窒息法与室颤法复苏模型心脏损伤的比较策略研

 猝死一直是威胁人类健康及生命的主要疾病，直至今日心肺复苏成功率依旧很低，长期存活率更低于10%[1]。心搏骤停（cardiac arrest，CA）和心肺复苏过程中，机体经历严重缺血缺氧、酸中毒、电解质紊乱、缺血-再灌注和应激等一系列病理过程 [2]。许多患者在自主循环恢复（restoration of spontaneous circulation，ROSC）后，往往因心肌损伤使心脏和循环功能不能维持而发生低血压或休克，组织发生缺氧和代谢障碍，最终不能存活[3]。但多数对复苏后心功能的研究都着重于室颤所致的心功能不全[4-6]或复苏后早期心功能不全[7-9]，而窒息所致心搏骤停复苏后的心功能不全和复苏后中后期的心功能却较少有人研究。本研究采用动物模型模拟心源性（室颤法）及呼吸源性（窒息法）心搏骤停复苏后心脏损伤和修复的过程，通过心肌组织病理（HE染色）、心肌细胞线粒体呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）、心脏彩超检查评价及对比大鼠不同复苏模型在复苏后不同时期心肌的损伤和修复情况。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与试剂
　　 Spacelabs监护仪（美国太空公司）;Windaq数据采集系统及心功能分析软件（美国DATAQ公司）;YP200压力换能器（新航机电设备有限公司）;动物心肺复苏装置（中山大学心肺脑复苏研究所自行研制专利号：ZL2006 2 0063261.9）;除颤仪（美国卓尔医学产品）;Clark氧电极（汉莎科学仪器有限公司）;VEVO2100成像系统（加拿大 Visual Sonics Vevo 公司）;碧云天线粒体分离试剂（南京恩晶生物科技有限公司）;GMS10097纯化线粒体呼吸控制率定量检测试剂盒（广州展晨生物技术有限公司）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 动物模型
　　 动物模型在中山大学心肺脑复苏研究所病理生理实验室操作完成。体质量450～550 g SPF级雄性SD大鼠选自中山大学动物实验中心（许可证号：SCXK粤2011-0029），随机（随机数字法）分3个组：假手术组（sham）、窒息组（AS）和室颤组（VF）。而后两组按复苏后取材时间进一步随机分为3个亚组，分别为AS-4 h、AS-24 h、AS-72 h、VF-4 h、VF-24 h、VF-72 h，每组5只。术前禁食一晚。麻醉使用戊巴比妥45 mg/kg腹腔内注射。大鼠备皮后仰卧固定于操作板上。由口腔置入气管导管14 G静脉留置针套管（雅培公司）。23G PE-50管置入左侧股动脉用于监测动脉压，所有的导管均充满5 U/mL肝素盐水并通过压力传感器与数据采集卡连接实时记录数据电脑存盘。4F硬质导管由右侧颈静脉置入右心室用于致颤。左下肢、双上肢插入导电针用于监测心电图。待大鼠麻醉清醒后进行复苏（假手术组仅进行以上操作，不复苏）。按压呼吸比为250∶50，潮气量0.6 mL/100 g，氧体积分数80%，待ROSC后氧体积分数降为21%。自主心率恢复、舒张压升高至60 mmHg以上定义为ROSC（1 mmHg=0.133 kPa）。
　　 窒息法动物模型：经左股动脉予维库溴铵（VK 2 mg/mL）0.25 mL，30 s后若大鼠仍有自主呼吸，则堵塞气管导管，约5 min后平均动脉压可降至20 mmHg以下，开始心搏骤停计时，8 min后予胸外按压（chest compression，CC），按压前予机械通气，按压2 min时予肾上腺素（Ep 0.1 mg/mL）0.1 mL，继续按压，若有室颤则予4 J能量除颤，连续除颤3次，若无反应则继续按压2 min再予肾上腺素0.1 mL，继续按压2 min，若无ROSC则视为复苏失败。
　　 室颤法动物模型：从右侧颈动脉导管置入导丝至右心室，予3 mA电流致颤（VF），心搏骤停8 min后予按压，按压前机械通气，按压5 min予肾上腺素（Ep 0.1 mg/mL）0.1 mL，按压6 min出现室颤粗波以4 J能量除颤，连续除颤3次无效，继续按压30 s后再次予Ep 0.1 mg/mL 肾上腺素0.1 mL，1 min后除颤，连续除颤3次无ROSC则复苏失败。
　　1.3 检测方法
