pd1研究情况分析论文

在抗肿瘤免疫应答过程中，药物的疗效很大程度上取决于肿瘤特异的效应性免疫细胞的功能状态，而效应细胞的增殖和活性受免疫检查点共刺激和共抑制信号的共同调节。因此增加抗肿瘤免疫反应往往是通过 增强作为正向调节的共刺激信号，或阻断负向调节的抑制信号 。但往往事情没有我们想的那么简单，尤其是在异质性很强的肿瘤微环境中，各种免疫调控网络纷繁复杂，这也就促使我们采用多种免疫检查点抑制剂联合治疗的方案。 目前发现具有可用于药物治疗的免疫检查点分子有很多： PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, PVRIG, NKG2A 等，因为PD-1/PD-L1和CTLA4最早被发现，也研究的最多，因此目前抗CTLA-4 与抗 PD-1/PD-L1 联合策略也被用于多种肿瘤的免疫治疗中。但这种组合方式在很多肿瘤患者中的疗效并不显著，还具有很强的副作用，因此近些年科学家正不断研究别的免疫检查点联合用药方式。其中因 TIM-3 广泛表达于T细胞、Tregs、B细胞、NK细胞、DCs、巨噬细胞和肥大细胞等各种免疫细胞，并与 Galectin9 、高迁移率组盒1( HMGB1 )和癌胚抗原相关细胞粘附分子1( CEACAM-1 )结合成为了近几年基础和临床研究工作者的青睐。此外，TIM-3与PD-1在耗尽的T细胞和TILs上的共表达现象为联合使用抗PD-1和抗TIM-3提供了一个思路。并且一些小鼠模型的实验为这种组合的有效性提供了直接证据，几个I期的抗PD-1联合抗TIM-3的研究已经在晚期和转移性实体肿瘤中开始施行。 那么接下来我就先通过解读今年发表在 Nat Commun (IF:)一篇名为：Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy的文章介绍免疫检查点分子情侣PD-1/TIM-3以及 Galectin-9 的三角恋故事。 1.质谱分析筛选PD-1的结合蛋白 研究者首先通过IP/Western和免疫复合物的质谱分析确定了Galectin-9是PD-1的结合蛋白，且具有免疫调节活性。这里可能大家需要想到作者肯定筛选出了很多可以与PD-1结合的蛋白，然后通过实验逐一进行功能验证，最后发现Galectin-9蛋白具有较好的表型，因此后续都对这个蛋白进行分析。 类比这样的方法我们还可以筛选与自己研究基因相结合的蛋白，从而缩小靶基因的范围。 后续实验证明了Galectin-9与PD-1的结合是高度选择性的，并且是由多糖介导的，它不影响PD-1与其同源配体PD-L1的结合，也不影响PD-1和治疗性抗体Pembrolizumab和nivolumab的结合。 Galectin-9主要有两个CRD ( N-CRD，C-CRD )结合位点，研究者发现Galectin-9主要通过其 C-CRD 与PD-1结合，而N-CRD和C-CRD均介导其与Tim-3的结合。为了确定PD-1上与Galectin-9结合的糖基化位点，将PD1上4个可能的糖基化位点(N49、N58、N74和N116)上的天冬酰胺(N)残基分别突变为谷氨酰胺(Q)，发现 N116Q 突变在很大程度上影响了PD-1与Gal-9的结合，因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-1的N116连接的糖链介导。 图1： 2. Galectin-9可与PD-1和TIM-3交联形成复合物 紧接着研究者通过平板蛋白结合实验，发现在没有Galectin-9的情况下，PD-1 ECD并不结合TIM-3 ECD，而Galectin-9促进了它们的协同结合。DuoLink实验和IP/Western实验的结果进一步证实了这一点。但神奇的是， 在没有外源Galectin-9的情况下，PD-1/TIM-3相互作用也能被检测到 ，这种相互作用并不被乳糖或PD-1 N116Q突变所抑制。这就好比PD-1/TIM-3本来是一对情侣，只是感情并不是太稳定，这时生活中出现了一个和两人都能处得来的好友Galectin-9，表面是调节二者关系，其实是和其中一人搞暧昧。 图2： 3. Galectin-9可作为癌症免疫治疗的靶点 通过流式细胞术分析,研究者发现 Galectin-9诱导的T细胞死亡可能与抗癌免疫抑制有关 ，因此研究者评估了抑制Galectin-9在癌症治疗中的潜力，并推测这可能是由于抑制Galectin-9后T细胞共刺激受损所致。接下来，通过将抗Galectin-9与 GITR (TNFRSF共刺激受体家族的一个成员)的激动型抗体DTA-1相结合验证了这一想法，它们的组合在不同的肿瘤模型中协同抑制了肿瘤的生长和延长了总生存期。因此，这些结果表明Galectin-9是肿瘤免疫治疗的靶点，并且抗Galectin-9联合GITR激动剂可以诱导出强大的抗肿瘤活性。 图3： 4. 质谱流式证实抗Galectin-9治疗针对特定的肿瘤浸润性T细胞亚群 只有推测，没有动物实验当然是不行的，研究者接下来就在荷瘤小鼠中进行体内实验。通过分析几组质谱流式的结果，研究者发现抑制Galectin-9可以选择性地扩大了瘤内TIM-3+ CD8T和CD4T细胞亚群，这也包括具有免疫抑制性的Treg细胞， 并且Treg细胞在总CD45+TIL中的比例增加 ，特别是CD8T细胞中CD8T_1亚群的比例在抗Galectin-9处理后增加了两倍以上。由于Treg可以特异性的抑制抗肿瘤免疫，因此接着通过联合使用抗Galectin-9和抗GITR（可特异下调Treg）后，CD8T亚群的比例进一步增加，而Treg细胞几乎完全丧失。因此，抗Galectin-9单一疗法虽然扩增了具有效应潜能的CD8T细胞亚群。然而，它的治疗效果可能会因为Treg细胞的共同扩增而受到影响。 