出汁率降低。采用酶技术处理果蔬原料， 即可提高产品出汁率， 该技术不仅可提高产品的澄清度， 且能防止果汁产生沉淀。[2]
2. 膜分离技术
传统的澄清方法是对果蔬汁进行酶处理，如果胶酶等，再用明胶、单宁、膨润土、硅溶胶等澄清剂对其进行絮沉降处理，静置、取清液，最后用离心或过滤的方法进一步处理。[3]在传统加工工艺过程中，果蔬汁成品的营养物质和风味物质损失多、成本高、耗能大。膜分离技术在果蔬汁制品的生产加工过程中发挥重要作用，能够有效地克服这些缺陷。膜分离技术主要具备使果蔬汁脱苦、脱酸、澄清和浓缩的功能，并提高果蔬汁的稳定性。
果蔬汁的脱苦
柑橘类果汁由于含有柚皮苷、柠檬碱等苦味物质，对产品的风味和商业价值造成负面影响。1E. Hernandez等人[4]利用超滤和二已烯基聚苯乙烯树脂吸附的联合过程对葡萄抽汁进行脱苦的实验，表明柚皮苷和柠檬碱可被完全除去，果汁风味得到显著提高。
果蔬汁的脱酸
根据刘茉娥等人[5]介绍利用电渗析膜，表明电渗析膜可以脱除果汁中的有机酸，能够使果汁酸度降低，从而提高果汁的品质。
果蔬汁的澄清
果蔬汁中因含有一些胶体物质、单宁、蛋白质等物质，它们在加热和贮存过程中往往使果蔬汁变得混浊，有的甚至产生沉淀，缩短了产品的货架期。应用超滤法澄清番茄汁、苹果汁、菠萝汁、梨汁、柑橘汁等，可获得较好的经济效益和较高的产品质量。
果蔬汁的稳定性
超滤可提高果蔬汁的稳定性，如苹果汁在超滤前宾透光率为，经超滤后，透光率为，在户观上已达到清澈透明，并在常温下贮存四个月，其透光率几乎为一定值，稳定性良好。[6]
3.超高压技术
杀菌是果蔬汁制品生产中的关键技术之一。传统的热力杀菌虽然可以杀灭鲜榨果蔬汁中的微生物， 但果蔬汁中的营养成分仍会受到破坏， 产生热臭、风味劣变， 造成果蔬汁制品产品质量变差。[7]食品超高压技术(ultrahigh pressure processingUHP)，又称为高静压技术(high hydrostatic pressure processing，HHP)，是指将密封于弹性容器内的食品置于水或其他液体作为传压介质的压力系统中，经100MPa以上压力处理，在常温甚至更低的温度下达到杀菌、灭酶和改善食品功能特性等作用口。由于超高压技术只作用于非共价键，能够保证共价键完好无损，因而可以降低鲜榨果蔬汁中的微生物数量， 并保持产品的营养、风味和安全品质， 具有重要的意义。[8]与加热杀菌相比，超高压技术有着无法比拟的优越性， 特别是超高压杀菌可以保持食品原有的色、香、味和营养成分。
超高压对果蔬汁色泽的影响
经研究发现，与传统的热杀菌相比，超高压技术处理果蔬汁能够较好的保持其色泽，对部分果蔬，如番茄等甚至有改善色泽的作用。其原因在于超高压对果蔬内源酶的钝化作用及高压的均质作用使果蔬组织细胞内的呈色物质溶出。
超高压对果蔬汁芳香成分的影响
超高压对果蔬汁的香气有不同方面的影响，不仅能够处理过程中会使香气反应前体物的浓度增加还能使香气物质降解降低或激活某些有关香气的酶的活性。因此超高压加工的果蔬汁的风味会呈现出不同的变化。
超高压对果蔬汁营养物质的影响
超高压对食品中营养成分的影响与各种营养成分的性质有关，由于超高压处理不能破坏共价键，因此认为超高压处理对于食品中小分子化合物一类的营养物质不会有直接的破坏作用，但可能会加速一些食品体系中的生化反应，使部分营养物质间接受到破坏。
