光学检测论文

提高数控车床工作实效得用途径摘 要 随着经济的发展，科学技术日新月异，机械制造业面临着更高更新的要求：最大程度地和计算机技术、信息技术相结合以实现智能化、自动化、高产、高效、低能耗、无污染的目标，本文从几个方面介绍先进制造技术，指明机械制造业的发展方向。 关键字 先进制造技术 机械制造业作为一个传统的领域已经发展了很多年，积累了不少理论和实践经验，但随着社会的发展，人们的生活水平日益提高，各个方面的个性化需求越加强烈。作为已经深入到各行各业并已成为基础工业的机械制造业面临着严峻的挑战。 先进制造技术这个概念的提出为机械制造业的发展指明了方向。虽然这个名词没有确定的定义，但目前公认的认识是：先进制造技术是传统制造技术不断吸收机械、电子、信息、材料、能源和现代管理等方面的成果，并将其综合应用于产品设计、制造、检测、管理、销售、使用、服务的制造全过程，以实现优质、高效、低耗、清洁、灵活的生产，并取得理想技术经济效果的制造技术的总称。它具有如下一些特点： 1． 从以技术为中心向以人为中心转变，使技术的发展更加符合人类社会的需要。 2． 从强调专业化分工向模糊分工、一专多能转变，使劳动者的聪明才智能够得到充分发挥。 3． 从金字塔的多层管理结构向扁平的网络化结构转变，减少层次和中间环节。 4． 从传统的顺序工作方式向并行工作方式转变，缩短工作周期，提高工作质量。 5． 从按照功能划分部门的固定组织形式向动态的自主管理的小组工作方式转变。 6． 机械制造技术的发展趋势可以概括为：（1）机械制造自动化。（2）精密工程。（3）传统加工方法的改进与非传统加工方法的发展。 下面对自动化技术给予论述和展望。 机械制造自动化技术始终是机械制造中最活跃的一个研究领域。也是制造企业提高生产率和赢得市场竞争的主要手段。机械制造自动化技术自本世纪20年代出现以来，经历了三个阶段，即刚性自动化、柔性自动化和综合自动化。综合自动化常常与计算机辅助制造、计算集成制造等概念相联系，它是制造技术、控制技术、现代管理技术和信息技术的综合，旨在全面提高制造企业的劳动生产率和对市场的响应速度。 一、集成化 计算机集成制造（CIMS）被认为是21世纪制造企业的主要生产方式。CIMS作为一个由若干个相互联系的部分（分系统）组成，通常可划分为5部分： 1． 工程技术信息分系统 包括计算机辅助设计（CAD），计算机辅助工程分析（CAE），计算机辅助工艺过程设计（CAPP），计算机辅助工装设计（CATD）数控程序编制（NCP）等。 2． 管理信息分系统（MIS） 包括经营管理（BM），生产管理（PM），物料管理（MM），人事管理（LM），财务管理（FM）等。 3． 制造自动化分系统（MAS） 包括各种自动化设备和系统，如计算机数控（CNC），加工中心（MC），柔性制造单元（FMS），工业机器人（Robot），自动装配（AA）等。 4． 质量信息分系统 包括计算机辅助检测（CAI），计算机辅助测试（CAT），计算机辅助质量控制（CAQC），三坐标测量机（CMM）等。 5． 计算机网络和数据库分系统（Network & DB） 它是一个支持系统，用于将上述几个分系统联系起来，以实现各分系统的集成。 二、智能化 智能制造系统可被理解为由智能机械和人类专家共同组成的人机一体化智能系统，该系统在制造过程中能进行智能活动，如分析、推理、判断、构思、决策等。 在智能系统中，“智能”主要体现在系统具有极好的“软”特性（适应性和友好性）。在设计和制造过程中，采用模块化方法，使之具有较大的柔性；对于人，智能制造强调安全性和友好性；对于环境，要求作到无污染，省能源和资源充分回收；对于社会，提倡合理协作与竞争。 三、敏捷化 敏捷制造是以竞争力和信誉度为基础，选择合作者组成虚拟公司，分工合作，为同一目标共同努力来增强整体竞争能力，对用户需求作出快速反应，以满足用户的需要。为了达到快速应变能力，虚拟企业的建立是关键技术，其核心是虚拟制造技术，即敏捷制造是以虚拟制造技术为基础的。敏捷制造是现代集成制造系统从信息集成发展到企业集成的必由之路，它的发展水平代表了现代集成制造系统的发展水平，是现代集成制造系统的发展方向。 