丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞VEGF、bFGF mRNA表达及

【关键词】 丹酚酸b;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶

【摘要】 目的 探讨中药单体丹酚酸b对离体培养内皮祖细胞(epcs)细胞因子mrna表达及抗氧化酶活性的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化epcs，免疫细胞化学法鉴定。选择丹酚酸b最佳药物浓度干预的epcs，采用实时荧光定量pcr(rtpcr)检测细胞vegf,bfgf mrna表达，测定细胞培养液抗氧化酶sod,gshpx的活性。结果 丹酚酸b组vegf，bfgf mrna的表达量增加，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。丹酚酸b组细胞培养液中sod活性增强，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05);gshpx活性有增强趋势，但与对照组比较差异无显著性(p>0.05)。 结论 丹酚酸b对epcs具有保护作用，增强其细胞功能的部分机制与其增强分泌细胞因子vegf和bfgf mrna的表达，并且促进细胞释放sod、gshpx，清除自由基能力增强有关。

【关键词】 丹酚酸b;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶

　【abstract】 objective to explore the effects of traditional chinese medicine monomer sal b on cytokine mrna expression and activity of antioxidant enzymes of endothelial progenitor cells (epcs) in vitro. methods cultivation and purification of epcs in vitro was by densitygradient centrifugation and plastic adherence method，and identified by immunocytochemistry. epcs were intervened by best concentration of sal b, the expressions of vegf, bfgf mrna were detected by rtpcr, the activity of antioxidant enzymes sod, gshpx activity of cell culture fluid were tested. results vegf, bfgf mrna expression of sal b group were increased, which had statistically significant difference compared with those of control group (p<0.05). sod activity was enhanced of sal b group, which had statistically significant difference compared with that of control group (p<0.05). sal b group strengthened the trend of the activity of gshpx , but there was no significant difference compared with that of control group (p>0.05). conclusions sal b plays a protective role and enhances its cell function on epcs, the part of the mechanism is that enhances the expressions of vegf,bfgf mrna, promotes the cells to release sod, gshpx, and enhances the scavenging capacity of free radical.

　　【key words】 sal b; endothelial progenitor cell; cell factor; antioxidant enzymes

　　内皮祖细胞(epcs)是血管内皮的前体细胞，参与成体血管新生，是治疗缺血性疾病和改善微环境的良好种子细胞，具有广阔的应用前景〔1〕。前期研究显示活血化瘀中药丹参的主要水溶性成分丹酚酸b(sal b)对epcs具有保护作用，增强其细胞功能〔2〕。本文从细胞因子血管内皮生长因子(vegf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)mrna表达和抗氧化酶超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)入手，观察sal b对离体培养epcs细胞因子mrna表达及抗氧化酶活性的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　wistar大鼠，雄性，体质量(120±20) g(中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001)。

　　1.2 主要仪器和试剂

　　ldmem;特级胎牛血清;vegf，bfgf，纤维连接蛋白(r&d);大鼠单个核细胞分离液(天津灏洋生物);cd34兔多克隆抗体，cd133兔多克隆抗体;sal b(天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601)。免疫细胞试剂盒(天津灏阳生物)，二氨基联苯胺(dab)(sigma公司);二苯基四氮唑溴盐(mtt)(联星生物)，taqman reverse transcription reagents和sybr green pcr master mix reagent kits试剂盒(applied biosystems)，trizol总rna提取试剂(天津润泰科技发展有限公司);sod、gshpx生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　co2恒温培养箱(model tc2323 co2 incubator);倒置相差显微镜(xd101 98010)，超净化工作台(hitachi)，台式高速低温离心机(hermlez323k美国)， uv530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)，pcr仪(美国hybaid)，abi7300实时定量pcr仪，细胞培养管(ep管);半自动生化仪(rt9200，成都贝斯达仪器有限公司);hh6数显恒温水浴锅;离心机(ldz52);酶标仪(美国biorad);无菌手术器械;磁力搅拌器;电子天平(bs1101s 德国)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 epcs培养与鉴定

　　采用贴壁筛选和密度梯度离心结合法〔1〕：大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，dhank液冲洗骨髓，筛网过滤，制成单细胞悬液，按等比例缓慢滴加悬液于大鼠单个核细胞分离液(密度为1.080 g/ml)之上，2 000 r/min，离心15 min，抽取灰白色的单个核细胞层，用dhank′s离心洗涤后，以2.0×105/cm2的密度接种纤维连接蛋白(5 μg/cm2)在包被的培养瓶中，ldmem(含体积分数为15%胎牛血清，15% vegf，15% bfgf)，置于37℃，5%co2饱和湿度的培养箱中，4 d后首次换液，继续培养至第7天。选取生长良好的细胞培养至7 d的epcs，用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(sabc)法检测细胞表面抗原cd34、cd133。cd34、cd133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。

