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医学科研实验基础知识笔记（四）：细胞自噬研究策略
细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下， 细胞利用溶酶体降解自身受损、 变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬是细胞的一种自我保护机制， 广泛存在于真核细胞内， 在调节细胞生存和死亡的过程中， 起着重要的作用。
当细胞发生自噬后， 在自噬相关基因的调节下， 细胞通过单层或双层膜， 包裹待降解的细胞质或细胞器， 形成囊泡状的自噬体（autophagosome） 。然后自噬体再和溶酶体（lysosome）
发生融合形成自噬溶酶体（autolysosome） ， 由溶酶体内的一系列水解酶， 降解自噬溶酶体内所包裹的内容物， 以实现细胞对自身代谢和能量的更新。
1.自噬的细胞学分类及过程
根据细胞内物质运输到溶酶体的方式以及生理功能的差异， 哺乳动物的细胞自噬可以分为三种类型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。
1） 大自噬/宏自噬：我们通常所说的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的过程中， 细胞质中可溶性的大分子物质以及变性的细胞器， 被内质网、 线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体。接着自噬体的外膜与溶酶体膜融合， 进一步形成自噬溶酶体， 自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解， 最终完成整个的自噬过程。
2） 小自噬/微自噬：与大自噬过程不同， 是溶酶体膜自身发生内陷， 包裹和吞噬细胞内待降解的底物， 并在溶酶体内发生降解。小自噬与大自噬的区别就在于， 在小自噬过程中胞质成份是直接被溶酶体包裹， 没有形成自噬体的过程。
3） 分子伴侣介导的自噬：在分子伴侣介导发生的自噬过程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白质分子。分子伴侣蛋白识别带有特定氨基酸序列的底物蛋白质分子， 并与之结合， 然后再经溶酶体膜上的受体 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 转运到溶酶体；底物蛋白分子再在溶酶体内， 被水解酶降解。因此， 分子伴侣介导的自噬与前两者不同， 在降解蛋白时具有选择性。而大自噬和小自噬现象中， 一般而言， 在降解蛋白时没有明显的选择性。
2.自噬信号通路
3.自噬与凋亡的关系
细胞凋亡也被称为 I 型程序性细胞死亡；自噬则被称为 II 型程序性细胞死亡。凋亡和自噬是两种显著不同的细胞死亡形式， 两者在形态、 生化指标以及调控细胞死亡的过程上都存在着较大的差异， 但两者又不是两个完全独立的过程。许多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情况下也是相互影响和制约的。自噬和凋亡之间存在着三种不同类型的相互作用，而且每种类型都对应着相应的特定的细胞类型、 刺激和环境。
1） 自噬和凋亡互相协同， 共同促进细胞死亡。两种效应之间， 可以其中一种效应影响另一种效应；自噬也可以作为凋亡的上游调节因子， 直接调控细胞凋亡， 从而影响细胞的死亡；
2） 自噬可以通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。比如， 可以通过去除因氧化应激受损的细胞器， 或降解变性的大分子物质， 为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量；或者通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。自噬的这些功能将会抑制促凋亡信号的产生， 从而起到拮抗细胞凋亡的作用。
3） 自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡， 但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些 ATP 依赖的凋亡过程。
4.自噬的分子机制和特征
1） 自噬诱导阶段（induction） ：正常生理状态下， 细胞保持很低的基础自噬水平。这时细胞内能量充足，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1(也就是 mTOR 复合物 1，也叫做 mTORC1)处于活化的状态。活化的 mTORC1 通过磷酸化的方式使得 ATG13 发生磷酸化反应， 从而抑制细胞的自噬。
2） 成核过程（vesicle nucleation） ：成核过程和 Vps34-ATG6 复合物密切相关。这个复合物还包含有调节性蛋白激酶 Vps15， 共同作用于膜泡的成核， 介导 PAS(也就是前自噬体结构pre-autophagosomal structure)的形成。
