Pro 275 Ser纯合突变导致的Ⅱ型遗传性蛋白C缺陷症

摘要】 目的 对1例ⅱ型遗传性蛋白c(pc)缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用发色底物法和elisa测定血浆蛋白c活性和抗原。用pcr法对先证者proc基因的9个外显子及其侧翼序列进行扩增，pcr产物经割胶纯化后直接测序，检测其基因突变。家系成员dna在先证者proc基因突变区域扩增后测序。突变位点经限制性内切酶分析证实，并经105例健康体检者作对照以排除基因多态性。结果 先证者的蛋白c活性和抗原分别为5%和13.9%。proc基因测序分析发现先证者表现为外显子9区c12625t纯合错义突变，该突变引起编码的蛋白c pro 275 ser氨基酸替换。结论 pro 275 ser纯合突变是导致该例先证者ⅱ型遗传性pc缺陷症的分子机制，该突变为国际首报。

【关键词】 蛋白c; 缺陷; 基因突变

pro 275 ser homozygous mutation of proc gene causes type ii inherited protein c deficiency

　　wang jian1,dai jing 2,fu qihua1,wang xuefeng 2*,wang hongli3

　　(1department of clinical laboratory diagnosis, shanghai children’s medical center, shanghai jiaotong university school of medicine, shanghai; 2department of clinical transfusion, ruijin hospital, shanghai jiaotong university school of medicine;

　　3shanghai institute of hematology)

　　abstract： objective to identify the gene mutation of a pedigree with type ⅱ inherited protein c deficiency. methods the plasma levels of protein c activity (pc: a) and protein c antigen (pc: ag) were measured using chromogenic assay and elisa, respectively. all 9 exons and exonintron boundaries sequences of proc genes were amplified by pcr from the proband′s genomic dna, the amplified products were purified by gel extraction method and analyzed by direct sequencing. corresponding pcr fragments from the family members were also sequenced directly. restriction enzyme analysis was used to confirm the mutation. 100 and 5 healthy donors were used as controls to eliminate the polymorphism. results the plasma protein c activity and antigen of the proband were 5% and 13.9%, respectively. gene analysis revealed that the proband had a homozygous c12625t missense mutation in exon 9 of proc gene, which would cause the substitution of pro to ser at the 275 amino acid. conclusion the novel c12625t homozygous mutation in exon 9 of protein c gene leads to typeⅱinherited protein c deficiency.

　　key words： protein c; deficiency; gene mutation

　　蛋白c(protein c，pc)是人体抗凝系统的重要因子之一，主要由肝脏合成，是一依赖维生素k的丝氨酸蛋白酶原，与蛋白s(protein s, ps)、凝血酶调节蛋白(thrombomodulin, tm)和内皮细胞蛋白c受体(endothelial protein c receptor, epcr)等共同组成pc系统，在生理性抗凝过程中起重要作用。轻度缺乏是静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，vte)的主要危险因素，而pc重度缺乏，则将导致新生儿暴发性紫癜[1]。我们对1例遗传性pc缺陷症家系进行了基因突变检测,发现了1种国际上尚未报道的引起ⅱ型遗传性pc缺陷症的纯合子proc基因突变。

　　1 对象和方法

　　1.1 家系资料 先证者,男,19岁,来自瑞金医院门诊。于2008年6月，因出现无明显诱因的右下肢肿痛而就诊，经静脉造影和彩色多普勒诊断为右髂股静脉内血栓形成伴有部分阻塞;其母亲21岁初次怀孕时出现双下肢轻微疼痛，后23岁第2次怀孕时疼痛加剧，以左腿为甚。先证者父、母亲为近亲婚配, 家系其他成员无明显临床表现。家系图见图1。

　　图1 遗传性pc缺陷症家系图 (箭头所指为先证者)

　　1.2 血标本的采集、处理和dna 抽提 采集静脉血，0.109 mol/l枸橼酸钠1:9抗凝，立即于4℃ 2 000 r/min 离心15 min，分离乏血小板血浆，血浆分装后置于-80 ℃保存备用;血细胞用北京天根(tiangen)公司dna抽提试剂盒,按说明书操作抽提dna，-80℃保存待用。

　　1.3 抗凝因子活性和抗原检测 pc抗原(pc:ag )采用elisa法测定 (dako公司产品)。pc活性(pc:a)、抗凝血酶活性(at:a)测定采用发色底物法。蛋白s活性(ps:a)测定采用凝固法(均为dade公司产品)。acl top全自动血凝仪检测。