　　1.3.2 mtt方法检测sal b的最佳药物浓

　　度 根据文献报道设立0，0.5，1，2，4，8，16，32，64 μg/ml药物浓度，分别测定细胞的od值，根据od值均数曲线图确定sal b的最佳药物浓度。

　　1.3.3 实验分组

　　细胞培养第7天后，以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以等数量细胞接种于12孔板，随机分为2组：①对照组：ldmem培养液(含15%胎牛血清、15%vegf，15% bfgf); ②实验组：ldmem培养液加入筛选出最佳浓度的sal b，培养24 h，进行检测。

　　1.3.4 实时荧光定量pcr(rtpcr)检测细胞vegf,bfgf mrna表达

　　1.3.4.1 细胞总rna提取

　　①按试剂盒操作说明，直接将裂解液trizol加入12孔板，每孔1 ml，每组设6个复孔，分别用加样器反复吹打几次，混匀;②将匀浆样品在室温放置10 min，使核酸蛋白复合物完全分解，吸取匀浆样品放于1.5 ml无rnase的离心管中;③每个离心管中加入0.2 ml氯仿，涡旋混合器剧烈震荡15 s，室温放置3 min，令样品萃取分层; ④4℃，12 000 r/min，离心15 min，样品分为三层黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，rna主要存在于水相中，将上清水相转移到预冷新管中，约500～600 μl;⑤每管缓慢加入与上清等量的冷异丙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀，于-20℃静置2 h，使核酸沉淀;⑥4℃，12 000 r/min，离心10 min，弃上清，在管侧壁和管底形成白色胶状沉淀(rna);⑦缓慢沿管壁加入1.2 ml 75%乙醇(depc水配置)，洗涤沉淀，4℃，8 000 r/min，离心10 min，弃上清，剩余液体短暂离心，然后用枪头吸出，将沉淀室温放置2～3 min晾干，每管加入35 μl rnase free ddh2o，轻轻吹打数次，溶解rna，分装，备用。

　　1.3.4.2 总rna纯度、浓度测定及完整性检验

　　取1 μl总rna样品，加入到99 μl去离子水的比色皿中，混匀后紫外分光光度计测定od260、od280以及二者比值。od260/od280比值应在1.8～2.0范围，以此衡量rna纯度。根据公式“od260×40 μg/ml×稀释倍数/1 000”计算总rna浓度。

　　另取总rna 4.5 μl与0.5 μl上样缓冲液混合进行1%琼脂糖凝胶电泳，应用bio imaging system拍照，于凝胶成像系统中观察电泳结果，以出现28 s、18 s和5 s三条带确定rna的完整性。

　　1.3.4.3 cdna合成

　　根据试剂盒说明确定反应体系如下：总反应体系10 μl，10×taq man rt buffer 1.0 μl;25 mmol/l mgcl2 2.2 μl;deoxyntps mixture 2.0 μl;random hexamersb 0.5 μl;rnase inhibitor 0.2 μl;multiscribetm reverse transcriptase 0.25 μl;样品总rna 0.2 μg;反转录反应条件：70℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，终止反应。

　　1.3.4.4 目的基因vegf,bfgf及内参照基因βactin扩增 ①pcr扩增：在pcr仪中，bfgf、vegf反应条件为：94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32个循环;再于72℃延伸7 min。各目的基因及内参照基因特异性引物序列，βactin反应条件为：94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共28个循环;再于72℃延伸7 min。总反应体系为50 μl，包括cdna 3 μl，1 mmol/l dntps 10 μl，10×taq聚合酶buffer 5 μl，目的基因和βactin上下游引物各2 μl(10 pmol/l),mg2+3 μl，去离子水24 μl，taq酶1 μl。引物序列见表1。②所得ct值经转换后以2-δδct相对定量法获得每个样本各目的基因相对表达量数值。表1 各目的基因及内参照基因引物序列

　　1.3.5 细胞培养液抗氧化酶的测定

　　两组epcs培养于12孔板中，培养条件同前，7 d后收集培养液，每组取6孔样本，2 000 r/min，离心10 min，取上清，比色分析法测定培养液sod和gshpx活性，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

