寄生虫检测研究现状论文

人兽共患病(zoonosis)主要由细菌、病毒和寄生虫这三大病原生物引起，有记载的人兽共患病约200种。我们将在人与脊椎动物之间自然传播的寄生虫病和寄生虫感染称为人兽共患寄生虫病(communicable parasitosis common to man and animal,CPCMA), 至今已报道70多种，在人兽共患病中占重要地位。其病原包括原虫、蠕虫和节肢动物中能钻入或进入宿主皮肤或体内寄生的种类共120多种〔1,2〕。随着世界经济的发展和人们生活水平的提高，在发达国家和发展中国家先后掀起了宠物热。我国近十年来，宠物业在全国迅猛发展，犬、猫、鱼、鸟等已进入百姓家庭。宠物，特别是与人关系最密切的犬、猫的饲养，既使人们的生活增添了乐趣，又给人类健康带来了威胁。它使宠物市场出现了前所未有的商机，也给人兽共患寄生虫病的防治带来了严峻挑战。为此，本文就宠物(犬、猫) CPCMA及其疫苗防治研究现状作一综述。1 宠物(犬、猫)人兽共患寄生虫病 主要种类 经文献检索，有记载的犬、猫人兽共患寄生虫病至少有39种，约占CPCMA的56%，其中原虫病9种(内脏利什曼病、皮肤利什曼病、皮肤黏膜利什曼病、肺孢子虫病、弓形虫病、非洲锥虫病、克氏锥虫病、等孢球虫病、贾第虫病)、吸虫病8种（血吸虫病、华支睾吸虫病、后睾吸虫病、双腔吸虫病、棘口吸虫病、片形吸虫病、异形吸虫病、并殖吸虫病）、绦虫病8种（猪绦虫/囊虫病、牛绦虫/囊虫病、棘球蚴病、泡球蚴病、裂头蚴病、裂头绦虫病、复孔绦虫病、细颈囊尾蚴病）、线虫病10种（钩虫病、膨结线虫病、毛细线虫病、麦地那龙线虫病、犬恶丝虫病、马来丝虫病、吸吮线虫病、颚口线虫病、粪类圆线虫病、旋毛虫病）、棘头虫病1种（猪巨吻棘头虫病）和节肢动物病3种（蝇蛆病、疥螨病、蠕形螨病），病原涉及80多种医学寄生虫和节肢动物〔3〕。 生活史类型〔2〕 直接型 病原生物通过接触或媒介直接传播给易感脊椎动物或人，传播过程中病原体不发育、繁殖。如疥螨病、蠕形螨病等，称之为直接人兽共患病。 循环型 完成生活史需要一个以上的脊椎动物宿主。如绦虫病、棘球蚴病等，称之为循环人兽共患病。 媒介型 病原体在传播媒介体内发育、繁殖或既发育又繁殖，然后传播给脊椎动物或人。如疟疾、丝虫病等，称之为媒介人兽共患病。 污染型 存在脊椎动物宿主与病原体发育或储集的非动物环境如水、食物、土壤、植物等，宿主的感染来源于被污染的非动物环境。如钩虫病、粪类圆线虫病等，称之为污染人兽共患病。 流行因素 传染源广 人兽共患寄生虫对宿主的选择性不严格，一种寄生虫可寄生于多种宿主。寄生宿主除人、犬和猫，还有多种哺乳类、禽类、鸟类、鱼类和爬行类等多种野生动物。感染宿主是重要的传染源，传染源广泛是CPCMA分布广、控制难的主要原因。 传播途径多 CPCMA的传播与流行，是生态系统中寄生虫种群流动时人和兽共同参与的过程。传播途径包括兽传兽、人传人、兽传人和人传兽，各种流行环节既相互独立，又相互联系、相互影响、相互制约。感染方式也多种多样，包括经口、经皮肤或黏膜、经接触、经飞沫、经胎盘、经节肢动物媒介传播等多种先天和后天感染方式。 宿主普遍易感 寄生虫感染的免疫力多属非消除性免疫，未感染宿主因缺乏特异性免疫而易感。当具有免疫力的感染宿主体内的寄生虫被清除后，这种特异性获得免疫也将逐渐消失，重新处于易感状态，很易发生再感染。对某些寄生虫的易感性除与免疫有关外，还与宿主的食性、生活习性等因素有关。 