　　大鼠复苏后4、24、72 h分别行心脏彩超检查，比较不同时期心脏功能如左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）大小、舒张期左室前壁厚度（left ventricular anterior wall diameter，LVAWd），并比较窒息组及室颤组在同一时期的心功能。戊巴比妥麻醉大鼠后取心脏，部分心脏组织用4%甲醛溶液固定，HE染色做病理切片了解两个组不同时间点心脏微观结构的差异，通过心肌溶解、水肿、坏死程度等评价心肌损伤情况;部分心肌组织采用碧云天线粒体分离试剂提取心肌线粒体，通过Clark氧电极行线粒体RCR检测。
　　1.4 统计学方法
　　 所有统计方法均用SPSS 19软件进行，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，并在组间差异具有统计学意义的，采用LSD-t检验进一步分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　 窒息组大鼠复苏成功率80%（16/20），其中1只死于ROSC 24 h之后，室颤组大鼠复苏成功率75%（15/20），两组的复苏成功率差异无统计学意义（χ2=0.143，P=0.705）。
　2.1 HE染色结果
　　 4 h时HE染色图片两组均可见心肌细胞肿胀、充血，部分细胞坏死、肌溶解，其中窒息组充血肿胀更明显，而室颤组较窒息组肌溶解更明显;72 h实验组肌纤维对比假手术组增粗，心肌排列紊乱、疏松，并有少许炎症细胞浸润。见图1。
　　A：窒息组4 h（箭头示心肌细胞充血肿胀）;B：窒息组72 h;C：假手术组;D：室颤组4 h（箭头示肌溶解）;E：室颤组72 h
　　图1 各组心肌HE染色图片（×200）
　　 Fig 1 HE stains of myocardium in each group （×200）
　　2.2 线粒体呼吸功能（RCR）的比较
　　如表1所示，窒息组4 h RCR、24 h、72 h与假手术组间差异无统计学意义 （F=5.197，P=0.073）;室颤组内各时间点不全相同，差异有统计学意义（F=24.619，P=0.005），4 h RCR与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=5.042，P=0.033），24 h与假手术组间差异无统计学意义（LSD-t=1.219，P=0.101），72 h组与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=4.548，P=0.041）。
　　表1 各组RCR、EF、LVAWd的比较（x±s）
　　Table 1 Comparison of RCR， EF， LVAWd among groups in different periods（x±s）
　　 指标 ROSC 4 h ROSC 24 h ROSC 72 h
　　线粒体呼吸功能（RCR）
　　假手术组 3.37±0.11 — —
　　窒息组 2.79±0.19 3.49±0.41 3.61 ±0.30
　　室颤组 2.52±0.36a 3.90±0.27 4.39±0.27a
　　左室射血分数（EF，%）
　　假手术组 69.47±1.56 — —
　　窒息组 42.16±2.72bc 62.58±3.37b 79.14±3.42b
　　室颤组 29.68±1.60ac 64.49±6.78 77.00±2.82a
　　舒张期左室前壁厚度
　　（LVAWd，mm）
　　假手术组 1.72±0.58 — —
　　窒息组 1.51±0.82 2.14±0.16 2.61±0.29b
　　室颤组 2.10±0.07 2.14±0.18 2.41±0.24a
　　 注：室颤组与假手术组比较，aP<0.05;窒息组与假手术组比较，bP<0.05;窒息组与室颤组比较，cP<0.05
　　2.3 心脏彩超的比较
　　不同组不同时期心脏彩超如图2所示。
　　A：窒息组4 h;B：窒息组24 h;C：窒息组72 h;D：室颤组4 h;E：室颤组24 h;F：室颤组72 h;G：假手术组
　　图2 各组心脏彩超图片
　　Fig 2 The echocardiography of each groups