实现敏捷制造的技术基础包括： 1． 大范围的通讯基础结构，要求在全国范围内建立工厂信息网络和准时信息系统（Just-In-Time-Information）。 2． 柔性化、模块化的产品设计方法。 3． 高柔性、模块化、可伸缩的制造系统。 4． 为定单而设计、制造的生产方式。 5． 基于任务的组织与管理。 6． 基于信任的雇佣关系。 四、虚拟化 “虚拟制造”的概念于20世纪90年代初期提出。虚拟制造以系统建模和计算机仿真技术为基础，集现代制造工艺、计算机图形学、信息技术、并行工程、人工智能、多媒体技术等高新技术为一体，是一项由多学科知识形成的综合系统技术。虚拟制造利用信息技术、仿真计算机技术对现实制造活动中的人、物、信息及制造过程进行全面的仿真，以发现制造中可能出现的问题，在产品实际生产前就采取预防的措施，从而达到产品一次性制造成功，来达到降低成本、缩短产品开发周期，增强产品竞争力的目的。 五、清洁化 清洁生产是指：将综合预防的环境战略，持续应用于生产过程和产品中，以便减少对人类和环境的风险。 清洁生产的两个基本目标是资源的综合利用和环境保护。对生产过程而言，清洁生产要求渗透到从原材料投入到产出成品的全过程，包括节约原材料和能源，替代有毒的原材料和短缺资源，二次能源和再生资源的利用，改进工艺及设备，并将一切排放物的数量与毒性削减在离开生产过程之前。对于产品而言，清洁生产覆盖构成产品整个生命周期的各个阶段，即从原材料的提取到产品的最终处理，包括产品的设计、生产、包装、运输、流通、销售及报废等，合理利用资源，并最大限度地减少对人类和环境的不利影响。 综上所述，机械制造业的发展方向是将传统的制造技术与现代信息技术、管理技术、自动化技术、系统工程技术进行有机的结合，通过计算机技术是企业产品在全生命周期中有关的组织、经营、管理和技术有机集成和优化运行，在企业产品全生命周期中实现信息化、智能化、集成优化达到产品上市快、服务好、质量优成本低的目的，进而提高企业的柔性、健壮性和敏捷性，是企业在激烈的市场竞争中立于不败之地。 参考文献 [1] 机械制造技术基础，张世昌著，天津大学出版社 [2] 计算机辅助设计与制造，李佳著，天津大学出版社 [3] CIMS论坛网页

我是做数控的，，需要写的是什么，工作体会还是安全生产？具体点 我数控学习的心得我刚上大学时我毫不明白数控专业是什么，也不太清楚我们这个专业将来实际到底该做哪一行的工作，还想过要调换专业，最终还是没有，曾几何时我们这个专业将来到底有没有前途~~我一直不清楚！但今天，我告诉你！！好好学吧！！前途无量！！专家们预言：二十一世纪机械制造业的竞争，其实质是数控技术的竞争。 2002年10月29日~~11月8日，华中科技大学国家数控系统工程技术研究中心数控职业教育培训调研组对东北三省以及江苏、上海、浙江的十多所正在或准备从事数控技术人才培养的各层次学校(主要是职业技术学院)的教学、培训工作开展情况和所用设备状况及其该地区数控技术人才需求情况进行了一系列调研。具体情况如下： 一、数控人才市场需求 在发达国家中，数控机床已经大量普遍使用。我国制造业与国际先进工业国家相比存在着很大的差距，机床数控化率还不到2％对于目前我国现有的有限数量的数控机床(大部分为进口产品)也未能充分利用。原因是多方面的，数控人才的匾乏无疑是主要原因之一、由于数控技术是最典型的、应用最广泛的机电光一体化综合技术，我国迫切需要大量的从研究开发到使用维修的各个层次的技术人才。 数控人才的需求主要集中在以下的企业和地区： 1、国有大中型企业，特别是目前经济效益较好的军工企业和国家重大装备制造企业．军工制造业是我国数控技术的主要应用对象． 杭州发电设备厂用6000元月薪招不到数控操作工。 2、随着民营经济的飞速发展，我国沿海经济发达地区(如广东，浙江、江苏、山东)，数控人才更是供不应求，主要集中在模具制造企业和汽车零部件制造企业。 具有数控知识的模具技工的年薪已开到了30万元，超过了“博士”。 二、数控人才的知识结构 现在处于生产一线的各种数控人才主要有二个来源：一是大学、高职和中职的机电一体化或数控技术应用等专业的毕业生，他们都很年轻，具有不同程度的英语、计算机应用、机械和电气基础理论知识和一定的动手能力，容易接受新工作岗位的挑战。