代谢学研究策略与方法的新进展

【关键词】 代谢组学 研究策略 分析方法 综述

　　1 代谢组学的概况

　　代谢组学(metabonomics)是以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域, 它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化,反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化[1]。代谢组学的概念最早来源于代谢轮廓分析 [2]。nicholson研究小组于1999年提出了代谢组学的概念[1],并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作[3～5]。fiehn等[6]提出了metabolomics的概念,第一次把代谢产物和生物基因的功能联系起来,之后很多植物化学家开展了植物代谢组学的研究,使得代谢组学得到了极大的充实,同时也形成了当前代谢组学的两大主流领域: metabolomics和metabonomics。经过不断发展，fiehn [6,7]、allen [8]、nielsen [9], villasboas[10,11]等确定了代谢组学一些相关层次的定义，已被学术界广泛接受。第一个层次为靶标分析，目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物；第二个层次为代谢轮廓分析，采用针对性的分析技术,对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定；第三个层次为代谢指纹/足印，定性并半定量分析细胞外/细胞内全部代谢物；第四个层次为代谢组学，定量分析一个生物系统全部代谢物，但目前还难以实现。

　　作为应用驱动的新兴科学,代谢组学已在药物毒性和机理研究[12，13]、微生物和植物研究[14]、疾病诊断和动物模型[15，16]、基因功能的阐明[17]等领域获得了较广泛地应用。近来,代谢组学又在中药成分的安全性评价[18]、药物代谢的分析[19]、毒性基因组学[20]、营养基因组[21]、药理代谢组学[22～24]、整合药物代谢和系统毒理学 [25,26]等研究方面取得了新的突破和进展。

　　完整的代谢组学分析的流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析及解释。样品的制备包括样品的提取、预处理和化合物的分离。代谢物通常用水或有机溶剂(甲醇、己烷等)提取。分析之前,常先用固相微萃取、固相萃取、亲和色谱等方法进行预处理，用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等方法进行化合物的分离。预处理后,样品中的代谢产物需要通过合适的方法进行测定。色谱、质谱、磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、放射性检测、光散射等分离分析手段及其组合都在代谢组学的研究中得到应用。其中,核磁共振（nmr）技术特别是氢谱以其对含氢代谢产物的普适性,色谱以其高分离度、高通量，质谱（ms）以其普适性、高灵敏性和特异性而成为最主要的分析工具。代谢组学研究的后期需借助于生物信息学平台进行数据的分析和解释[27],解读数据中蕴藏的生物学意义。最常用的是主成分分析（pca）法和偏最小二乘（pls）法。

　　但在研究的几个步骤中，代谢组学还存在一些不足。例如，分析手段存在局限性；全部定量分析难以实现，准确性不足；定性过程复杂。针对这些问题，现在的研究者们在研究策略和方法上做着积极的探索和改进。本文就将综述近年来在代谢组学研究策略和方法上的最新的研究报道，并结合本实验室的研究进行展望。

　　2 研究策略与方法

　　后基因组时代众多组学的发展向分析化学提出了更高、更严峻的挑战。对代谢组学，一些关键点的把握显得尤为重要。首先，代谢组学的整体分析平台的提升是未来代谢组学研究的关键环节，这包括：新的复杂样品预处理技术；灵敏、专一、原位、动态、无损、快速的代谢物组检测、表征与操纵技术；代谢物组成、结构和功能信息获取的新型技术和完整的数据采集和成像系统；有效、快速处理代谢组海量复杂数据的新化学信息学方法以及这些技术和方法学的原始性创新、学科间交叉和多维技术联用基本理论研究等。再者，制定代谢组学标准(包括方法、信息和数据库)，以及实现代谢组与基因组、转录组和蛋白质组等数据的整合，是未来代谢组学研究的一个关键问题。针对这些关键点，代谢组学的研究策略和方法得到了新的发展。

