基因组提取方法比较毕业论文

写在前面 要让从基因组中获取信息变得像喝水那样简单。 --by zhougengxu

我以水稻基因组为例，像大家介绍如何提取序列。

打包成脚本如下

比如我只想提取一号染色体上的10000-50000这一段序列。 首先建立索引。

然后根据染色体信息和物理位置直接提取。这里注意，如何要和目的4连用的话，要修改 > 后面的值与gff文件一致才可以。

首先提取目的区域的文件。

其次对目标区域的物理位置进行相加减，便可得出目的区域中的基因组注释信息。这里注意，减去的数值是目的位置的数值减1，具体原因就是小学的切树理论。这样才能保证你用截短的注释文件提取的序列和原文件中提取的序列保持一致。

最后得到的便是我们想要的目标3里面基因组文件对应的注释文件了。

1. 2.

1、苯酚氯仿抽提法

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

2、离心柱法

离心柱法DNA提取它的优点是比传统的酚氯法提取的纯度高，有利于RNA保护，而且能进行微量操作，以其低廉的价格和相对便捷的操作，渐逐取代了传统DNA提取方法，被高校科研所等市场普遍接受。

离心柱法DNA提取的缺点是需要较多的样本，耗材多，对于珍稀样本无能为力，特别是在法医、考古等领域显得力不从心。

同时离心柱法DNA提取需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入，特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域，离心柱法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。

当面对突发疫情时，更是需要有高通量的DNA提取设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。

3、磁珠法

磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：

（1）能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查原因，这个优点是其他方法难以赶超的。

（2）操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步短时间内即可完成。

（3）安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，保护了实验人员的身体健康。

（4）磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。

（5）灵敏度高，适合法医样本等痕量DNA提取。

扩展资料：

磁珠法的原理是在磁珠表面修饰有对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液结合液洗涤液在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便地实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了以下是一些具体方法，希望有用基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,),混匀。4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm,离心10min。弃上清。8、加入倍体积3mol/L乙酸钠()与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。 外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。2、小心吸取上层血浆，分装到3个离心管中。3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。4、2500rpm离心10min，弃上清。5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。6、3000rpm离心10min，弃上清。7、倒置离心管，去掉残液。8、得白细胞，－80?C冻存。试验要求：血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂：Ligsisbuffer：；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：柠檬酸柠檬酸钠葡萄糖；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=)(PH=)(PH=)(PH=)；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。常用的外周血白细胞基因提取方法：试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。试验步骤：1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一离心管中，加70%乙醇，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。真核细胞DNA的制备 一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则： 1、防止和抑制DNase对DNA的降解。2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。试剂准备：1、TE:10mMTris-HCl();1mMEDTA()。2、TBS:25mMTris-HCl();200mMNaCl;5mMKCl。3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS5、2mg/ml蛋白酶K6、Tris饱和酚（）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7、无水乙醇、75%乙醇试验步骤：材料处理： 1、新鲜或冰冻组织处理： 1)取组织块,剪碎，加，转移到匀浆器中匀浆。2)将匀浆液转移到离心管中。3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。4)60°C水浴1-3hr。2、培养细胞处理：1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。2)离心4000g×5min，去除上清液。3)加10倍体积的裂解缓冲液。4)50-55°C水浴1-2hr。DNA提取：1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2、离心5000g×10min，取上层水相到另一离心管中。3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6、加1/10体积的3M醋酸钠（）和倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。植物组织中DNA的提取试验原理： 脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于的NaCl溶液中，而RNA则能溶于的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。植物DNA的SDS提取法：试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取，柠檬酸三钠，－Na分别溶解后合并为一，用的NaOH调至，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：称取和柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。4、×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。5、Rnase溶液：用溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9、1mol／LHCl。10、。11、二苯胺乙醛试剂：二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。12、高酸溶液（HClO4）。13、。14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量中，再用定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加，混合冷却后用定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。实验步骤： 1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7、然后加入左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。植物DNA的CTAB提取法：试验步骤： 1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。6、加入的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。 细菌DNA的提取方法针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl()25mMEDTA() 10MLiCl2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc() 96%乙醇70%乙醇试验步骤： 1、抽提缓冲液65℃预热。2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。5、重复再作一次步骤4。6、加入1/10体积的3M醋酸钠和倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。7、以2,000rpm，离心10min。8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。较为常用的细菌DNA提取方法：实验步骤：1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。2、取培养物12000rpm离心2min。3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．真菌DNA提取总结的两种方法：第一种方法： 试验步骤：1、取真菌菌丝,在液氮中迅速研磨成粉。2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。4、以4℃，1000rpm，离心5min。5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。9、用酚（）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。DNA提取液：（），，，1％SDS，3MNaAc。第二种方法：试验步骤： 1、真菌菌丝,在液氮中迅速研磨成粉。2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。8、用酚（）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。9、取上清，1/10V3MNaAc,体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。 植物基因组提取(CATB法) 作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论 一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl g 1M Tris-HCl 20ml( ) EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 （1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4） 将磨碎液分倒入 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中； （8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min； （13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 µl × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解； （15）置于-20℃保存、备用。 2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。 六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。