图4： 一般情况下，CD8T细胞在肿瘤抗原的不断刺激下会逐渐失去功能，变成衰竭前体细胞。在这个阶段的CD8T细胞会高表达TCF1，同时也表达PD-1,TIM-3，如果肿瘤抗原持续存在，CD8T细胞就会走向终末衰竭的T细胞，并且逐渐走向死亡。但是处在这个终末衰竭性T细胞状态前的T细胞可以被抗Galectin-9治疗给逆转成具有较强增殖和分化能力的功能性T细胞，只不过同时扩增的还有Treg细胞。因此，联合使用抗GITR来控制Treg细胞的扩增则解决了这一难题。 图5： 5.单细胞数据揭示Galectin-9的表达分布 其实讲到这，文章的主体研究思路都讲完了，但是为了进一步解析Galectin-9在各类免疫细胞的表达情况，作者还分析了之前发表的一套单细胞数据。所以，这也进一步说明了数据挖掘的重要性。无论是多高级的研究思路，都是需要大数据作为支撑才变得更有说服力，这个数据可以来源于自己花钱测的，也可以来自已经发表的研究。这里作者就通过数据挖掘发现Galectin-9(LGALS9)在多种免疫细胞中都有表达，而且发现与对PD-1治疗没有应答的患者相比，应答患者表达更高水平的Galectin-9,这也证实了抗Galectin-9和抗PD-1联合用药的可能性。 图6： 6.关于免疫应答研究可做的生信思路 好了，上面介绍了如何通过 实验研究 免疫检查点分子间的互作关系从而探索影响肿瘤免疫治疗应答的因素，学习了一些实验设计的研究策略。然而，为了符合我一贯写作的气质，下面得对应来点别的有深意的生信干货。其实作为数据挖掘的热点，有关肿瘤对免疫治疗应答的相关生信思路有很多，下面主要列举几篇今年刚发表的研究免疫治疗应答的文章思路: 图7： 第一篇解读的是发表在Mol Ther Oncolytics（IF:）杂志上篇名为“Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma”的文章。作者重新分析了已经发表的黑色素瘤单细胞数据，揭示出来7群CD8 T细胞亚群，这些亚群具有不一样的特征。此外，作者还鉴定出了3个在衰竭性CD8 T细胞上过表达的基因(PMEL, TYRP1和EDNRB)，它们与患者的不良预后显著相关。像这种思路，只要有数据都能很容易的复现一篇，至于发到什么样的杂志上，就看证实的发现是否新颖。 图8： 另一篇发表在 J Immunother Cancer （IF:）篇名为：CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer的文章则是从影响免疫浸润的趋化因子着手。这个思路主要是对明星分子在不同癌型中的功能进行探索，需要通过实验来进行功能验证。因为明星分子被研究的很多了，除非做泛癌分析，否则基本上很难做出太新颖的东西。但是这类实验设计很简单，只需要证明某个明星分子在 特定的癌型 中通过何种方式影响免疫治疗反应即可。 图9： 如果觉得明星分子没有太多研究新意，当然还可以通过各种生信方法筛选出关键基因。接下来一篇发表在 Oncoimmunology （IF:）的篇名为“YKT6, as a potential predictor of prognosis and immunotherapy response for oral squamous cell carcinoma, is related to cell invasion, metastasis, and CD8+ T cell infiltration”的文章就是先通过 WGCNA 的方法筛选出和免疫抑制相关的基因YKT6，进行后续的分析。对于这种新筛出的之前没有报道过的基因就比较容易说故事，当然这个思路有一些运气的成分，很有可能百费周折筛选出的基因要么没有很好的功能，要么就已经被报道。 图10： 如果你肿瘤免疫的生物学背景知识不强，也没有很好的实验平台，那么还有最后一种选择，那就是万能膏药之临床预测模型。最后一篇发表在 Front Immunol （IF:）杂志上，篇名为“9-Gene Signature Correlated With CD8 + T Cell Infiltration Activated by IFN-γ: A Biomarker of Immune Checkpoint Therapy Response in Melanoma”的文章就是通过构建和免疫治疗相关的临床预测模型。有关临床预测模型的构建，现在已经很成熟了，如 LASSO,COX,NMF 等模型都可以套用。这个思路前提是需要找一个较为新颖切入点，且最后能被多套数据集验证出来，那就基本可以发表一点不错的SCI文章了。 7.小结 本文从研究肿瘤免疫治疗应答的这个科学问题着手，先是通过一篇以实验为主的研究型文章解读了如何通过巧妙的实验设计筛选出有潜力的免疫检查点分子，随后分别解读了一些纯生信和生信联合实验的文章思路。有关肿瘤免疫治疗问题可以研究的方向有很多，但是 一般需要先了解研究癌型的免疫治疗进展 ，有的问题在一些癌型中已经被研究的很通透，那就没有必要再去浪费时间了，而同样的科学问题在一些肿瘤中就还是一个未知，那这样的问题就比较有研究的价值了。此外，就像开头说的因为免疫治疗应答与否牵扯的问题主要和免疫细胞的比例有关，而免疫细胞在肿瘤中的占比不高，因此bulk测出来的高表达基因主要是肿瘤细胞自身的基因，从这个角度看基于 bulk数据差异分析找出的高表达基因需要用肿瘤细胞系去做实验验证 。而单细胞数据就比较利于揭示免疫细胞上表达和免疫治疗的基因，但是商品化的10X平台可测得的基因不多，我的经验是先从单细胞数据揭示各种免疫细胞的比例，找出应答和非应答的差异免疫细胞亚群，从而进一步找出高表达的基因，最后通过简单实验进行免疫细胞的功能验证就基本都可以发表一篇不错的生信文章了。 更多精彩文章欢迎关注生信人公众号 最新文献免费获取，欢迎关注医科文小程序