　　 如表1所示，EF（%）窒息组不同时间点不全相同，4 h与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=17.630，P<0.01），24 h与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=4.450，P=0.048），72 h与假手术组间差异有统计学意义（LSD-t=6.242，P=0.017）;室颤组不同时间点EF不全相同，4 h与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=25.099，P<0.01），24 h与假手术组差异无统计学意义（LSD-t=1.989，P=0.118），72 h与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=4.748，P=0.040）;窒息组与室颤组4 h组间差异有统计学意义（t=5.584，P=0.031），而两组24 h组间（t=0.421，P=0.695）、72 h组间差异无统计学意义（t=1.016，P=0.399）。
　　舒张期LVAWd（mm）窒息组不同时间点不全相同，其中4 h、24 h与假手术组差异无统计学意义，72 h与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=8.062，P=0.007），72 h与4 h差异有统计学意义（LSD-t=9.978，P=0.003）;而室颤组不同时间点LVAWd不全相同，其中72 h与假手术组差异有统计学意义（LSD-t=6.682，P=0.013），4 h与72 h差异有统计学意义（LSD-t=3.027，P=0.049），其余4 h、24 h、假手术组差异无统计学意义;舒张期左室前壁厚度窒息组与室颤组在相同时间点差异无统计学意义，见表1。
　　3 讨论
　　3.1 复苏后早期不同模型心脏损伤和功能变化
　　本研究心肌组织HE染色图片可观察到4 h时室颤及窒息模型都有心肌损伤，室颤组肌溶解明显。线粒体是细胞能量代谢的场所，再灌注期线粒体氧化磷酸化功能异常，产生大量活性氧，损伤线粒体呼吸链结构，使线粒体氧化磷酸化功能下降，导致暂时性的心功能恶化。
　3.2 复苏中后期不同模型心脏损伤的修复和
　　功能的变化
　　随着生存时间的延长，两种模型的心功能均有所恢复，并且室颤组的EF较窒息组的更早恢复，这一结果亦支持室颤模型发生心肌顿抑的假设，同时窒息模型的缺氧时间较室颤模型长，心肌弥漫性损伤及超微结构损伤可能较室颤模型严重[7， 9， 12]，导致心肌的损伤修复过程更长，因此心功能恢复更慢。
　　在后期，两种复苏模型心脏大体可见心肌向心性肥厚，光镜下所见的心肌细胞排列紊乱，同时心脏彩超也显示模型组在恢复期左室前壁厚度增加，提示无论是心源性还是呼吸源性心搏骤停复苏成功后，均存在心肌细胞损伤、心肌重构的可能。室颤组在72 h心脏射血分数及线粒体呼吸功能均较对照组增强，窒息组72 h心脏射血分数较假手术组增加，结合实验组左室前壁厚度增加，均提示恢复期（24～72 h）处于心肌重构代偿期，这也与心肌重构在代偿期有改善心功能的作用[13]的情况相符。心肌重构的过程中心肌细胞由正常心肌细胞向胎儿类型心肌细胞转化，这种心肌细胞能耗低，肌肉最大缩短速度和张力发展速度缓慢，不能满足长期高效工作需要，最后导致心肌收缩功能下降[14]。心力衰竭是各种心脏病的临床终末阶段，20世纪90年中期开始认识到导致慢性心衰的共同的病理生理基础是心肌重构[13]。
　　美国心脏学会估计如果能成功治疗复苏后心肌功能不全，每年可拯救2.5万人的生命[15]，2005年国际复苏指南强调了复苏中和复苏后心肌保护的重要性。与复苏后大鼠模型相似，心肺复苏成功的患者在复苏后早期心功能不全所造成的血流动力学状态不稳定及休克和心律失常，可导致患者继续处于血流灌注不稳定、器官组织持续缺血缺氧的情况，促发多脏器功能不全，使复苏最终失败[16];即使在生命体征平稳后患者的心脏缺血损伤坏死等仍可能引起心肌重构，即患者将面临慢性心力衰竭的发生，再次的威胁生命。研究证实早期药物干预中断重构进程，能延缓或防止心功能不全继续恶化，提高患者存活率[14];那么是否在心肌损伤恢复期中断心肌重构，亦可以改善复苏后患者远期的心功能预后？
　　本研究的结果提示，室颤模型在早期心肌损伤较窒息模型严重;中间期两种模型均有所恢复，且室颤组较窒息组更早恢复;后期两组均出现代偿性心肌肥厚，心功能差异无统计学意义。
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