蛋白质融合技术毕业论文

是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，由同一调控序列控制构成基因表达产物的技术。该技术可以构建具有双重功能的目的蛋白，在医药、农业、环境等中有广泛的应用。

蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用，缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。 蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成的肽构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。 定位突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性或催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。 盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。 PCR技术DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。 高突变率技术从大量的野生型背景中筛选出突变型是一项耗时、费力的工作。有两种新的突变方法具有较高的突变率：①硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因；②UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制。 蛋白质融合将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。