免疫治疗中所产生的不良反应有别于化疗、放疗的不良反应，它通常的表现形式为一系列模仿自身免疫性疾病的炎症性疾病，这些情况被称为免疫相关性不良事件（irAEs）

具备如下几个特点：

常见免疫不良反应

常见免疫不良反应有皮疹、瘙痒、乏力等情况，较为严重的会产生炎症：肺炎、胰腺炎、皮炎等，极少数患者会出现心肌炎，下垂体炎等致死不良反应。

如何预防&应对免疫不良反应

目前没有特别有效的预防方式，为了保障患者的安全，专业进行免疫治疗的医院会定期对患者的相关指标进行监测，通常要求患者提供治疗前一周内的检查报告。

如何处理PD1引起的副作用

根据NCCN指南标准，免疫不良反应分为1~4级，1，2级通常为轻度，以减少剂量辅以针对性的药物治疗。3级为中度，需要停药接受治疗，此后进行重新用药评估，方可决定是否继续使用免疫治疗。4级为重度，立刻停药接受治疗，并且不得再使用PD1抑制剂。

PD1-PDL1药物阻断治疗具有较广的适用范围, 如肺、头颈部、乳腺、肝和胃肠道的恶性肿瘤, 以及某些淋巴瘤，疗效很好。然而, 对于其他癌症类型, 如前列腺癌和CRC对抗PD1治疗具有一定的耐受性，因此 免疫治疗是一种非常有前景的治疗方法 ，也需要研究者们不断的去探索发现。

通过大量的研究发现，PD1免疫药物的副作用主要来源于盲目用药导致的人体免疫异常。在癌症治疗过程中，不同免疫药物的选择、癌症原发及转移的复杂程度、医生关于免疫治疗的临床经验差异，都会使治疗效果产生差异，寻找专业医生进行免疫治疗显得尤为重要，而合理的免疫药物联合使用方案不仅能提升PD1药物的治疗效果，还能有效降低药物的副作用反应!