Vps34-ATG6 复合体还可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3， 并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。请大家注意， Vps34 在哺乳动物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳动物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以 Vps34-ATG6 复合体， 也被称为 PI3K-Beclin-1复合物。
3） 自噬体的延伸阶段：这个过程的分子机制是最为复杂的。哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个类泛素化的系统：a） ATG12 的结合过程；b） LC3 的修饰过程。
ATG12 的结合过程是类似泛素化的过程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。ATG12 首先由 E1样酶 ATG7 活化， 再通过 E2 样酶 ATG10 转运并结合 ATG5， 然后和 ATG16 结合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面， 并参与前自噬体外膜的扩张。
LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修饰过程同样需要类似泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。LC3 前体形成后被 ATG4 加工成胞浆可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 样酶 ATG7 和 E2样酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合， 直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物， 也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。
哺乳动物的 ATG12-ATG5 类泛素化过程和 LC3 类泛素化过程并不是独立运行的， 它们之间可以相互作用、 相互调节。
4） 自噬体的成熟阶段：自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(Rab S)作用下， 与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。
5） 自噬体的裂解阶段：是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、 能量或循环利用。
5.自噬诱导剂
a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
e) Rapamycin：mTOR抑制剂
f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
6.自噬抑制剂
a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
c) Hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
7.自噬的检测手段
自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物，因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段降解被抑制所致，所以设置合适的对照很有必要。
（1）透射电镜，电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构；
（2）WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1；生化检测自噬体膜标志蛋白， 特别是ATG12、 ATG5 和 LC3；荧光显微镜检测 LC3 或GFP-LC3 斑点的形成；生化检测自噬底物 p62。
（3）WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。
（4）组织蛋白酶Cathepsin活力检测。
（5）IF检测自噬潮autophagic flux
自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
（1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
（2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
（3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。需要多种检测方法结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
（4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异