　　1.4 pcr pcr引物按文献[2]报道的序列由上海申能博彩生物技术有限公司合成。pcr 总反应体积25 μl，其中含1×pcr 缓冲液，终浓度为2 mmol/ l的mgcl2 ，终浓度为200 μmol/l的dntp，引物终浓度0.4 μmol/ l，模板dna约200 ng，taq dna 聚合酶(takara公司产品) 1.25 u;因外显子4～6 富含gc，故扩增时用la taq dna 聚合酶1.25 u 和gc 缓冲液i(takara公司产品)。先扩增先证者的proc基因各个外显子及侧翼序列，测序发现突变区域后，再扩增其他家系成员的相应片段。pcr反应条件如下：95℃变性5 min，然后95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30循环，72℃延伸10 min。pcr仪为pe9600 dna 扩增仪。

　　1.5 pcr 产物的纯化和测序分析 用3s spin琼脂糖凝胶dna纯化试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司)回收并纯化相应pcr 产物。基因测序采用末端标记双脱氧法, 测序仪为abi3700(美国应用生物系统公司)。

　　1.6 限制性内切酶分析 proc基因第9外显子区c12625t突变，将产生一个新的aasi酶切位点。先证者及其家系成员第9外显子扩增后，pcr产物用aasi 37℃酶切过夜。20 μl酶切体系含pcr扩增产物15 μl, aasi内切酶0.25 μl (2.5 u),10×缓冲液2 μl ,双蒸水2.75 μl。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。

　　 leiden突变和凝血酶原g20210a突变检测

　　为排除先证者存在fv leiden突变和凝血酶原g20210a突变，用引物fv f:5’ccattatttagccaggagacc3’,fv r:5’attggttccagcgaaagc3’进行扩增f5 exon10，扩增产物长386 bp;用引物f:5’tctagaaacagttgcctggc3’,r:5’tccagtagtattactggctc3’扩增凝血酶原基因3’utr,扩增产物长392 bp。pcr产物按上述方法割胶纯化后直接测序。

　　2 结 果

　　2.1 表型检测结果 先证者pc:ag和pc:a分别为13.9%和5%, 表现为ⅱ型pc缺陷症;其父亲、母亲和姐姐pc:ag和pc:a也均有不同程度的下降，其他家族成员中的舅舅和小姨的pc:ag和pc:a也下降。所有家系成员的pt、aptt、ps:a和at:a均正常。见表1。表1 pc缺陷症家系表型和基因检测结果注：“+/+”表示存在p275s纯合突变，“+/”表示存在p275s杂合突变，“/”表示不存在p275s突变。

　　2.2 proc基因分析 对先证者(ⅱ3)的proc基因所有9个外显子及侧翼序列pcr产物测序，结果发现在proc基因第9外显子区的第12625位有c→t纯合错义突变,导致编码氨基酸pro 275 ser替换。对该家系其他10名成员的proc基因第9外显子及侧翼序列pcr产物进行直接测序，有5名成员(ⅰ2、ⅰ3、ⅰ4、ⅰ7、ⅱ4)在该位点也存在相同的杂合突变。见图2。

　　图2 proc基因exon 9测序结果 注：a为先证者纯合错义突变，b为家系成员杂合错义突变，c为正常对照。

　　2.3 限制性酶切分析 正常人proc基因外显子9及侧翼的dna序列pcr产物由于没有aasⅰ酶切位点，aasⅰ酶切后只有753 bp一个条带。c12625t纯合突变pcr产物经aasⅰ酶切后产生535 bp和218 bp两个片段。杂合突变pcr产物经酶切产生753 bp 、535 bp和218 bp等3个片段。该家系中先证者(3)为2个片段,ⅰ2、ⅰ3、ⅰ4、ⅰ7和ⅱ4产生3个片段,其余5名成员的酶切结果均为1个片段见图3。105名正常人dna proc exon9扩增片段aasⅰ酶切结果仅见有753 bp片段，排除了c12625t变异为基因多态性的可能。

　　2.4 fv leiden突变和凝血酶原g20210a突变检测结果 先证者f5基因第10外显子和凝血酶原基因3’utr区测序结果显示，先证者不存在fv leiden突变和凝血酶原g20210a突变。

　　3 讨 论

　　遗传性pc缺陷症是由编码pc的基因(proc)突变所致，分2型：i型，最常见，由于pc合成减少或功能正常分子的稳定性降低导致pc活性和抗原平行降低;ⅱ型，由于异常pc分子的合成导致pc活性降低而抗原正常或前者较后者降低的更多。一般认为，遗传性pc缺陷症是显性遗传，但有部分患者外显不全，部分纯合和复合杂合pc缺陷患者表现为隐性遗传。人群中无症状杂合pc缺陷症的发病率为1/200～1/500，有症状杂合pc缺陷症的发病率为1/16 000～1/32 000。纯合或复合杂合proc基因突变通常会导致新生儿暴发性紫癜，患者出生后不久就会在微循环系统形成广泛血栓，病情凶险[3]。本研究中的先证者经检查临床诊断为vte，实验室检查pc:ag和pc:a均明显降低，且活性比抗原更低，而ps:a和at:a均正常，用溶栓和抗凝治疗病情好转，符合ⅱ型遗传性pc缺陷症。