超高压对果蔬汁中酶活性的影响
内源酶易引起果蔬最初的品质变化，，压力在酶的活性中心通过打破稳定分子内和酶蛋白的相互作用间的微妙平衡， 导致酶构象的变化而导酶失活。大量研究表明，超高压技术可钝化果蔬汁中的大部分酶。[9]
4. 高压脉冲技术
高压脉冲电场技术(pulsed electric field，PEF)作为非热加工工艺之一，因其作用时间短、均匀、效率高，且能够最大程度地保持食品新鲜度的优点而成为食品非热处理方式应用的热点之一。此外，在杀菌钝酶、活性物质提取、保持食品原汁原味等方面显示了很大的优势。
PEF技术在果蔬汁活性物质提取时的应用
由于细胞膜的渗透性功能，PEF技术作用于细胞时能够提高物质传质系数，将低能量PEF应用于不同的植物组织，PEF技术不仅提高果蔬汁提取率，且使果蔬汁中活性成分如酚类物质、VC的保留率更高。 PEF技术在果蔬汁钝酶方面的应用
经研究表明，PEF技术对果蔬汁酶活性的钝化有很好的作用效果，PEF技术不仅在钝化酶活性及延缓氧化、褐变等不良变化中发挥积极作用，同时对果蔬汁品质影响也较小。
PEF技术对果蔬汁品质的影响
研究PEF能温和且高效地处理物料，最大程度上保留原料的营养成分。经过PEF处理的果蔬汁，一般最好保存于低温下，如果酸度适宜，也可存于常温。[11]经PEF技术处理后的果蔬汁与热处理及酶处理等传统技术相比，果蔬汁品质更接近于原汁，符合人们对食品原汁、原味、天然营养的需求。
综上所述，随着科学技术的发展，虽然果蔬汁制品加工技术已达到一定的水平，但仍存在着一些问题。目前已有应用生物技术改善饮料加工原料、生产饮料添加剂和功能因子以及去除饮料不良性状的研究， 但生物技术要真正实现大规模地运用于果蔬汁饮料加工还有待进一步研究与完善。总之，果蔬汁饮料的各种加工技术需要相互贯通、相互融合、取长补短、集成发展，这是果蔬汁饮料加工技术的一个必然发展趋势。
参考文献：
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[5]刘茉娥.膜分离技术[M].北京：化学工业出版社，，204-225，255-259.
[6]吴继红. 超滤膜分离技术在澄清果蔬汁加工中的应用[J]. 塔里木农垦大学学报，1996，01：37-41.
（1）酶是生物催化剂，具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点；果胶酶只能对果胶的分解起到催化作用，体现了酶的专一性．（2）分析表中数据可以发现：当温度在40℃左右时，果胶酶的活性较高．（3）进行实验①的目的是保证实验温度的准确性，因为如果果胶酶与苹果泥温度不同，二者混合后温度会发生变化，从而导致实验结果不准确．故答案为：（1）专一性 （2）40℃（3）使果胶酶和苹果泥达到相同的温度，避免因二者温度不同导致混合后温度发生变化
实验材料本实验选用苹果作为实验材料,将果胶酶配成质量分数为2%溶液后使用. 实验步骤取五支试管,编号后各加入10mL苹果泥,依次加入水、、1mL、2mL、4mL2%的果胶酶溶液,加水使每支试管反应体系的终体积皆为14mL,...
