农杆菌转化法研究进展论文

​Agrobacterium -mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi Abstract 农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 可以将自己的部分DNA（transferred DNA；T-DNA）转移到很多种真菌中，这些可以用农杆菌介导转化（ Agrobacterium -mediated-transformation；AMT）的真菌数量仍在上涨。AMT为一些用传统方法难以对基因进行操作的真菌打开了一扇大门。文章讨论了农杆菌DNA转化系统在真菌诱变中的作用。 Introduction 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）是第一个测定了全基因组的真菌，其研究和工具发展的很多很快，比如基因功能注释，转录情况分析，蛋白质二维凝胶分析，质谱等。然而对于丝状真菌，对于每一个预测基因的系统的突变分析，无论是定向诱变还是随机诱变都很困难。 与酵母菌不同的是，丝状真菌定向诱变需要构建基因互换盒（gene disruptioncassettes），且两侧有较长的同源区域（>1,000bp）才行。目前构建所需基因盒的方法有很多，各有优缺点。1995年，Bundock等人将应用于植物细胞的农杆菌使用在了真菌上，后来很多研究证明AMT可以用在很多不同的真菌上，与传统的真菌原生质体转化法相比，AMT可以利用孢子，菌丝体等作为开始材料，不需要制备原生质体，且更加高效。 Basics of AMT 农杆菌是植物病原菌，造成植物冠瘿瘤。致病机理是将200kbp的Ti质粒上上一段T-DNA转移到植物，T-DNA整合到植物基因组，指导合成一些酶，调节植物生长代谢。 Ti质粒上还包含一些segment，叫做virulence region，这个区域由许多致瘤性 vir 基因组成。Virulence region编码的蛋白质也参与了T-DNA的形成，转运和整合。 T-DNA两侧有24bp的重复序列，它是DNA运输到植物细胞体系的顺式作用信号。然而T-DNA的其他部分可以被删除或被替代，而不影响片段的转运能力。 农杆菌的这些特质发展出了现在用于转化植物和真菌的二元载体系统（binary vectorsystem）。在这个系统中T-DNA和virulence region分别存在于两个质粒里，含有virulence region的质粒叫做helper plasmid或disarmed plasmid，保留在农杆菌里。含有T-DNA的质粒在中，便于研究人员操纵。构建好带有T-DNA的质粒后，可由电击法等方法将质粒送入农杆菌中。 自然条件下，植物分泌的酚化物质或糖诱导农杆菌启动致病途径，诱导 vir 基因编码T-DNA转运机器，其双组分调节系统（two-component regulatorysystem）包括virulence proteins VirA和VirG，这两个蛋白激活对丁香酮（acetosyringone，AS）的识别并开始一系列反应。研究发现，农杆菌对真菌进行转化时，需要丁香酮存在才可成功，所以对真菌转化依然依赖农杆菌的virulence region。不过针对植物，酵母，丝状真菌的农杆菌转化的关键蛋白有一些差异。 当然寄主中的蛋白也会对农杆菌介导效率产生影响，所以不同真菌株系的转化效率也不一样。 Factors influencing AMT efficiency infungi 初始真菌材料 前面虽然提高农杆菌转化的一个好处是避免使用原生质体，然而对于一些真菌，仍然是原生质体的效率更高。不同真菌不一样，有的是分生孢子，有的是营养菌丝效率更高。而且越年轻的菌丝体，越有活力，转化效率越高。 农杆菌和寄主 不同农杆菌与不同寄主株系的组合都可能产生不同的转化效率。 AS使用 真菌与农杆菌共培养时，添加AS是必需的，AS可以诱发 vir 基因工作。AS在500μM浓度时效率很好，有时在单独培养农杆菌时也加入AS对转化效率提高有帮助，但是农杆菌用AS预处理对有些菌的转化甚至有反作用，比如 Beauveria bassiana ,  Fusariumoxysporum , 和  Magnaporthe grisea 。 共培养条件 包括温度（22-25℃最好），pH（），两者加入的比例，滤纸类型。有研究表明，不同真菌与农杆菌的浓度配比，应与真菌生长速率与对农杆菌的敏感度有关。 顽强的真菌 由于人类对T-DNA转运机制理解仍然有限，有一些顽强的真菌不可以用农杆菌转化的方法操控。目前还没有解决的方法。综述在后面举了一些真菌应用农杆菌转化法成功产生突变体的成功案例。并且讨论了与传统CaCl2/PEG原生质体转化方法的效率比较，农杆菌介导的普遍比原生质体转化法效率高，基因位置对转化率也有影响。参考文献 Michielse, , ., van den Hondel, ., and Ram, . (2005)Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics infungi.  Current genetics   48 : 1-17.