格列美脲对高糖环境下大鼠下颌骨成骨细胞葡萄

要求种植牙的糖尿病患者，常由于异常的高血糖状态大大降低了种植牙的成功率。因此，有效地控制血糖成为糖尿病患者牙种植治疗的关键。高糖环境除了影响细胞的增殖分化，也影响葡萄糖转运过程。在多种细胞中，高糖环境降低了细胞的糖摄取能力[1-4]。在葡萄糖代谢过程中，葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，GLUT）的表达和调控起了重要的作用。研究[5-6]表明成骨样细胞表达GLUT-1、3。胰岛素能够调节GLUT的功能，它通过和高亲和的胰岛素受体结合，调节前成骨细胞GLUT-1的表达，增加成骨细胞的糖摄取和碱性磷酸酶（alkaline phos-phatase，ALP）活性[7]，Qutob等[6]研究了具有成骨细胞特征的UMR-106细胞系，发现胰岛素能够通过GLUT-1、3调控葡萄糖的吸收。
　　格列美脲是在临床广泛应用的第3代磺脲类降糖药，它不仅能作用于胰岛β细胞，也能作用于机体的其他细胞[8-10]，产生一系列的类胰岛素信号样作用[9-10]，并且能够上调大鼠脂肪细胞和骨骼肌细胞GLUT-1、4的表达[8-10]。但其对成骨细胞的作用及成骨细胞葡萄糖摄取的影响还不清楚。本研究采用原代培养的大鼠下颌骨成骨细胞，观察格列美脲对高糖环境下大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取及GLUT-1、3表达的影响，为糖尿病种植牙患者降糖药物的选择提供参考。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　4～8周龄SD大鼠（军事医学科学院动物中心提供），L-DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），胰蛋白酶（Amresco 公司，美国），格列美脲标准品、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl te-trazolium，MTT）（Sigma公司，美国），兔抗大鼠GLUT-1抗体（sc7903）（Santa Cruz公司，美国），兔抗大鼠GLUT-3抗体（ab41525）（Abcam公司，美国），氟-18标记的脱氧葡萄糖（18F-deoxyglucose，18F-FDG）（中国人民解放军总医院PET中心）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 大鼠下颌骨成骨细胞的分离培养及鉴定 取4～6周龄的成年SD大鼠，颈拉断处死后，在75%乙醇中浸泡5 min，无菌取出带有肌肉和筋膜的下颌骨，置于75%乙醇中洗5～10 s后，在5.25%NaClO中浸泡1 min，用PBS冲洗3次，完全剥离肌肉和筋膜，拔除牙齿，将下颌骨用咬骨钳剪碎成2 mm×2 mm的骨片后，PBS缓冲液反复冲洗至骨碎块呈白色，将其置入小培养瓶中，再加0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶的混合液[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临]（1∶1），在水浴振荡器中37 ℃、140 r·min-1消化8 min。消化6次后终止，收集第2～5次消化液，经200目不锈钢筛网过滤并离心，去除上清后用含20%胎牛血清的L-DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养40 min，差速贴壁，纯化成骨细胞。经酶消化后的组织块，再次剪碎至1 mm×1 mm，铺于培养瓶中倒置培养，4 h后翻瓶，待细胞长满传代。取状态良好的第3代细胞用于实验。采用ALP染色、细胞矿化结节染色、细胞Ⅰ型胶原（collagenⅠ，Col Ⅰ）免疫组化染色和骨钙素（osteocalcin，OCN）免疫荧光染色法对细胞进行成骨细胞鉴定。
　　1.2.2 实验分组 将成骨细胞以每毫升1×105个接种于35 mm平皿中（n=6），每孔加液量为2 mL，细胞生长至融合后，无血清培养基孵育24 h，分别予以5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖处理细胞，持续24 h，加入10 ?mol·L-1 格列美脲干预120 min，然后进行葡萄糖摄取实验。实验分组：5.5 mmol·L-1组（生理浓度葡萄糖，对照组）、5.5 mmol·L-1+格列美脲组、16.5 mmol·L-1组（高浓度葡萄糖）、16.5 mmol·L-1+格列美脲组。