（5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。
由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用处理。）
8.自噬研究常规思路
通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：
（1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）
（2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）
（3）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。
9.研究自噬的文献参考
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monica的私人花园
外界刺激 (如药物、紫外线和电离辐射) 和内源性自由基和活性氧 (ROS)会直接或者间接地损伤蛋白质、脂质和 DNA 等细胞成分，为了抵御这些不利影响，机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统来缓解细胞所受的损害。而 Nrf2 ， 作为 调控抗氧化应激的一种关键转录因子，在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用 ，如调节氧化还原平衡、药物代谢和排泄、能量代谢、铁代谢、氨基酸代谢、生存、增殖、自噬、蛋白酶体降解、DNA 修复和线粒体生理机能。另外，Keap1-Nrf2 系统已成为癌症和神经退行性疾病以及许多自身免疫和炎性疾病的重要治疗靶点。 Nrf2 的自我介绍 ：大家好，我是 Nrf2~我是 Cap'n'collar(CNC) 转录因子家族成员，我的“身体”由七个 Neh 域 (Nrf2 ECH 同源结构域) 组成，每个域具有不同的功能，如 Neh1 CNC-bZIP 域负责与 small Maf (sMAF) 蛋白结合和二聚化；Neh2 结构域通过 DLG 和 ETGE 基序介导与 Keap1 的相互作用；Neh4、Neh5 和 Neh3 域对于 Nrf2 的反式激活非常重要；Neh6 结构域是一个富含丝氨酸的区域，可调节我的稳定性。大家猜猜，我是怎么被激活的呢？ Nrf2 的激活“大戏” 1、经典途径——Keap1-Nrf2 途径 说到 Nrf2 的经典激活机制，不得不提一提 Nrf2 老搭档——Keap1 (Kelch ECH 相关蛋白 1)。Keap1 是一种 Cullin3 (Cul3) 依赖性的 E3 泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白，可与 Cul3 和 Rbx1 组装成功能性 E3 泛素连接酶复合物 (Keap1-Cul3-E3)，进而对 Nrf2 进行调控。Keap1 含有三个功能域，包括一个 BTB 结构域，一个 IVR 和一个 Kelch 或 DGR 结构域。BTB 结构域结合 Cul3，是 Keap1 二聚化所必需的。Kelch/DGR 结构域可与上面提到的 ETGE 和 DLG 基序相互作用，这对于维持 Nrf2 和 Keap1 之间的相互作用至关重要。IVR 连接了 BTB 和 Kelch/DGR 结构域，含有一些可调节 Keap1 的活性的半胱氨酸残基。 在正常的生理条件下，Keap1-Cul3-E3 泛素连接酶靶向位于 Nrf2 N 端的 Neh2 结构域 (位于 DLG 和 ETGE 基序之间) 的多个赖氨酸残基，并促进泛素化，随后泛素化的 Nrf2 被递送至 26S 蛋白酶体进行降解。[PS: DLG 和 ETGE 与 Keap1 中的 Kelch 域相互作用，一般称为“铰链和闩锁” (Hinge-and-latch model) 模型]。 而暴露于 ROS、亲电胁迫会使 Keap1 中特定的半胱氨酸残基被修饰，引起 Keap1-Cul3-E3 泛素连接酶的构象变化，干扰 Nrf2 泛素化，随后 Nrf2 易位至细胞核，通过与 sMAF 蛋白的异二聚化作用结合到靶基因的 ARE/EpRE (抗氧化反应元件/亲电响应元件) ，诱导一系列细胞保护性基因表达，如 NQO1 、 GST 、 HMOX1 、 GCL 、 GSH 等。2、非经典途径——自噬-溶酶体途径 除 Keap1-Nrf2 途径外，Nrf2 激活的非典型机制，即 自噬-溶酶体途径是由自噬功能障碍驱动的 ，自噬-溶酶体途径在介导氧化应激中也起关键作用。自噬是一种严格调控的细胞降解途径，负责清除受损的蛋白质和细胞器，包括氧化受损的蛋白质和功能异常的线粒体，自噬可以是非选择性的，也可以是选择性的。p62/SQSTM1 (以下称 p62) 是一种选择性自噬的经典受体，用于降解泛素化的底物。p62 参与许多信号转导途径，其中包括 Keap1-Nrf2 途径。自噬功能障碍 (如 Atg5 、 Atg7 缺失，*毒物环境等引起)则会导致自噬衔接蛋白的 p62 的积累。由于 p62 是能与许多蛋白相互作用的多域蛋白，它的积累会导致许多结合蛋白的隔离和功能丧失，包括 Keap1。研究表明，p62 与 Nrf2 竞争结合 Keap1，这种相互作用使 p62 可以将 Keap1 螯合到自噬体中，从而阻止了 Keap1 介导的 Nrf2 降解，导致 Nrf2 通路激活。 