中央研究院化学研究所副研究员张崇毅与吴世雄特聘研究员主持的研究团队，于乌来温泉菌（Meiothermus taiwanensis）细胞内发现「C型隆（Lon）蛋白酶」，并解析建构出其独特三度空间构造；由于许多致病性细菌包括癌细胞，在人体内存活时都需要隆蛋白酶，因此隆蛋白酶被视为发展抗生素及抗癌药物的新标靶。学者在乌来温泉中发现「C型隆（Lon）蛋白酶」，有望成为新抗癌标靶药。（图片／本报资料照片） 这项研究完整呈现隆蛋白酶中空内室的活性区构造，以及活性区与3种有机化合物相结合的机制，进而提供新类型药物设计思考新契机，论文于2013年8月1日刊登在知名结晶学期刊《晶体学刊D卷: 生物结晶学》（Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography），并入选为当期封面文章。 研究团队表示，隆蛋白酶是一种特殊的大型蛋白质复合体，存在于所有细菌和高等生物细胞胞器内，它让细胞在严峻环境下仍能行使正常功能。而台湾本土温泉菌的C型隆蛋白酶，是两位学者于乌来温泉菌细胞内所发现，并于2012年在发表的论文中将其命名为C型。温泉菌的蛋白质具有较高的热稳定性，由温泉菌中取得的酵素，因此可能具有较高的产业应用价值。 张崇毅博士表示，由于隆蛋白酶具有结构不稳定性，30年来有许多尝试以蛋白结晶的方法研究隆蛋白酶与有机化合物的复合体构造都没成功，这次研究能以采自台湾本土温泉菌所分离的隆蛋白酶首度解析其构造，成果令人欣慰。
PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。 因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究： (1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的研究。 (3)偏酸性蛋白酶固体发酵条件的优化。 (4)偏酸性蛋白酶产生菌P-1007的初步鉴定。 (5)偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用。 本论文主要研究结果和结论如下： (1)用常规土壤分离方法，从土壤样品中筛选到一株产偏酸性蛋白酶的菌株，命名为P-1007。 (2)通过单因素发酵条件实验和正交实验的方法得到最佳固体发酵条件为：麦麸15g，黄豆粉8％，葡萄糖3％，NaH2PO41％，％，水35ml，最佳起始，最适发酵温度为40℃。在此条件下所产酶活可达3700u/g，比原始菌株发酵酶活提高了将近2倍，且产酶稳定性较好。 (3)菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的最适作用pH值为，最适作用温度为50℃。酶的pH稳定性和耐温性较好，50℃、条件下保温8h后剩余酶活可达83％以上，、50℃条件下保温2h后剩余酶活仍在70％以上。Mn2+、Cu2+对偏酸性蛋白酶有明显的激活作用，其它金属离子则对该酶有不同程度的抑制作用。与目前所得到的酸性蛋白酶相比较，偏酸性蛋白酶具有较高的作用pH值和较好的耐温性。 (3)从菌株P-1007菌落形态、显微观察以及区序列分析可以看出菌株P-1007可能属于烟曲霉。 (4)从酶学性质上可以看出，菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的作用条件满足于啤酒澄清工艺的要求，因此本实验进行了偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用研究以及该酶与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较。研究结果表明：经偏酸性蛋白酶作用后，麦汁和发酵液中酪氨酸含量、透光率、总氮量、可凝固性氮含量都有了明显的提高。麦汁中a-氨基氮含量也增加了，说明偏酸性蛋白酶将凝固性蛋白质水解成了分子量较小的a-氨基氮，为啤酒酵母的生长繁殖提供了氮源。同时发酵液中的a-氨基氮含量却降低了，分析原因为发酵阶段中酵母利用a-氨基氮的速度比偏酸性蛋白酶降解蛋白质的速度快。