防治原则 CPCMA的防治常根据流行情况和流行规律，制定相应的法规监督管理制度，将控制传染源、切断传播途径和保护易感宿主有机结合起来，因地制宜，以防为主，综合防治。而免疫预防(immunoprophylaxis),应用疫苗接种的方法诱导宿主产生特异性免疫，以预防和控制寄生虫病已被国内外科学家认为是最安全、有效的防治措施，也是人们多年来共同追求的目标。2 宠物（犬、猫）人兽共患寄生虫疫苗研究 现状与需求 长期以来，无论对人或兽的寄生虫病防治都以药物驱虫为主，并取得了显著成效。过去的10年，驱虫药已成为动物药品市场中增长最快的领域，约占世界动物药品销售额（18万亿美元）的四分之一〔4〕。至今，药物驱虫仍然在治疗和控制寄生虫病中发挥着重要作用。但是，长期、大量化学药物的应用，出现了药物抗性寄生虫、化学药物残留以及药物残留引发的食品安全和环境污染等问题〔5〕。加之，寄生虫存在明显的再感染现象、抗虫新药研发周期长、投资巨大以及宠物主对疫苗预防的渴望和需求，这些都引起了研究者和商家的高度关注。一个寄生虫病疫苗防治的新领域正悄然兴起，一个潜在而巨大的宠物寄生虫疫苗商品市场将面临竞争。 疫苗研究进展 由于疫苗安全、无副作用、无残留、无污染，具有预防和治疗的双重功效，且易被消费者接受，所以人类对几乎所有传染病都提出疫苗防治的要求。虽然，寄生虫结构、抗原复杂、寄生部位和免疫机制特殊等原因给疫苗研制带来了重重困难，但是，消费者对健康和安全的需求以及盈利超过3万亿美元的宠物市场对疫苗的需求，对寄生虫疫苗的研究产生了巨大的动力。虽然，兽用寄生虫疫苗研究已取得明显进展，但至今，商品寄生虫疫苗绝大多数仍为活疫苗或致弱活疫苗。由于其存在保护率低、安全性差、产量低、成本高等问题，商业前景不容乐观（Bain,1999）〔6〕。而基因工程疫苗和核酸疫苗的研究，可使寄生虫疫苗的产业化和商品化成为现实，许多科学家对此寄予极大的期望（Alarcon等,1999）〔7〕。 原虫疫苗 原虫是引起CPCMA的重要病原。在医学研究领域人们在疟原虫、弓形虫、利什曼原虫和锥虫的研究中积累了大量的免疫学、基因组学和疫苗学知识，并利用这些知识研制了防治动物寄生虫病的贾第虫疫苗、弓形虫疫苗、隐孢子虫疫苗和球虫疫苗，目前已有几种疫苗上市销售（Olson等,2000;Augstine,2001）〔8，9〕。利什曼原虫疫苗的研究经历了全虫疫苗、重组疫苗和核酸疫苗的过程。1999年，研究证实LPG(lipophosphoglycan)是阻断传播中有希望的候选疫苗。目前，硕大利什曼原虫核酸疫苗保护性抗原基因有表面抗原gp63、LACK、PSA-2、表面抗原/gp46/M-2等。Handman等(2001)发现DNA疫苗也有治疗作用〔10〕，Mendez等(2001)用L. major对C57BL/6小鼠免疫实验研究，结果表明DNA疫苗接种可产生有效的保护性〔11〕。另外，还发现一种可诱导更高保护率的LACK蛋白，并在构建硕大利什曼原虫LACK DNA疫苗后，证实其能诱导Th1反应，可控制感染〔12〕。Fort Dodge动物卫生组织（1999）研制的贾第虫疫苗，能减少或阻止犬和猫肠道内贾第虫包囊脱囊，最终实现疫苗接种动物体内无滋养体感染（Olson等,2000）〔13〕。1993年，英特威公司以致弱S48株刚地弓形虫研制弓形虫DNA疫苗“Toxovax”,用其滴鼻预防绵羊弓形虫病取得有效的结果。有关弓形虫核酸疫苗的研究，Angus等(1996)用弓形虫SAGI重质粒免疫小鼠进行初步研究。周永安等(1999)用PcDNA3-p30真核表达质粒免疫小鼠，结果显示血清抗体升高，感染小鼠存活时间延长〔14〕。