随着PD1免疫疗法的兴起，肿瘤癌症患者也更加愿意接受这种方法的治疗。经过多次临床数据证明，这种方法已经显示出治疗多种肿瘤的潜力，并取得了良好的治疗效果。但是，我们要知道，PD1免疫药物属于肿瘤处方药物，不可避免具有一定的毒副作用，那么，我们应该如何处理PD1免疫药物引起的副作用呢？小科普：PD1药物副作用的引起主要是来源于盲目用药导致的人体免疫异常。我们都知道，PD1副作用目前是医学界关注的一大问题。尽管近年来PD1免疫药物在多种肿瘤中显示出非凡的疗效，但是随着此类药物的广泛应用，PD1的副作用也逐渐凸显。那么，这种药物的副作用怎么样呢？到底会不会危及生命呢？目前已经上市的PD-1/PD-L1免疫药物共有6款，分别是Opdivo（百时美施贵宝，PD-1）、Keytruda（默沙东，PD-1）、Tecentriq（罗氏制药，PD-L1）、Imfinzi（阿斯利康，PD-L1）、Bavencio（辉瑞/默克，PD-L1），LIBTAYO（赛诺菲/再生元，PD-1）。其中最初上市的PD1药物O药和K药适用症是较广的，疗效也更好。PD1免疫药物在近年来在很多的肿瘤类型中都得以应用，经过医学界的研究发现，PD1总的副作用不过有七类：1、疼痛。肿瘤部位和骨转的位置，有疼痛加重的感觉。2、胸水。3、发烧。三五天到两周的情况都有，每天不定时发烧也有。4、咳嗽、恶心、疲乏、皮疹、瘙痒、腹泻、食欲减退、便秘等。5、血常规异常。6、结肠炎、肝炎、内分泌病、肾炎。7、免疫性心肌炎。其中PD1的副作用介导性肺炎、免疫性心肌炎易发生死亡。不同的医生，不同免疫药物的选择和不同肿瘤患者的自身情况都是造成PD1免疫药物产生副作用的关键，要解决PD1免疫药物引起的副作用主要还要从这几个方面入手。处理PD1药物副作用方法一：在专业的医生的指导下使用选择专业的医院和医生，在有足够经验的医生的指导下使用此类药物是解决PD1免疫药物副作用的关键。目前PD1药物在国内使用的经验还十分有限，开始售卖后可能会有因本药品的使用产生未知的副作用的发现的可能性。所以，肿瘤患者可以在发生紧急情况时充分的医疗设施保证情况下，由经验丰富的医生处理。处理PD1药物副作用方法二：PD1药物要针对适应症的患者使用PD1药物虽然效果很好，但是其副作用也是不可忽视的。特别是对间质性肺疾病的患者和有间质性肺疾病历史的患者或者自身免疫疾病的慢性或复发性自体免疫疾病历史的患者，对药品的使用要慎重选择。处理PD1药物副作用方法三：在治疗前要对自身病情做好精确的评估在使用PD1药物前需向患者及家属充分说明可能引起的严重副作用，然后需要对患者自身病情做好精确的评估，然后再选择对症药物进行治疗。但是，这种药物的投入使用之前，医生也需对患者及其家属关于药品有效性和副作用，及副作用的对策进行充分说明。处理PD1药物副作用方法四：采用合理的免疫药物联合使用方案临床研究显示，PD1药物在联合疗法中的效果更加有效，合理的免疫药物联合使用方案不仅能提升PD1药物的治疗效果，还能有效降低药物的副作用反应。但是要注意有几种癌症类型是不能采用PD1免疫药物的。分别是器官移植患者、自身免疫病患者（如克隆氏症、红斑狼疮症）、严重肺炎患者、呼吸困难患者、HBV/HCV阳性的患者和孕妇。