麦汁和发酵液的pH值都无太大变化，因此不会影响啤酒酵母的生长和繁殖。在与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较中发现，三种酶的作用效果大致相同，但从最适作用条件来看，偏酸性蛋白酶比另两种蛋白酶更适合于啤酒澄清工艺。 以上研究结果表明，本课题筛选到的菌株P-1007所产偏酸性蛋白酶的作用条件特别适合于啤酒澄清工艺，因此在啤酒工业中有较好的应用前景。 关键字:烟曲霉,偏酸性蛋白酶,发酵条件优化,酶学性质,rDNA-ITS区序列分析,啤酒澄清
浅谈酶联免疫吸附试验实验教学思考的分析论文
【摘要】 酶联免疫吸附试验是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术，实验教学中采用该技术检测“乙肝两对半”。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，我们对实验教学内容和方法进行改革，从适用性角度选题，通过实验操作考核，采取以考促学的手段，加强酶联免疫吸附试验的训练力度，提高学生实验操作能力，培养学生独立工作的能力。
【关键词】 酶联免疫吸附试验；免疫学检验；实验；考核
酶联免疫吸附试验(enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA)是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术。该技术集基本理论、基本技能为一体，能使学生能对前期所学的理论知识及技能进一步加强和提高，是一个能为学生进人临床实习打好基础的系统实训。目前该技术的临床检测多采用商品化的ELISA试剂盒，实验步骤较少，操作简单。然而，参与反应的成分很多，如抗原抗体浓度、酶结合物浓度以及试剂的质量控制等等，影响因素众多。传统的实验教学中，实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由教师包办。实验的许多环节学生没有亲自做，因而在实验完成后，部分学生对实验还是一知半解，更谈不上能力的锻炼和培养［1］。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，对免疫学检验实验教学内容和方法进行改革势在必行。为此我们通过实验技能操作考核，采取以考促学的手段，加强了酶联免疫吸附试验内容的训练力度，也收到了一定的效果，以下谈谈我们的做法及效果。
1精选考核内容，以适应临床实践的需要
考核内容的选择上以围绕临床实际进行选择，真正使学生做到学以致用。不但要让学生了解、掌握先进的免疫学检验技术和操作方法，还必须着重培养学生的创造性思维和综合分析问题的能力，从而全面提高学生素质［2］。ELISA由于操作简单、灵敏度高、可定性定量，在临床检验诊断中应用最为广泛。常用于如病毒性肝炎、艾滋病、疱疹等传染性疾病的检测诊断，还常用于补体、免疫球蛋白和肿瘤标志物的检测。要想在有限的课时里完成诸多的内容训练，显然是不现实的。因此我们仅选择了最具有代表性的“乙肝两对半”检测作为该技术的训练及考核内容。“乙肝两对半”共有五项检测项目，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，实验中所需要的实验器材均能由检验实验室提供，易于准备，给学生提供了选择和发挥的空间。实验过程中所需要的待测血清标本为阳性或阴性标准物，不具传染性，保证了学生实验的安全性。学生只要掌握了“乙肝两对半”的检验程序和检验方法，其他在临床上需要用ELISA技术检测的常见项目则触类旁通，能起到事半功倍的效果，至于少见的、较为复杂的检测项目可以在日后的实习及工作中继续学习。
2调整考核内容，可行性及针对性强