他们最大的缺陷就是学校难以提供的工艺经验，同时，由于学校教育的专业课程分工过窄，仍然难以满足某些企业对加工和维修一体化的复合型人才的要求。 另一个来源就是从企业现有员工中挑选人员参加不同层次的数控技术中、短期培训，以适应企业对数控人才的急需。这些人员一般具有企业所需的工艺背景、比较丰富的实践经验，但是他们大部分是传统的机类或电类专业的各级毕业生，知识面较窄，特别是对计算机应用技术和计算机数控系统不太了解。 对于数控人才，有以下三个需求层次，所需掌握的知识结构也各不同： 1、蓝领层： 数控操作技工：精通机械加工和数控加工工艺知识，熟练掌握数控机床的操作和手工编程，了解自动编程和数控机床的简单维护维修。适合中职学校组织培养。此类人员市场需求量大，适合作为车间的数控机床操作技工。但由于其知识较单一，其工资待遇不会大高。 2、灰领层 1)数控编程员：掌握数控加工工艺知识和数控机床的操作，掌握复杂模具的设计和制造专业知识，熟练掌握三维CAD／CAM软件，如uc、ProE等；熟练掌握数控手工和自动编程技术；适合高职、本科学校组织培养。适合作为工厂设计处和工艺处的数控编程员。此类人员需求量大，尤其在模具行业非常受欢迎；待遇也较高。 2)数控机床维护、维修人员：掌握数控机床的机械结构和机电联调，掌握数控机床的操作与编程，熟悉各种数控系统的特点、软硬件结构、PLC和参数设置。精通数控机床的机械和电气的调试和维修。适合高职学校组织培养。适合作为工厂设备处工程技术人员。此类人员需求量相对少一些，但培养此类人员非常不易，知识结构要求很广，适应与数控相关的工作能力强，需要大量实际经验的积累，目前非常缺乏，其待遇也较高。 3、金领层 数控通才：具备并精通数控操作技工、数控编程员和数控维护、维修人员所需掌握的综合知识，并在实际工作中积累了大量实际经验，知识面很广。精通数控机床的机械结构设计和数控系统的电气设计，掌握数控机床的机电联调。能自行完成数控系统的选型、数控机床电气系统的设计、安装、调试和维修。能独立完成机床的数控化改造．是企业(特别是民营企业)的抢手人才，其待遇很高。适合本科、高职学校组织培养。但必须在提供特殊的实训措施和名师指导等手段，促其成才。适合于担任企业的技术负责人或机床厂数控机床产品开发的机电设计主管。 对于以上各类数控人才，主要的基础知识基本相同，专业课的内容和重点不同。在课程设置方面应特别加强实训内容和与企业实习的内容。 bread：如果你是刚刚学，我建议你从基本的编程开始，循序渐进，慢慢来！ 如果你已具备一些知识，你可以从机床结构等下手 .这样可以吗？或者 现代数控车床对刀方法的探讨摘 要：以现代数控车床为例，假设编程原点选在工件右端中心，介绍了几种常用的数控车床对刀方法。关键词：对刀 工件 坐标系对刀是数控车床加工中极其重要和复杂的工作，对刀的目的就是建立工件坐标系或是编程坐标系的过程。就是使刀架上每把刀的刀位点都能准确到达指定的加工位置。或是使工件原点（编程原点）与机床参考点之间建立某种联系。其中刀位点是刀具上的一个基准点，刀位点的相对运动轨迹就是编程轨迹，而机床参考点是数控机床上的一个固定基准点，该点一般位于机床移动部件沿其坐标轴正向的极限位置。在现代数控车床操作中，对刀的方法比较多，笔者根据自己多年的实践经验，现总结以下几种常用的对刀方法，以便和数控界同仁商榷。一、试切法对刀1、使用G50、G92指令对刀在对刀时，我们可以通过设置刀具起点相对工件坐标系的坐标值来设定工件坐标系，如图1所示，对刀的目的就是将刀具的刀位点移至A点，这样，通过A点间接确定出工件的编程坐标系原点O的位置。对刀步骤如下：（1）使数控车床返回机床参考点。（2）使刀具原有的偏置量清零。（3）用“手轮”方式车削工件右端面和工件外圆。（4）使刀具退到工件右端面和外圆母线的交点，如图1所示中C点的位置。（5）让刀尖向Z轴正向退α mm（可使用相对坐标清零方式操作）。（6）停止主轴转动。（7）用外径千分尺测量工件外径尺寸d。（8）让刀尖向X轴正向退b-d。（9）则刀尖现在的位置就为程序中G50（G92）规定的位置。