　　2.1 整合一体化

　　由于现有的分析技术都有各自的优缺点[28],单独使用一种或少数几种已经很难满足代谢组学研究的要求。所以整合的策略已经成为一个重要的趋势，这个整合不仅包括各种技术、方法，还包括不同来源的生物样品（血液、尿液、粪便等）。可以将目前的整合策略归纳为以下几个方面。

　　2.1.1 分析技术的整合 这个整合包括了不同分离技术、不同的数据获取方式、不同数据分析技术等。这样可以达到分析平台优势互补，使结果更完善、准确。在这方面刘昌孝等[29～31]做了一些液相色谱和质谱联用技术与化学计量学方法结合，应用于代谢组学的研究工作，并对这方面的发展进行了综述。chen等[32]也利用了整合的思想，提出了一套完整的潜在代谢标志物从发现到定性再到生理意义说明的方法。他们将指纹谱分析、多变量分析、液相串联质谱（lcms/ms）、微制备、傅立叶离子回旋共振质谱（fticrms）、气相质谱（gcms）、数据库检索、同位素标记物比对等方法进行了整合，利用整合后的平台对糖尿病进行代谢组学分析。先用uplcms采集数据，经数据处理后寻找到潜在生物标志物，经过微制备后，再利用fticrms和gcms进行分析，得到精确分子量和气相保留指数，再结合碎片分析，通过查询数据库最终确定标志物的组成及结构。再通过同位素标记物的比对，最终明确此化合物并进行了生理意义的说明。这个方法适用于所有进行代谢组学研究的体系，能使标志物的鉴定更为可靠和令人信服，为潜在标志物的寻找提供了一套标准有效的操作流程。还有人研究了多种离子化方式对代谢组学研究结果的影响[33]，发现单用电喷雾离子源（esi）的负离子模式比正负离子模式相结合少了90%的离子量，结合大气压化学电离（apci）后，离子量多了20%，而结合esi、apci、基质辅助激光解析电离（maldi）和多孔硅表面解吸离子化（dios）后，离子量提高了一倍，这在一定程度上代表信息量的增加。此外，亲和液相色谱、反相液相色谱和气相色谱的整合[34，35]、nmr与ms的整合[35]、不同填料色谱柱（如：c8、c18、苯基柱）的整合研究[36]都有报道。对于无商品化和不易得到标准品的物质,lee等[37]在定性分析中使用了绝对淌度和酸解离常数进行辅助解析，这也是整合思想的一个体现。这些研究都表明，整合策略正是现在代谢组学研究策略发展的一个重要方向。

　　在数据分析技术上，也体现着整合的思想。由于代谢组学分析产生的是信息量丰富的多维数据,因此，需要充分整合化学计量学和多元统计分析方法等技术，对代谢组学数据进行分析说明[38]。目前在代谢组学中运用较多的包括主成分分析、层次聚类分析(hca)、非线性影射(nlm)等非监督分类方法,以及偏最小二乘法判别分析（plsda)、k最近邻法(knn)、神经网络(nn)等监督分类方法。每一种方法都有各自特点，通过比较、整合可以得到更完整的结果。