酶联免疫吸附试验教学内容在学时安排上有6课时，理论与实验课课时之比为1．1。以往的教学形式为先理论授课，教师讲解实验的原理及检验程序，实验教学中教师讲解后进行示范教学，学生照葫芦画瓢的再做实验;实验操作考核只设HBsAg项目的考核，考核项目单一、形式单一。学生只需完成实验操作，报告结果即可。而现行的考核内容是“乙肝两对半”的共五项检测项目，各个项目的检验过程如标本的稀释、试剂选择、加样顺序有所不一。从限制考核时间的角度考虑，学生在考核时随机抽考其中的一个项目，由考生自主选择所需物品进行实验操作，这样增加了考试的随机性和灵活性。虽然抽考使得考核难度增加，但能强化学生对ELISA检测乙肝两对半操作步骤的理解。当学生抽到题目后，在熟悉操作步骤的基础上，只要懂得该项目检测时需注意的细节，如检测HBcAb需将血清稀释50倍，HBeAb的检测需加入中和试剂，学生在对离心机、水浴箱及微量移液器的使用相当熟悉的基础上，不难将标本中的结果如实地检测出来。
3考核的形式
学生重理论、轻实验的现象普遍存在，有的学生每操作一步就看一下笔记，或者是询问其他同学，有的学生甚至希望教师能一步步的教，因而学生对酶联免疫吸附试验缺乏系统的认知。我们将考核的形式设计有理论测试(占30分)和操作考核(占70分)。通过调整考核内容，将能力培养贯穿于整个训练过程，将单纯理论教学融合于实验教学中，能把理论知识激活，也强化了学生的实验操作能力及解决问题、分析问题能力。理论测试采用本教研室的计算机交互平台进行，根据教学内容特点，理论测试我们进行这样的设计，首先收集乙肝两对半检测相关试题，建立题库，内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色，判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”;(3)手工洗涤有何要求;(4)加终止液的目的是什么;(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么。共组10套试题，学生抽签后通过计算机交互平台指向性地发布试题、进行考试。考虑到学生对理论考试容易产生畏难情绪，在题型的设计上，设有填充题，标示题、连线题及填空题等，内容直观、清晰，学生“寓考于乐”，在轻松愉快的心理环境下地完成理论测试。
4考试评分严谨，设计合理
理论考核从试题集中抽取出6道题组卷，每题5分，共30分。操作考核的评分项目包括:专业素质(衣着仪表、考试态度、纪律)5分;实验准备(实验用品、试剂的预处理、标本处理、标记记录)5分;实验步骤(加样、微量移液器的使用、孵育、洗涤、显色)35分，结果观察10分;操作后清场(试剂、器材归位、实验台面清理)5分，综合评价(规定时间完成、实验后清场、消毒等)10分，共70分。评分标准于考试前告知学生，给学生能充分地复习和准备，注意操作细节，提高考试质量。考试时每个学生独立完成试验，教师全程监考，及时对出错环节扣分，评出总分。
5效果分析
在酶联免疫吸附试验的实验教学中，采用考核方式，取得了以下成效。
5．1利于调动学生的主观能动性，激发起学习的热情
实验操作考核综合反映出学生的实验预习、实验过程和实验态度等各方面的表现。考核成绩占期末总成绩的30%，将学生实验考核计入课程总成绩后，学生上实验课的目的性增强，课上都抢着做实验，从以往实验缺乏主动性，不预习，不复习，变为积极思考，认真准备。实验报告抄袭现象也明显减少，改变了重理论轻实践的现象［3］。从学生提出的'问题，如溶血标本可以检测“乙肝两对半”吗?如果用溶血标本检测，会有什么影响，会影响什么试剂?从这些问题的提出可以看出，学生懂得对实验进行思考，也懂得遇到问题主动和老师商量，学生不断发现问题、思考问题、解决问题的能力得到提高。
5．2独立工作能力的培养
独立工作能力是一个医学检验工作者最基本素质，中职生毕业后就业单位多是基层医院，基层医院的检验科可能只有1至2名检验员，每天的检验工作任务都要独立完成。因而学生在就学期间即应注重独立工作能力培养。在实验考核过程中，实验物品的选择、摆放，实验结束后操作台的清理等，是学生自己准备和独立完成。学生在考核时需考虑到考核时间的限制，因此只有熟悉基本的理论知识、熟练基本操作，才能在规定时间内完成实验，得出正确的结果，考试前不做好准备实验将无法顺利完成。
5．3实验基本技能的训练