郭虹等(1999)将PcDNA-ROPI重组质粒以IFN-γ为佐剂免疫小鼠，结果显示NK细胞活性、CD8+T细胞明显增高，CD4+/CD8+比值明显降低〔15〕。预防球虫病的重组疫苗正在研究中，用沙门氏杆菌作为载体表达的球虫抗原EalA诱导免疫应答的研究也在实验中(Song等，2000)〔16〕。许多实验研究表明预防原虫感染的保护性免疫是可以人工建立的。 吸虫疫苗 人体吸虫均有脊椎动物保虫宿主，绝大多数都可在人和脊椎动物之间自然传播，目前对其疫苗的研究主要见于血吸虫和片形吸虫。血吸虫疫苗研究也已经历了全虫疫苗(死疫苗、活疫苗、同种致弱活疫苗和异种活疫苗)到分子疫苗(基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗和核酸疫苗)的发展过程。随着生物高新技术的发展，血吸虫疫苗候选抗原分子或抗原基因不断被发现和鉴定，基因工程疫苗已成为主要研究方向。1998年，WHO/TDR在两个独立的研究室对几种曼氏血吸虫(Sm)疫苗候选分子进行了平行实验，并提出6个最具潜力的疫苗候选分子，包括28kDa SmGST(谷胱甘肽-S-转移酶)、97kDaSm Paramyosin(副肌球蛋白)、IrV-5(致弱尾蚴免疫血清筛选的抗原分子)、TPI(丙糖-膦酸酯异构酶)、Sm23(膜相关抗原)和Sm14(脂肪酸结合蛋白)。其中，GST已进入临床Ι期试验，paramyosin、MAP-4/TPI和Sm14抗原将按GMP标准制备用于临床试验，而IrV-5和MAP-3/Sm23被推荐采用DNA免疫的形式继续研究〔2〕。1999年报道，肝片形吸虫分泌的组织蛋白酶L1和L2是重要的蛋白分子，参与免疫逃避、组织穿透和营养吸收等功能(Mulcahy等，1999;Spithill等,1999)〔17，18〕。用其接种牛，可减少虫负荷42%～69%，虫卵活力下降60%，若将其与高分子血红蛋白结合，保护率可增加至73%(McGonigle等，1995)。Piacenza等（1999）用其接种绵羊，保护率为60%，减卵率为71%～81%，将其与天然亮氨酸氨肽酶结合时，保护率可增加到79%〔19〕。肝片形吸虫其他蛋白分子，如谷胱甘肽S转移酶（GST）和多种脂肪酸结合蛋白（FABP）对牛的保护率分别是19%～67%和55%，但有关肝片形吸虫重组疫苗的试验未见报道（Spithill等，1999）〔20〕。 绦虫疫苗 绦虫也多引起人兽共患病，且中绦期幼虫寄生引起的囊尾蚴病和棘球蚴病对宿主的危害更严重。用于预防带属（囊尾蚴病）和棘球属（棘球蚴病）绦虫的重组疫苗研究已获成功。20世纪80年代，在中国、新西兰和澳大利亚、阿根廷分别实施的试验结果证明棘球蚴疫苗EG95对牛群感染的保护率达96%～100%。预防绵羊带绦虫感染的疫苗45W的保护率达92%以上，牛带绦虫疫苗预防牛的感染同样有效。EG95和45W抗原在六钩蚴表面表达，与抗体和补体结合，阻止六钩蚴逸出和移行，从而发挥保护免疫作用。其另一重要特性是能产生跨种保护，已证实绵羊带绦虫45W、To18t To16分子的复合物能诱导人工感染猪的保护率达93%。因此，在预防人类感染中有应用潜力（Lightowlers等，2000）〔21〕。Chabalgoity(2001)报道棘球绦虫六钩蚴的脂肪酸结合蛋白以致弱的鼠伤寒杆菌（LVRO1）表达形式口服接种犬，可产生有效的体液和细胞免疫应答，作者建议研究其他犬用候选疫苗时应用这种表达形式，因为鼠伤寒杆菌LCRO1对犬无害〔22〕。 