土壤酶活性测定毕业论文

脲酶urease（水解酶）：nbsp;脲酶试验原理：nbsp;存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。nbsp;土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。nbsp;试剂：1）甲苯nbsp;2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。nbsp;3）柠檬酸盐缓冲液（）：184克柠檬酸和克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释至1000毫升。nbsp;4）苯酚钠溶液（）：克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。nbsp;5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为，溶液稳定。nbsp;6）氮的标准溶液：anbsp;精确称取克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液nbsp;标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。nbsp;取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500amp;micro;g/g，另1份相应加入的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。nbsp;1)nbsp;称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。nbsp;2)nbsp;向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟nbsp;3)nbsp;之后加入10mlnbsp;10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（），并nbsp;仔细混合nbsp;4)nbsp;将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24hnbsp;5)nbsp;培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。nbsp;6)nbsp;显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。nbsp;7)nbsp;1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。nbsp;8)nbsp;无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照nbsp;9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。nbsp;结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示。nbsp;M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10nbsp;式中：M－土壤脲酶活性值nbsp;X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数nbsp;X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数nbsp;X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数nbsp;100nbsp;――样品定容的体积与测定时吸取量的比值nbsp;10nbsp;――酶活性单位的土重与样品土重之比值nbsp;注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时，本法能获得可靠结果。当脲酶活性小于3微克NH3-N，培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）nbsp;计算：脲酶活

土壤脱氢酶活性测定 原理 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲臢（TPF），TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。 测定步骤 1 称取4克鲜土于50ml三角瓶中，加入4mL（TTC-葡萄糖-Tris缓冲溶液（，即2ml 1%TTC-Tris缓冲溶液，2ml 1%葡萄糖)，置37℃暗室培养24hr。 2 取出后用少量甲醇提取后过滤，再用50ml容量瓶或比色管定容。 3 滤液马上用485nm波长下分光光度计测定。 附： Tris缓冲液的配制： A： 三-（羟甲基）-氨基甲烷溶液（1000 ml含克） B： HCl 100 ml A+ B,加水稀释至400 ml，准确调节pH为。 TPF标准曲线的制备：准确称取10mg TPF溶于250 ml甲醇中，得到40 mg/L的母液。从中吸取0，1，2，3，4，5 ml于50ml容量瓶中，用甲醇定容，得到0，40，80，120，160，200ug TPF的标准曲线。 参考文献 Casida LC Jr, Klein DA, Santoro T(1964) Soil dehydrogenase activity. Soil Science 98, 371-376. , , , , and (2003) Effects of lanthanum on dehydrogenase activity and carbon dioxide evolution in a Haplic Acrisol. Australian Journal of Soil Research 41, 731-739. ,