全基因组扩增应用于胚胎植入前遗传学诊断

　　植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是指借助显微操作技术对具有高遗传病风险夫妇，从其体外受精培养得到的胚胎中取出个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞进行遗传学检查，通过分析选择正常的胚胎移植，可以防止遗传学异常妊娠的发生，将产前诊断提前到胚胎植入子宫内膜之前。避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。但由于可用于PGD分析的材料为胚胎中取出的个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞，这些材料十分有限，所以在进行PGD之前，需对单细胞进行全基因组扩增(whole genome ampliflication，WGA)，全基因组扩增一组在基因组DNA数量极有限情况下对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量，对进行疾病诊断的组织或单个细胞的基因组进行大量扩增，使得后续分析的模板量增加，从而完成多位点、多基因的检测研究。该技术能很好的解决PGD的标本少和准确性要求高等要求。本文介绍了WGA方法中PEP、DOP-PCR、MDA应用于PGD的情况，分析了MDA方法的优势与不足。

　　1 引言

　　伴随着人类辅助生殖技术的发展，特别是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及单精子胞浆内显微注射(ICSI)的广泛应用，使得越来越多的不育患者实现了生育下一代的愿望，但随之而来的遗传病的患病风险也明显增加[1]，而胚胎植入前遗传学诊断却能有效地降低后代患遗传病的风险，故胚胎植入前遗传学诊断将成为临床检验的重要手段。

　　胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是指借助显微操作技术对具有高遗传病风险夫妇，从其体外受精培养得到的胚胎中取出个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞进行遗传学检查，通过分析选择正常的胚胎移植，可以防止遗传学异常妊娠的发生，将产前诊断提前到胚胎植入子宫内膜之前。该技术包括体外受精胚胎移植(in vitro fertilizatio-and embryo transfer， IVF-ET)的临床手段，聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybrid dization， FISH)等检测技术。

　　全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)是一组在基因组DNA数量极有限情况下对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量，对进行疾病诊断的组织或单个细胞的基因组进行大量扩增，使得后续分析的模板量增加，从而完成多位点、多基因的检测研究。该技术现已应用于法医学、疾病基因研究、产前诊断等领域。近年在胚胎植入前遗传学诊断中的应用也受到关注[2]。

　　2 全基因组扩增(WGA)的方法

　　聚合酶链反应(PCR)技术的产生和发展极大得推进了微量DNA样本的分析，但由于许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PCR反应。为了能从极少量细胞中最大限度的获取信息，需要用全基因组扩增技术(WGA)将原始DNA序列放大。

　　WGA技术如今已经发展形成以PCR为基础的PEP和DOP-PCR技术和不以PCR为基础使用随机引物恒温扩增的多重置换扩增技术(multiple displacement amplification，MDA)。

　　2.1 PEP和DOP-PCR技术

　　引物延伸预扩增(Primer extension preamplification，PEP)用到的是PCR技术、Taq酶和由15个碱基的随机寡聚核苷酸组合出415种不同序列的引物，其变性后在37℃条件下低温退火，然后缓慢升至55℃延伸，随机扩增基因组DNA，扩增产物覆盖接近基因组96%区域，同时放大1000倍[3]，PEP后续采用巢式PCR或以其终产物为模板，使用特异的引物序列进行扩增，从而到达检测的目的。普通PEP的总反应时间需经历14h，其较长时间的反应周期阻碍了其在临床PGD检测中的应用。在改善普通PEP的反应体系以及热循环条件后，其反应时间缩短至5.5h[4]，虽然反应时间缩短，但改良后的PEP仍然保持着原有扩增效率，甚至提高了扩增的特异性，其命名为改良的引物延伸反应预扩增(improve-PEP，I-PEP)。2003年Jiao等[5]应用PEP结合巢式PCR技术及反向点杂交技术(RDB)的方案，对β-地中海贫血携带者行PGD，成功出生了健康的小孩。然而，普通PEP扩增产物的长度达不到1500bp，较低的扩增率、产生片段的过短成为PEP技术在PGD中广泛应用的最主要障碍。

　　另一种WGA方法是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)，其操作相对PEP更简单，采用部分简并寡核苷酸引物，这些引物会结合于整个基因组序列，在低退火温度运行几个循环扩增，让引物充分与基因组DNA结合，随后提高退火温度进行更特异的扩增。DOP-PCR能将DNA模板能从开始时的15pg增至400ng，且能按比例均匀扩增整个基因组DNA[6] 。但和PEP一样，DOP-PCR只能扩增出相对较短的产物，2002年Kittle等[7]将其改良，其使用核酸外切酶矫正DNA聚合酶的活性，增加DOP-PCR退火和延伸的时间，其结果是扩增产物长度由原来0.5kb增至10kb，更好地覆盖了微随体区域和单拷贝序列。

　　2.2 多重置换扩增(MDA)技术

　　MDA技术是目前最受关注的WGA技术，不同于以PCR为基础的PEP和DOP-PCR技术存在扩增产物过短、偏性扩增明显等缺点，该技术是不需以PCR为基础的具有更高扩增效率、更广覆盖域及更高保真度的新的扩增技术。