Nrf2 在癌症中的两面做派 在生理条件下，Nrf2 维持细胞的氧化还原稳态，并发挥抗炎功能和进一步的抗癌活性，从而支持细胞存活。因此，Nrf2 的激活在癌症化学预防中很重要。但是，Nrf2 的过度活化也会赋予癌细胞多种优势，比如保护癌细胞免于凋亡和衰老，促进细胞生长，介导癌细胞对化疗和放疗的抗性等。1、Nrf2的阳光面——激活抑制肿瘤发生 Nrf2-Keap1 途径的激活是抗肿瘤发生的最重要机制之一。通过靶向 Nrf2/ARE 途径来调控基因，进而发挥化学预防作用的一些化合物，不仅包括合成化合物如 Oltipraz ，还有一些植物来源的化合物，例如 Sulforaphane 、 Curcumin 、 Resveratrol 等。 2、Nrf2 的阴暗面——组成型激活促进癌症的发展 一些研究表明在各种癌症中 Nrf2 信号通路组成性激活会促进癌细胞的生长和增殖，阻止细胞凋亡，增强癌症干细胞 (CSC) 的自我更新能力，更重要的是，可增强癌细胞的化学耐药性和放射抗性。因此，阻断 Nrf2 信号是一种有前途的癌症治疗方法，特别是对于 Nrf2 水平升高的癌症。靶向 Nrf2 的抑制剂也有很多，比如 Brusatol 、ML385、 Luteolin 、Ochratoxin A、 Retinoic acid (ATRA)、 Trigonelline 等。 另外，据报道有几种机制可增强癌症中Nrf2 的活性，如 (1)体细胞的 KEAP1 、 CUL3 或 Nrf2 突变；(2) Keap1 的表观遗传沉默；(3) 破坏 Nrf2 和 Keap1 之间相互作用的蛋白质异常积累，如改变 Nrf2-Keap1 结合的 p21、p62；(4) 通过癌基因依赖性信号传导导致的 Nrf2 转录上调，如癌基因 K-Ras 通过 Mek-Erk-Jun 信号通路激活 Nrf2 转录；(5) 通过代谢中间体修饰 Keap1 等。 总而言之，Nrf2 的激活在癌症中作用是双重的。 为了预防氧化和炎症应激导致的慢性疾病和癌症，增强 Nrf2 的活性仍然是一种传统而有效的方法。但 Nrf2 在各种癌症中的组成性激活又会促进癌细胞增殖并导致癌细胞的化学抗性、放射抗性。因此，想知道 Nrf2 的激活是否会导致癌症，如何靶向 Nrf2 (直接或间接抑制上游蛋白激酶)，以及对 Keap1 结构进一步确定，还需要大家继续努力搞科研啦！ Nrf2 激活剂 Sulforaphane 可以激活 Nrf2，并通过 AMPK 依赖性信号传导抑制高糖诱导的胰腺癌。 Curcumin 乙酰转移酶 p300/CREB 结合蛋白特异性抑制剂；通过 Keap1 半胱氨酸修饰诱导 Nrf2 蛋白的稳定。 TBHQ 广泛使用的 Nrf2 激活剂，通过激活 Nrf2 来免受 Doxorubicin (DOX) 诱导的心脏毒性。 Resveratrol 天然多酚，具有抗氧化、抗炎、保护心脏和抗癌的特性。它的靶点广泛，例如 mTOR、JAK、β-amyloid、Adenylyl cyclase、IKKβ、DNA polymerase，也是 Nrf2 激活剂。 Oltipraz 一种 HIF-1α 激活抑制剂，也是强效的 Nrf2 激活剂。 Carnosol 一种有效的核糖体 S6 激酶 (RSK2) 抑制剂；Nrf2 激活剂，能提高细胞核内 Nrf2 的水平。 Nrf2 抑制剂 Brusatol 可抑制 Nrf2，通过一种不依赖于 Keap1、蛋白酶体和自噬蛋白降解系统的机制激发 Nrf2 的消耗。 Luteolin 有效的 Nrf2 抑制剂，具有抗炎和抗癌特性。 Retinoic acid RAR 核受体的天然激动剂，对 RARα/β/γ 作用的IC50为 14 nM；可以通过激活视黄酸受体抑制 Nrf2。 Trigonelline 有潜在抗糖尿病活性的生物碱；有效的 Nrf2 抑制剂，能阻断 Nrf2 依赖性的蛋白酶体活性。 缩写： BTB domain: Broadcomplex/tramtrack/bric-a-brac domain IVR: Intervening region DGR domain: Double glycinerepeat domain参考文献 1. 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1、目录的自动生成。 1.1 在“格式”菜单中选择“样式和格式”，设定文章的主要大纲级别(一般为三级，即有标题1 、标题2、标题3)。 1.2 几级大纲对应
万达集团乔梦云 4人参与回答 2023-12-09 法律自考论文参考文献的查找方法 法律自考论文的参考文献相当重要，能够表明作者查询、阅读文献的深度和广度。一篇优秀的法律自考毕业论文，必然需要有权威的、丰富的`参
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刘阿奔好运来 3人参与回答 2023-12-10 右哉 [细胞自噬] 2016-01-07 最近自噬的研究都很火，耐药不耐药，凋亡不凋亡的都开始往上扯了。 这篇文章的题目是："Ulinastatin Reduc
英式风情茶 2人参与回答 2023-12-07 如何自动生成参考文献
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