　　2.1.2 数据的整合 由于样品分析手段的多样性，产生了许多不同的代谢组学数据，这需要通过数学统计方法对不同数据加以整合, crockford等[39]在进行毒理学研究时，采用了shy（statistical heterospectroscopy）方法对nmr与ms数据进行了整合，为生物标志物的发现提供了一个系统生物学工具。另外，lcms数据和gcms数据的融合[40]等也有报道。关于数据的另外一个整合是指代谢组学数据与其它一些整体研究数据之间的整合。随着现代自然科学技术不断发展，各种基于整体的研究，如蛋白组学、代谢组学、基因组学等不断出现并相互交叉，通过整合整体研究数据[41～43] ，可以更全面和深刻地阐明生物网络复杂性，准确理解代谢物与蛋白质、代谢物与基因之间的关系。廖沛球等[44]就在用代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应进行研究时，将大鼠血清中一些重要的生化指标及组织切片光镜图分析结果与代谢组学数据结合讨论。从数据形式上,采用xml通用标记语言的质谱数据可同时适用于蛋白质组和代谢组, 同时,在细胞信号通路等领域有重要作用的系统生物学标记语言sbml也正发展成xml形式[45]；有些研究也采用sysbioom数据记录平台,将pedro形式的蛋白质组数据和代谢组数据整合至mageom模式的转录组数据中[46]。组学数据整合可以通过代谢网络支架(scaffold)分析、建模方法或借用有关专业软件来实现[47]。yang等[48]利用代谢组学与蛋白组学技术，并将两者相结合来研究dna免疫调节对脂代谢的影响。在毒理分析中，spicker等[49]就用一个分级模型整合了临床化学数据，基因蛋白表达数据和其他的一些数据。由此看来，对于许多复杂的体系，单一内容的数据已经很难准确反映出体系的性质和变化，这就需要更加重视采用多种数据来共同研究问题、解释问题。这样得出的结果更全面、更准确。

　　2.1.3 研究对象的整合 通过整合代谢组学(integrated metabonomics)方法，同时对机体中不同来源的生物样品(尿样、血样、组织样等)进行代谢组学分析、数据比较和综合评价，可以使代谢组学的结果更完整、更准确[50]。nicholson实验组[51]将血样、尿样和肝脏组织样品分别进行代谢组学研究，将研究结果整合来进行毒理研究，得到了更好的研究结果。saric等[52]进行了粪便代谢组学研究，研究揭示了粪便代谢组群的种类变化与肠胃功能的关系。一些研究者还对大鼠毛发进行代谢组学分析[34]，表明毛发在寻找生物标志物上也有重要作用。

　　２．２ 定量化

　　从代谢组学的各个层次的定义不难看出，定量是人们追求的一个较高的目标。lee等[53]在研究壬基苯酚毒性作用时，就对比了有目标定量研究（针对雌激素、雄激素、肾上腺皮质激素）和无目标代谢指纹谱分析的结果，他们发现无目标、无准确定量的代谢组学研究结果只揭示毒性作用与作用量有关系。而有了准确定量后，毒性作用还表现出了与作用时间的相关性。代谢组学一直朝着全面定量努力。wang等[54]在代谢组学研究中就十分注重量的概念，在神经管畸形的研究中，他们根据先验知识锁定了一碳代谢循环通路，定量了11种物质，同时，也对同一样品进行代谢指纹谱分析，将定量结果加入到指纹谱结果中进行问题的说明。在糖尿病肾病研究中，整合了磷脂类、脂肪酸类、氨基酸类、核苷类和激素类五大代谢循环轮廓谱，定量了百余种物质，将这些再与指纹谱结合，将使代谢组学的研究更全面，更可信，有可能更清晰地去研究疾病的机理，达到疾病预警，指导并评价治疗的目的。

　　随着重视程度的增加，许多新的定量策略和方法都被提出并得到实验验证。对于定量，内标的使用是一个重要的手段，上文提到的毒性研究实验就是采用雌二醇d4为内标来定量。另外，bajad等[55]在用lcms/ms分析时，同时使用非同位素内标和同位素内标来实现定量，共定量了141种化合物，其中包含了氨基酸和核苷酸代谢的许多相关物质。可以说，内标的使用不但可以进行数据校准，还可以辅助定量。最近，weljie等[56]提出一种用于nmr进行代谢组学研究的定量方法，叫做靶标轮廓法，他们利用许多种纯品的光谱数据建模，从而建立一个数据库，通过检索比对来鉴定并定量代谢物，这个方法解决了低浓度物质和重叠区物质的定性定量问题。同位素比率的方法用于代谢组学定量是一种较新的尝试，huang等[57]在使用二维气相飞行时间质谱进行分析时，用d6标记的mtbstfa作为衍生化试剂对分析物进行衍生化，再根据同位素比率对分析物进行定量。通过对各种定量新方法的比较，可以看出，使用内标进行定量的方法会有鉴定方便，定量准确的优点，比较适用于那些结构非常清楚，内标物比较易得的物质的定量，而建模型数据库进行检索比对的方法的优点是比较简便，成本较低，但准确性有所欠缺。在实际研究中，应该根据每个研究对象的不同特点进行选择。