　　MDA是一种基于链置换和环状滚动扩增的全基因组扩增技术。该技术利用一种φ29 DNA聚合酶催化六聚体随机引物对基因组进行扩增，其反应条件为在30℃下恒温。扩增时，六聚体随机引物在多个位点与模板DNA退火，在φ29 DNA聚合酶的作用下同时启动复制。引物沿着模板链延长，同时取代模板的互补链。被置换的互补链又作为新的模板完成一次扩增，经过长时间的循环，最终经过65℃灭活可获得大量的DNA。该技术适用于各种样本，低DNA含量的样本，尤其是在临床应用中常出现的单细胞取材，如单个淋巴细胞、单个精子、单个滋养层细胞或卵裂球等。也可直接从新鲜或干燥的全血、白膜层和培养的细胞等进行扩增，也可是石蜡包埋的样品，但效果较差[8]。

　　在临床应用中，MDA表现出高扩增效率和精确性，相较于以PCR基础的WGA方法，MDA表现出显著的优势。2009年Ren等[9]通过MDA技术扩增单细胞基因组DNA完成两家DMD临床PGD实验，每个家系均分析了一个DMD基因的突变位点和6个STR连锁标记，最后各出生一个健康的女孩。2010年Eduardo等[10]用MDA技术结合PCR-连锁分析完成了1家PKHD1家系的临床PCR实验，他们共分析了20个PKHD1基因及其侧翼序列中的STR位点，最终出生了一个健康孩子。

　　2.2.1 MDA技术的优点

　　首先是其持续合成能力，MDA方法比以PCR为基础的扩增方法扩增效率更高，可将微量模版扩大数千倍以上。φ29DNA聚合酶的合成力极强且持续时间长，产物片段平均长度可大于10kb。而在PCR反应中，反复的变性和退火约40个循环左右，DNA扩增即进入平台期，MDA因为其反应全程恒温，其酶活性能持续长达16小时，从而可产生足够量的DNA来完成PGD及STR位点的检测[11]。第二，MDA方法的脱扣率较以往PCR基础的扩增方法进行WGA低。在微卫星基因座上滑脱是的WGA一个大问题，φ29DNA聚合酶从理论上讲能减少微卫星在基因座上的滑脱率。第三，MDA方法的高保真性，φ29DNA聚合酶具有外切酶活性，可均匀扩增DNA而不出现扩增偏差，其错配率仅为1：106 ～1：107，而TaqDNA酶的错配率3：104[13]，相较之下φ29DNA聚合酶可保证扩增效果。第四，无论MDA扩增起始浓度差异多大，其终浓度稳定，基因组DNA经过30℃反应6～8h，扩增在达到高峰后维持于一个稳定水平使所有反应的DNA产量保持在20～30μg左右。

　　2.2.2 MDA技术的不足

　　MDA目前仍然存在一些不足，2005年Sun等[15]综合比较了I-PEP、MDA方法的优缺点，结果提示MDA方法扩增效率大于I-PEP方法，但特异性较I-PEP差，片段大小差别大，在一些微卫星位点分型时，可能会发生脱扣。MDA反应灵敏度极高，起始模板量少故极易污染，若用单个细胞做PGD，污染问题将会更加突出。污染物与待检测模板竞争扩增，经PCR放大后极大影响了诊断的准确性。

　　3 单细胞WGA扩增后续分析技术

　　3.1 单体型分析

　　胚胎植入前单体型分析(Preimplantation genetic haplotyping，PGH)是PGD中一个新的方法，是利用短串联重复序列(STR)在DNA复制过程中会发生一个或几个单位的重复或缺失的特点，在人群重复次数会出现特异且符合孟德尔遗传定律的原理，进行家系分析确定携带突变的染色体的简易诊断的手段，其最大的优势是能发现任何单基因病甚至已确定的缺失。但是需要在进行PGH分析之前仔细研究至少有一个患者的家系中并找到一些能用于携带者的连锁标记。2006年Renwick等[16]成功用MDA产物通过PGH方法应用于囊性纤维变性和DMD并使受孕。

　　现在，PGH应用了将荧光标记在PCR扩增引物上的荧光PCR，并通过荧光电泳进行单体型分析，大大缩短了PGH的时间，作为一种代替诊断的方法，PGH增加了PGD诊断的范围和可用性。

　　3.2 SNP分型

　　单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism，SNPs)是占人类基因突变的很大比例并会增加人类患病风险的单核苷酸改变。但SNP关联分析需要足量的基因组DNA，WGA使之成为可能。WGA之后的SNP分析不仅提供了一种可靠的评估DNA产品的方法，同时在探究染色体畸变实验中也呈现出高精确性和可重复性，2009年ling等[17]通过MDA结合SNP分析的方案成功发现了产生了单体和三体的染色体数目畸变。WGA结合SNP方案尚处在发展的初级阶段，以后的发展不可估量。

　　4 总结

　　PGD中可获得的细胞数量、DNA都极其有限。进行PGD分析需要大量反映原始遗传信息的DNA，WGA用于PGD基因分析令人鼓舞，其恰好解决了这种单细胞扩增的问题且临床检测技术使用正不断发展。尤其是MDA技术打开了需要大量DNA的多重检测之门，使后续各种DNA分析技术得以开展，现在也成最主要的WGA技术。WGA后续的操作如PGH、SNPs等将PGD适用的范围扩大。尽管不同的WGA方法都有其优势与不足，未来的发展将不断改善，比如如何减少甚至避免小量标本的扩增假象、如何减少扩增中出现的偏向扩增和等位基因脱扣、如何避免污染等问题。WGA为PGD的效率、可操作性等方面带来了光明前景，可以想象在不远的将来WGA极有希望成为PGD重要而不可缺少的组成部分。

　　作者：杨超 钟昌高 来源：药物与人 2014年2期