　　1.2.3 葡萄糖摄取的测定 培养结束后，弃去培养基，用温PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含7.5 μCi·mL-1 18F-FDG的PBS，37 ℃孵育30 min，用预冷的PBS冲洗6遍，加入1 mL PBS刮取细胞，收集细胞悬液，用共形γ计数器测定总放射性计数。用总放射性计数与蛋白质浓度的比值，反应细胞葡萄糖摄取能力。
　　1.2.4 GLUT-1和GLUT-3免疫细胞化学染色 将第4代成骨细胞接种在盖玻片上，培养7 d后用95%乙醇固定，PBS洗涤，加兔抗大鼠GLUT-1、3（1︰100），保湿，4 ℃过夜；PBS洗涤，加生物素化羊抗兔二抗，PBS洗涤；DAB显色，苏木素复染，封片。
　　1.2.5 Western blot检测GLUT-1、3的表达 将成骨细胞以每毫升1×105个接种于25 cm2培养瓶中，细胞生长至融合后，无血清培养基孵育24 h，分别予以5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖处理细胞，持续24 h，然后加入10 ?mol·L-1格列美脲干预120 min，实验分组同葡萄糖摄取测定实验，Western blot实验用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sul-fate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶，300 mA恒流电转移80 min，加兔抗大鼠GLUT-1（1︰2 000稀释）、GLUT-3 抗体（1︰1 000稀释）37 ℃孵育4 h，洗膜后，经辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1︰4 000稀释）孵育50 min，化学发光法显示抗原抗体复合物，X线片显影并定影，采用Labworks4.5成像分析仪系统测定所有杂交信号条带密度，用蛋白目的条带水平与β-actin的比值表示。以上实验至少重复3次。
　　1.3 统计[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临]学处理
　　采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，对各组结果进行方差分析和t检验，P<0.05为差异有显著性。
　　2 结果
　　2.1 原代细胞及传代细胞的形态学观察
　　在倒置显微镜下，组织块上酶消化下的细胞经差速贴壁后，24 h培养可贴壁，细胞呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态（图1A）。连续组织块法分离成骨细胞培养第5天可见成骨细胞自骨碎片移出，向周围呈无序生长（图1B），传代细胞在4 h内贴壁，展开的细胞呈长梭形、鳞片形、多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，轮廓清晰，可见1～3个核仁。细胞长满瓶底时，多呈梭形或立方形，排列紧密，生长突相互连接（图1C）。随着培养时间的延长，成骨细胞可呈重叠生长。
　　2.2 成骨细胞的鉴定
　　光镜下，ALP 染色可见细胞质内有红棕色颗粒或块状颗粒（图2A）；ColⅠ表达均呈阳性，蛋白染色主要位于细胞质，表达量丰富（图2B）；长期培养，细胞复层生长逐渐形成小结，随着胶原 堆积和钙盐沉积，最后形成不透光的矿化结节，经茜素红染色呈红色块状沉淀（图2C）；OCN免疫荧光染色结果显示，细胞呈阳性反应，细胞质OCN染成绿色（图2D）。
　　2.3 格列美脲对成骨细胞葡萄糖摄取的影响
　　在5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖作用下，成骨细胞的葡萄糖摄取量分别为1.00±0.06、0.88±0.04。与
　　5.5 mmol·L-1葡萄糖相比，16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度下成骨细胞的糖摄取能力降低了11.67%（P<0.05）。加入格列美脲后，在5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖作用下，成骨细胞的葡萄糖摄取量分别为1.35±0.05、1.10±0.06。格列美脲能够明显提高5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度下成骨细胞的糖摄取能力，分别提高了34.68%和25.17%（P<0.05）。
　　2.4 GLUT-1和GLUT-3的免疫化学染色
　　免疫化学染色结果显示GLUT-1、3在不同浓度葡萄糖培养下的成骨细胞中表达均呈阳性，蛋白主要位于细胞质，表达量丰富（图3、4）。
　　2.5 格列美脲对成骨细胞GLUT-1和GLUT-3的影响