　　２．３ 标准化

　　由于代谢组学分析技术和操作条件的多样化，使得大量产生的数据和结果缺乏规范性,这给代谢组学数据的采集、存储、查询、比较、共享和整合等带来诸多不便。这就需要研究者对一整套的过程进行标准化。首先，在生物样品的收集、灭活和储存上，大多研究者就已经按照一些标准化程序来做。其次，在样品的前处理上，alzweiri等[58]系统地比较了乙腈、丙酮、甲醇和乙醇的除血样中蛋白和尿中的盐效果，为建立标准化前处理方法提供一些依据。在样品分析上，内标的使用就在一个更小层次的标准化上起到了一定作用。目前，最主要的标准化还是针对于数据的处理。代谢组数据的标准化也开始尝试类似转录组学和蛋白质组学的方法[59]，具体地规定有关实验和分析方法的数据格式和必要信息。如bino等[60]提出了miamet的代谢物组学数据模式，涉及实验设计、样品收集、处理和分析等各环节；基于miamet，jenkins等[61]提出了更为细致和完整的基于gcms的植物代谢物组学数据标准armet；kell等[62]采用xml标记语言,可将信息标准扩展到包括应用nmr和ms等技术的代谢组学数据中。代谢组数据的标准化工作需要科研、企业及政府机构等多方面力量共同参与。在这方面，倡导者之一的smrs工作组发挥了重要作用[63]，该小组已制订和发布了有关代谢组分析方法的标准化报告的详细草案[64]。

　　２．４ 新的分析方法

　　2.4.1 样品预处理 样品预处理是代谢组学研究中的重要内容[65,66]。基于代谢组分析的系统性，整个样品处理和分析过程应尽可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息,所以样品的预处理就显得尤为重要。许多研究工作也聚焦在了新的预处理方法上。webbrobertson等[67]在尿液预处理时，加入叠氮化钠，来防止细菌污染；在气相色谱质谱研究中，相转移催化技术(ptc)可以使分析物与离子对试剂形成离子对，利用它在有机相中溶解性好的特点，提高衍生化效率[68]。kind等[69]在尿液与处理上，采用尿素酶分解了尿中含量很高的尿素，与不进行此预处理的尿液相比，这种方法使一些被掩盖的信息表现出来。

　　2.4.2 样品分析 现阶段，样品分析和数据采集主要采用nmr和ms两种方法。其中，nmr技术，特别是新发展的高分辨魔角旋转、活体磁共振波谱和磁共振成像等技术使nmr成了代谢组学研究领域最主要的分析技术之一[70]；而现代ms技术也以其高灵敏度和专属性的优势而在代谢组学研究中备受青睐。一些应用于代谢组学研究的新技术也出现在这些相关领域中。超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱(uplc/tofms)技术及联机的markerlynx自动化数据处理软件早已运用到了研究中，为代谢组学研究提供了从样品分析到数据分析全过程的整体解决方案[71]。fticrms具有超高分辨率和准确度,可以配备大气压电离(apci)、纳升级电喷雾(nanoesi)和maldi等各种离子源,在代谢组学研究，尤其是未知物确定上发挥了很大的作用[72～74]；在代谢指纹的快速扫描中,直接输注质谱法的应用日趋广泛[75,76]；电喷雾解吸电离(desi)的质谱技术(ambient ms)[77～79]基于多孔硅表面的解吸离子化技术(dios)，突出特点是在常压下能将表面吸附的分析物进行解吸电离，这样就避免了样品预处理和基质背景干扰，从而实现ms对复杂样品进行原位、高通量、非破坏的分析，获得更直接和全面的样品信息[80]。wang等[81]自主研发了一套全自动亲水色谱柱/反相色谱柱加和转换的液质联用体系，从而将极性大的化合物进行了更细致分离，扩大了信息量，有助于全面准确衡量代谢情况。这套体系适合用于任何复杂生物样本的分析中，能简单而有效地完成极性范围很宽的不同物质的分离分析。enke等[82]在飞行时间质谱（tofms）的基础上发展了一套新分析技术，称为飞行距离质谱（dofms），它的分辨率可与四极杆和离子阱相媲美，而且还保持了tofms的优点，并提高了信噪比和动态学应用范围。在气相研究中，研究者创新地使用了纤维填充毛细管柱[68]，它的耐高温性能扩展了气相色谱的使用范围。