要求其程序形式为：O * * * *（程序号）N10 G50（G92） Xα ZbN20 …………至此，对刀工作全部结束，可以调出程序进行加工了。但要注意的是采用此种方法对刀，加工前必须将刀具的刀位点放在指定的位置上，而且此种对刀方法，仅适合一把刀具加工工件。2、使用G54/G55/G56/G57/G58/G59指令对刀我们可以使用现代数控车床提供的存储型零点偏置模式建立坐标系，它是将对刀特定点的当前机床坐标输入到数控系统零点偏置的存储单元中，从而得到刀具当前刀位点的工件编程坐标。对刀步骤如下： （1）使数控机床返回机床参考点。（2）使刀具原有的偏置量清零。（3）用“手轮”方式车削工件右端面。（4）沿+X方向退刀，并停下主轴（不要在+Z方向上移动刀架）。（5）把当前该把刀的机床坐标系下的Z方向坐标值，输入到G54零点偏置存储单元上的Z方向坐标上。（6）用“手轮”方式车削工件外圆。（7）沿+ Z方向上退刀，并停下主轴（不要在+ X方向上移动刀架）。（8）测量车削后的外圆直径d。（9）读取当前该把刀的机床坐标下的X方向坐标值，并把此值减去外圆直径d后的坐标值，输入到G54零点偏置存储单元中的X坐标上。用同样的方法，可以把第2刀、第3刀……，对应的输入到G55、G56……G59零点偏置存储单元中。要求程序形式为：O * * * *（程序号）N10 T0101（调用已经设有刀偏量的1号刀）N20 G54 X Z M03 S600（调用通过G54设置的工件坐标系）……Nχχ T0202（调用已经设有刀偏量的2号刀）Nχχ G55 X Z M03 S500（调用通过G54设置的工件坐标系）……采用此种方法对刀，加工前无须将刀具放在一个特定点上，而且适合多把刀具加工工件。3、使用绝对型刀具位置补偿方式对刀数控系统通过对刀可以直接获得每把刀具的刀位点相对于工件编程坐标原点的机床绝对坐标，并将此坐标直接输入到数控系统的刀具位置存储单元中，在程序中调用带有刀具位置补偿号的刀具功能指令后，即建立起工件的编程坐标系。对刀步骤如下： （1）使数控机床返回机床参考点。（2）用“手轮”方式车削工件右端面。（3）沿+X方向退刀，并停下主轴（不要在+Z方向上移动刀架）。（4）选择数控车床操作面板中的“刀补”键或是“OFFSET”键，在相对应的刀号上输入Z=0。（5）用“手轮”方式车削工件外圆。（6）沿+ Z方向上退刀，并停下主轴（不要在+ X方向上移动刀架）。（7）测量车削后的外圆直径d。（8）选择数控车床操作面板中的“刀补”键或是“OFFSET”键，在相对应的刀号上输入X=d。采用该种方法对刀，加工前无须将刀具放在一个特定点上，而且程序中并无G50、G54等指令。4、使用相对补偿法对刀此种对刀方法是先确定一把刀作基准（标准）刀，并设定一个对刀基准点，把基准刀的刀补值设为零，然后使每把刀的刀尖与这一基准点接触，利用这一点为基准，测出各把刀与基准刀的X、Z轴的偏置值△X、△Z，如图2所示。这样就得出每把刀的刀偏量，并把此值输入到数控系统当中。此种方法操作简便易行。采用该种方法对刀，加工前也无须将刀具放在一个特定点上，而且程序中也无G50、G54等指令。二、光学检测对刀仪对刀（机外对刀）它是将刀具随同刀架座一起紧固在刀具台安装座上，摇动X向和Z向进给手柄，使移动部件载着投影放大镜沿着两个方向移动直至刀尖或假想刀尖（圆弧刀）与放大镜中+字线交点重合为止。如图3所示，通过读数器分别读出X和Z向的长度值，即为该刀具的对刀长度，并把此值输入到数控系统当中去。此种方法是预先将刀具在机床外校对好，以便装上机床即可以使用，大大节省辅助时间。三、机械检测对刀仪对刀此种方法是使每把刀的刀尖与百分表测头接触，得到两个方向的刀偏量，如图4所示，并把此值输入到数控系统当中。此种方法操作简便、易行，但需要数控机床装有专用设备。每一种对刀方法都有其自身的优缺点，操作者可以根据自己的实际需要，灵活运用，这样会使整个对刀工作即简单，又能保证加工质量，还大大节省辅助时间，有效地提高生产效率。

高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