线虫疫苗 钩虫疫苗的研究目标主要针对减轻虫负荷、减少宿主失血和增强交叉防御作用。早在30年代，Johns Hopkins公共卫生学院蠕虫学系用犬钩口线虫活的三期幼虫(L3)口服或皮下接种犬和鼠，可减轻虫负荷、减少肠出血。60年代，L3疫苗被研制成一种致弱活疫苗，70年代初投放市场。然而，因其不能抵御感染和再感染且价格昂贵而被淘汰。随后研究重点转向L3分泌抗原(Ancylostoma secreted protein, ASP)。目前，ASP-1和ASP-2类似蛋白在十二指肠钩口线虫、锡兰钩口线虫和美洲板口线虫已得到分离和克隆。并有证据表明，ASP是有前景的疫苗候抗原〔23〕。血矛属、奥斯特属和毛圆属消化道线虫，是牛、羊等动物最主要的寄生虫，在驱虫药市场中占有最大的份额，人们投入的研究精力也最多。有效的线虫疫苗是一种具氨肽酶A和M活性的110KDa的H11蛋白分子。H11在线虫微绒毛上表达并与抗体结合，可破坏线虫四期幼虫和成虫的摄食能力，对绵羊羔的保护率达90%以上。这种保护率与抗体滴度相关。因H11在自然感染时不具免疫原性，而被认为是一种“隐蔽抗原”(Newton等，1999)〔24〕。研究显示，捻转血矛线虫p100GA1在预防山羊异源感染时保护率为60%、虫卵减少率为50%。从众多的疫苗成分中提取能产生交叉保护的单一分子，或至少是少数几个分子已成为线虫疫苗研究的焦点。而“隐蔽抗原”被认为是最理想的候选物。另一挑战是通过重组DNA等技术使疫苗研究产业化，重组H11、H-gal-GP和TSBP的研究正在向这个方向发展（Knox等,2001）〔25〕。 节肢动物疫苗 目前的研究主要集中在与牛、绵羊等经济动物相关的节肢动物（蜱、螨、吸血蝇、毛虱等）。最具里程碑意义的是一种由大肠杆菌表达的Bm86基因工程疫苗〔TickGard (TM)〕，由澳大利亚生物技术所和联邦科学与工业研究组织（CSIRO）联合研制，用于预防牛的微小牛蜱（Willadsen,1995）〔26〕。此后，在酵母中也表达成功类似的重组疫苗〔Gavac (TM)〕并由古巴哈瓦那Heber生物技术科学院商品化生产(Garcia等，2000)〔27〕。该疫苗诱导的抗体可结合、溶解蜱肠细胞上的Bm86分子，从而干扰蜱的吸血行为，使其繁殖能力下降。1999年，澳大利亚生物技术所研制出第二代能产生强而持久免疫应答的微小牛蜱疫苗〔TickGard Plus(TM)〕。同年，加拿大批准一种预防牛纹皮蝇的蛋白酶“hypodermin A”重组疫苗上市销售（Pruett,1999）〔28〕。 寄生虫疫苗研究展望 上述证据表明，CPCMA种类多、流行因素复杂、防治难度大。人们试图寻找一种有效预防和消除这类疾病的新方法、新途径。大量研究结果证明，接种疫苗诱导宿主产生保护性免疫，以防治寄生虫和节肢动物对宿主的感染或侵害是可行的。尽管已有多种寄生虫疫苗候选抗原的研究取得明显进展，但大多数疫苗诱导的免疫保护率尚未令人满意。抗原分离与筛选、基因克隆与重组、高效表达、提高保护率交叉保护力等仍然是今后一段时间研究的重点。当然，寄生虫疫苗制剂的研究和商品化过程并非一朝一夕，它涉及寄生虫生物学、分子生物学、免疫学、疫苗试验、产业化和商品化等许多环节。我们相信，随着免疫学、基因组学和分子生物学等现代高新技术在寄生虫学研究领域的应用和发展，寄生虫疫苗必将在CPCMA的防制中发挥重要作用。

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