　　1.4 统计学分析

　　使用spss11.5统计软件，数据以x±s表示，采用两独立样本t检验。

　　2 结 果

　　2.1 sal b最佳药物浓度

　　确定sal b的最佳药物浓度为8 μg/ml，此剂量可使细胞生长状态最佳，细胞活力最强。见表2。表2 不同浓度sal b作用于epcs后细胞的吸光度值

　　2.2 sal b对epcs vegf,bfgf mrna表达的影响

　　sal b组vegf，bfgf mrna的表达量增加，与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。见表3。表3 两组vegf,bfgf mrna相对表达量的比较

　　2.3 sal b对epcs培养液sod,gshpx活性的影响

　　sal b组细胞培养液中sod活性增强，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05);而gshpx活性有增强趋势，但与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。见表4。表4 两组细胞培养液sod,gshpx活性的比较

　　3 讨 论

　　epc可在生理和病理状态下被招募到目的部位，通过血管生成和血管形成机制分化为血管内皮细胞，从而更新和修复衰老或受损的内皮细胞。在机体缺血、组织损伤和细胞因子(或药物)刺激下，epc可从骨髓向靶部位动员、分化及增生，形成新生血管〔3〕。外周血循环中epcs的数量与功能决定着损伤血管的内皮修复程度。

　　vegf刺激内皮增殖、增强血管通透性,bfgf刺激内皮细胞、smc和成纤维细胞增生,二者作为血管内皮细胞生长刺激因子,可以协同特异性地作用于血管内皮细胞,刺激其增殖,促进侧支血管的形成，从而改善组织器官的血液供应，对抗组织缺血〔4～6〕。在保护细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中,细胞内sod和gshpx等具有抗氧化酶的作用〔7〕。氧化应激能引起epcs数量减少和功能减弱。虽然epcs存在抗氧化酶系统,但是当细胞正常的氧化还原稳态失衡时,ros过度产生而聚积,引起氧化应激,使dna、蛋白质、碳水化合物和脂质等生物大分子被氧化,导致细胞的衰老和凋亡〔8〕。丹参是活血化瘀中药，具有活血通经功效，其主要水溶性成分sal b可促进恢复受损内皮的功能，在治疗心血管疾病等方面发挥着重要作用〔9〕。研究显示最佳药物浓度的sal b(8 μg/ml)作用于epcs提高了其分泌细胞因子vegf和bfgf mrna的表达，并且促进了细胞释放sod，gshpx，清除自由基能力增强，说明sal b具有抗氧化损伤的作用，对epc具有保护作用，增强其细胞功能的部分机制与此相关。同时该实验结果也可为体外扩增epcs而进行在体实验提供了依据。

【参考文献】
　1 袁 彬，何胜虎 内皮祖细胞移植治疗冠心病研究进展〔j〕.心血管病学进展，2009;30(1)：1314.

　　2 李庆雯，南亚昀，姜希娟，等.丹酚酸b对离体内皮祖细胞黏附、趋化和增殖的影响〔j〕.天津中医药大学学报，2009;28(1)：204.

　　3 余 毅，谢福安，周丽娜.内皮祖细胞在缺血性疾病中的研究进展〔j〕.世界临床药物 2009;30(5)：2926.

　　4 kalka c，tehrani h，laudenberg b，et gene transfer mobilizes endothelial progenitor cells in patients with inoperable coronary disease〔j〕.ann thorac surg，2005;70(3)：829.

　　5 buehler a，martire a，strohm c,et enesisindependent cardioprotection in fgf1 transgenic mice〔j〕.cardiovasc res，2002;55(4):76877.

　　6 hoffmann s，friedrichs u，eichler w,et ed glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation，matrix metalloproteinase2 and vegf upregulation in vitro〔j〕.graefes arch clin exp ophthalmol，2002;240(12):9961002.

　　7 王友明,王拥军.抗氧化剂与动脉粥样硬化形成的研究进展〔j〕.中国脑卒中杂志，2007;2(2)：15964.

　　8 papaharalambusca c,griendling mechanisms of oxidative stress and reactive oxygen species in cardiovascular injury〔j〕.trends cardiovasc med，2007;17(2):484.

　　9 范英昌，赵桂峰，张文治.丹酚酸b对大鼠心肌梗死过程中病理形态学的影响〔j〕.天津中医学院学报，2004;23(1)：124.