　　与5.5 mmol·L-1葡萄糖相比，16.5 mmol·L-1葡萄糖增加了成骨细胞GLUT-1蛋白的表达（P<0.05）。格列美脲能明显提高5.5和16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度下GLUT-1蛋白的表达（P<0.05）（图5）。
　　3 讨论
　　在要求种植牙的患者中，糖尿病患者占有一定的比例。随着糖尿病的发病率逐渐增加，这部分患者的比例也在增加。在糖尿病患者中，异常的高糖状态可以引起骨量减少或者骨质疏松，是种植牙失败的一个重要原因[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临][11]。在这一病理过程中，成骨细胞扮演重要的角色。高糖环境除了影响细胞的增殖分化，也影响葡萄糖摄取过程。对于胰岛细胞[1]、血管平滑肌细胞[2]、绒毛膜细胞[3]、肾小管细胞[4]，高糖环境均可降低了细胞的糖摄取能力。笔者观察了120 min时成骨细胞糖摄取的变化，发现高糖环境下成骨细胞的糖摄取要显著低于低糖环境。
　　葡萄糖是维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，葡萄糖是一种极性分子，不能以自由扩散的方式通过细胞膜脂双层结构的疏水区，除了小肠和肾小管可以通过主动运输方式吸收葡萄糖外，其他组织的细胞都必须通过细胞膜上的GLUT来摄入葡萄糖。GLUT是一类镶嵌在细胞膜上转运的载体蛋白质，它广泛分布于体内各组织。根据转运葡萄糖的方式分为两类，一类是钠依赖的葡萄糖转运蛋白（sodium rely on glucose transporters，SGLT），以主动方式逆浓度梯度转运葡萄糖；另一类为易化扩散的GLUT，以易化扩散的方式顺浓度梯度转运葡萄糖，其转运过程不消耗能量。易化扩散的GLUT是由至少13种膜蛋白组成的一个蛋白质家族。研究发现，成骨细胞样UMR-106细胞系[12]和关节软骨细胞[13]中表达GLUT-1、3，本研究证实大鼠成骨细胞也表达GLUT-1、3。
GLUT-1是已知分布最广的转运体，其高效表达于人类红细胞、脑、眼、周围神经及胎盘等组织中，维持基础状态下组织的葡萄糖摄入。GLUT-3和GLUT-1一样在很多细胞中都有表达，但以脑组织中分布最多。GLUT-3也是具有高亲和力的高效转运蛋白，Km值极低，对于不能储存糖原却又对葡萄糖有很高需要量的组织来说，GLUT-3便成为理想的葡萄糖运载体[14]。
　　研究[15-16]发现高糖环境可以影响GLUT-1的表达，但结论不统一。据报道高糖可以促进肾小球系膜细胞和视网膜内皮细胞GLUT-1的表达，却降低绒毛膜细胞和肾小管细胞GLUT-l的表达[3-4]。研究[17]发现，高糖环境提高了成骨细胞GLUT-1蛋白的表达。笔者的研究结果也证实高糖环境上调成骨细胞GLUT-1蛋白的表达。有研究[18]表明细胞外糖浓度升高导致渗透压的改变，引起系膜细胞的GLUT-1表达的升高。因此，葡萄糖浓度的改变，导致渗透压改变是成骨细胞GLUT-1表达升高的重要原因。笔者也发现在高糖环境中，成骨细胞GLUT-3的表达是轻微下调的，这与其他研究[18]结果一致，即高糖环境导致视网膜内皮细胞GLUT-3的下降。GLUT-3是高效转运蛋白，它的转运效率是GLUT-1的3倍，本实验中总的糖摄取是下降的，原因可能是高糖环境下GLUT-3的轻微下调，就能影响成骨细胞糖摄取的改变。
　　胰岛素能促进UMR-106细胞和关节软骨细胞GLUT-1、3的表达，也能促进成骨样细胞的糖摄取增加[12-13]。而格列美脲不仅能作用于胰岛β细胞，也能作用于机体的其他细胞[8-10]，产生一系列的类胰岛素信号样作用[9-10]。它能够上调大鼠的脂肪细胞和骨骼肌细胞GLUT-1、4的表达[9-10]。本研究结果证实格列美脲在2种糖浓度下提高了成骨细胞糖摄取，并且上调了GLUT-1、3的蛋白表达。结果提示格列美脲在成骨细胞也可[第一论文网专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临]能发挥类胰岛素样所用。格列美脲对成骨细胞GLUT-1、3蛋白的促进作用受到了16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度的抑制，这说明高糖环境降低了格列美脲促进成骨细胞GLUT-1、3蛋白表达的敏感性。笔者前期研究已经证实格列美脲能够促进大鼠下颌骨成骨细胞的增殖分化和矿化[19]，葡萄糖作为维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，推测格列美脲对糖摄取的影响可能发挥了相关的作用，其相关性还待进一步研究。
　　[参考文献]
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 本文选自《华西口腔医学杂志》2014年第2期，版权归原作者和期刊所有。