由于酶联免疫吸附试验涉及环节多，通过考试能综合考核学生的基本实验技术，如移液管的准确吸样，血清等倍稀释的方法;能考察学生对常用仪器设备如离心机、恒温孵育箱、酶标仪、洗板机的操作;在对血清标本进行检测时，使用过的物品如棉签、试管、注射器的正确处置，能增强学生的无菌操作技术和观念。
5．4学生的评价及反馈
此考核方案在两届学生进行了实施，通过操作考核，学生们得到较为系统的训练，对ELISA检测乙肝两对半的整个流程有了较为深刻的认识。有必要开展，通过考核能更好地将理论与实践相结合，学生能自如地、成功地检测出标准物血清标本的正确结果，同时也很有成就感，增强了对实习及将来的工作的信心。在对2013级的学生进行实习情况跟踪、访谈中得知，学生普遍认为，ELISA技术在临床免疫检验诊断中应用广泛，用此技术检测的项目多，工作量较大。由于在操作考核强化了技能，在实习老师的指导下，能很快地进入角色，增强了工作自信心。对学生进行实验考核的同时，也对教师提出了更高要求。教师准备的理论测试问题在内容上需与临床免疫检验接轨，使考核更科学合理化。规范实验教学，严谨、规范示作好示教。学生操作过程中，巡视督查，及时纠正学生的错误。以考促学法强化酶联免疫吸附试验的实验教学，补充和完善了免疫学检验实验教学的内容和方法，也希望能以此提高学生对其他课程学习的主动性及激发起学习的热情。
在光合作用的过程中，光照强度对碳3（Rubisco）酶活性的影响非常大。当光照强度突增时，光合速率也会相应增加。然而，Rubisco酶的催化速率却受到了限制，因此，碳3的含量反而减小了。具体来说，当光照强度突增时，叶片中的ATP和NADPH的产量会迅速增加，而CO2的供应速率却没有跟上。这样会导致ATP和NADPH的积累，进而抑制Rubisco酶的活性，从而减小碳3的含量。随着光照强度的增加，CO2供应速率也逐渐增加。当CO2的供应速率达到一定程度时，ATP和NADPH的积累就会被消耗，Rubisco酶的活性也会逐渐恢复，碳3的含量也会增加。最后，当光照强度进一步增加到光饱和点以上时，光合速率不再随光照强度的增加而增加，此时碳3的含量也趋于稳定。因此，在光合作用达到光饱和之前，光照强度的突增会导致碳3的含量先减小后增大，最后趋于稳定。
rubisco在光下活化,暗中钝化。但光对rubisco的活化作用不是直接的，包括了跨类囊体的mg2+流动，co2活化，叶绿体ph改变，以及活化蛋白等多因素之间复杂的相互作用。e（钝化）+aco2↔（钝化）(ec形式)慢反应↔(活化)(ecm形式）快反应一个核gene编码的叶绿体蛋白具有激活rubisco的效应，称为rubisco活化酶。研究表明，活化酶对rubisco的激活可分为两个阶段：（1）光激活rubisco活化酶。（2）活化酶激活rubisco，使rubisco肽链内一特殊的赖aa残基的ε-氨基转变成氨基甲酰化的形式。活化酶表现活性需要照光,实际上就是需要活化酶提供了一种调节光合作用活性的手段，使rubisco活化水平与叶绿体间质中rubp合成的速率以及类囊体膜光能吸收的速率相协调。植物体内在夜间可合成2-羧基阿拉伯糖醇-1-磷酸（ca1p），它是一种6-碳的c3循环中间产物的类似物。ca1p可与活化的rubisco(ecm)紧密结合，因此阻断了rubp的结合，抑制羧化反应。在黑暗中叶片内的ca1p浓度增加，而光下ca1p被代谢，浓度下降，转变成2-羧基阿拉伯糖醇（ca）。因此强光照几分钟就可使rubisco与其抑制剂ca1p分离。另外，rubisco活化酶不分解ca1p本身,但是可使ca1p从ecm中解离的速率提高。xubp和kabp对rubisco的调节xubp(1,5-二磷酸木酮糖)是rubp的差向异构体，kabp(3-酮基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸)是rubp的酮式异构体，这两种物质是rubisco活性的重要抑制剂。rubisco活化酶可将xubp和kabp解离.总体来看，无论是rubp与rubisco的e形式结合，还是ca1p、xubp与rubisco的ecm形式结合，都会抑制酶的活性。因此，磷酸糖是rubisco活性的重要抑制因子。而活化酶能使这些抑制剂与酶解离从而使酶活化