　　编码pc的基因(proc)定位于2q1314，由9个外显子和8个内含子组成， mrna全长1795 bp，由蛋白编码区(exon 2～9)、5’端非翻译区(exon 1及exon 2中前21 bp)和3’端非翻译区(exon 9中后294 bp)组成[4]。目前在人类基因突变数据库中记录的pc基因突变共有236种，突变类型有单碱基替代、缺失/插入、剪接位点突变和启动子突变等，突变分布于pc基因各区域。通过对该家系的proc基因测序显示，先证者第9外显子区的第12625位有c→t纯合错义突变，导致编码的pc蛋白pro(ccc)275→ser(tcc)替换。先证者的父亲、母亲、姐姐、舅舅和小姨均为杂合突变，而其他家系成员为正常。进一步对105名正常人的proc基因第9外显子扩增产物酶切分析，排除了该变异为基因多态性的可能。通过对人类基因突变数据库和近期文献查询表明，该突变为国际首报。

　　肝脏合成的成熟pc由419个氨基酸组成，经蛋白酶解剪切去除lys 156arg 157二肽，形成由155个氨基酸组成的轻链和由262个氨基酸组成的重链，二者通过cys 141与cys 277间的二硫键相连。轻链的n端为含有9个羧化谷氨酸残基的gla结构域(1～45)，gla结构域通过两性螺旋(38～45)与两个表皮生长因子(egf)样结构域(46～91、92～136)相连;重链由激活肽(158～169)和催化结构域(185～419)组成[5]。通过基因分析发现，本例患者由于发生了纯合的点突变，使其编码的第275位脯氨酸完全被丝氨酸所替换。而p275位于pc蛋白结构的催化结构域，这一氨基酸的改变可能影响pc发挥抑制血栓形成的作用。pc纯合子突变患者非常罕见，且一般都于出生后不久即出现“新生儿暴发性紫癜”，纯合pc缺陷症的患者延迟发病的仅见于极少数报道。lind等[6]曾报道1例因d180g纯合pc突变的于21岁首次发生血栓症的病例，针对此纯合突变的体外研究显示，突变导致pc分子稳定性下降，引起胞内降解而分泌减少，由于患者血浆中尚存一定量活性正常的pc，从而推迟了血栓形成的时间。本例先证者于19岁才首次发生血栓症，而家系其他杂合子携带者，除母亲在怀孕时出现轻微症状外，均无任何临床症状出现。环境因素(如妊娠、外伤、服用避孕药、制动等) 和/ 或其它基因位点(如fⅱ、fⅴ、at、ps 等) 的突变也是导致遗传性pc缺陷症患者是否出现临床症状的关键[7]。但本例先证者为男性，其fⅴleiden突变(r506q)和凝血酶原g20210a突变检测均为阴性，且无制动和外伤等诱发血栓的环境因素。对于p275s所导致的pc结构和功能方面影响的进一步阐明，可能将解释该例患者延迟发生血栓的原因。

　　大量研究表明，pc除抑制血栓形成作用外，还可以通过epcr和蛋白酶激活受体1(par1)发挥多种细胞保护作用，包括：调控基因表达，抗炎，抗凋亡，稳定内皮屏障功能等[8]。早在2001年11月，fda即批准重组活化蛋白c临床试验。数项报道[9,]认为，重组活化蛋白c制剂可以显著减少重度脓毒症患者的死亡率，但是，同时也伴随着严重的出血并发症。因此，探寻具有细胞保护功能而缺乏抗凝功能的重组活化蛋白c制剂，正成为研究热点。美国scripps研究所griffin课题组[10]，曾对2个人工pc突变体(3k3aapc和 229/230apc)进行研究，发现其抗凝活性仅为野生型apc的4%～14%，而其抗凋亡活性分别为野生型apc的25倍和7倍，显示出了良好的应用前景。先证者p275位于pc蛋白结构的催化结构域，该突变是否只影响pc抗凝功能而保留其细胞保护功能有待进一步研究。如果该自然突变能够得到理想的结果，将对重组pc制剂的开发产生重要的意义，具有巨大的临床应用前景。

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