　　2.4.3 数据分析 数据处理的一些新的方法开发和应用，有力地推动了代谢组学的发展。saude等[83]根据不同代谢物和内标物的不同纵向弛豫率，得到校正因子，对代谢物的定量结果进行校正，大大提高了定量准确率；yang等[84]发展了一种峰校准算法，他们先定义了一系列响应比较强的峰，将保留时间划分为几个区间，对各个区间进行校准，并在肝病代谢组学研究中得到应用。oh等[85]开发了一个新的信息处理软件包，可以在样品数据中寻找同种代谢物产生的峰，并能消除杂峰（如污染物的峰），他们还用混合标准品和血样加标验证了软件准确性。在以gcms进行植物实验分类学研究中，splot作为一个能反映出代谢物与分类模型之间的共方差和相关性的工具，被用于鉴别有统计学意义和生理学意义的代谢物[86]。还有svd在线性最小二乘基础上的使用，能在一定程度上削弱峰重叠对峰指认和定量的影响[87]；mzmine和xcms能对保留时间进行校准[69]。这些方法的目的都是尽量减小分析中产生的误差，使结果更准确。

　　３ 展望

　　目前，国内外许多研究者都在进行代谢组学研究，代谢组学应用的范围和领域也在不断扩大。但这些研究依然存在了许多问题亟待解决。（1）在代谢全谱分析中缺乏量的概念。在这个问题上，我们通过这几年对代谢组学进行的研究，也提出了自己的一些策略和思想，首先是将代谢指纹谱与定量进行了结合，称之为定量代谢指纹谱技术。这个结合包含了两个层次，一个是数据采集技术上的结合；一个是数据分析技术上的结合。这样的结合能实现指纹谱与定量优势互补，将更清晰、更全面、更准确地反映研究对象的代谢情况。（2）虽然代谢组学强调无歧视分析，但对于任何一个体系，都按代谢组学常规步骤按部就班地进行分析，往往最终都没有得到有用的结果。针对这个问题，我们认为要重视先验知识的重要性，了解哪些代谢循环、代谢物质最可能与研究体系相关，利用这样的先验知识指导代谢组学分离分析条件的优化、潜在生物标志物的鉴定，将大大提高代谢组学研究的效率，并能很好地避免研究重心偏离的情况。（3）生物标志物的寻找单一而片面。特别是对于疾病的研究，以前不太重视代谢、蛋白、基因数据与临床数据的结合，各个方面的研究者就在自己的研究数据中进行挖掘，以此来寻找标志物，探寻机理。但实践证明，这样得出的结果都会有片面性，缺乏说服力。在这个问题上，应该强调代谢组学数据与其它数据的结合，特别是临床相关数据，以此来发现包含了不同数据内容的复合生物标志物，这也是今后代谢组学发展的一个重要方面，同时，这也为生物代谢或临床表型多样性研究[88]提供更可靠的方法和工具。

　　尽管存在许多的问题，但也看到了在研究策略上整合一体化、标准化、定量化的趋势，并且看到了在问题导向下的新技术的不断涌现，这都将推动代谢组学不断持续发展。相信随着关注度的提高、人力和物力的不断投入及应用范围的不断扩大，代谢组学必将得到更为稳健的发展。

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