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猪圆环病毒2型与猪附红细胞体混合感染的诊断与防治税光伟 韩旭 张成伟 洪洋 魏攀 指导老师：赵光伟西南大学荣昌校区动物医学系，荣昌 402460摘要:随着我国养猪业集约化程度的提高，生猪和种猪跨地域运输越来越频繁，使得猪群传染病的发生越来越复杂。在很多猪场，都同时存在多种病原的混合感染。2009年1月四川隆昌某猪场送检病猪3头。该场中部分猪只陆续发生高热、皮肤发绀、呼吸困难等症状，病程一般持续5～7天，发病猪一般以死亡为转归。不同年龄段的猪群中均有不同程度的发生，临床表现基本相似。通过临床症状和病理剖检，疑似猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪附红细胞体（）混合感染。据此笔者在西南大学荣昌校区动物疾病快速诊断中心做了确诊实验。关键词:圆环病毒2型 附红细胞体 混合感染 综合防治 Diagnosis and Treatmentof Porcine circovirus type 2 mixed infection Eperythrozoon Shui Guang WeiSouthwest China Normal University of Rongchang campus veterienary medicine department, Rongchang 402460, ChinaAbstract: Along with our country pig-breeding industry intensification degree's enhancement, the live pig and the kind of pig cross region transportation is getting more and more frequent, causes the pig group infectious disease's occurrence to be getting more and more complex. In many pig farms, simultaneously has many kinds of causes of disease the mixed infections. In January, 2009 Sichuan Longchang one pig farm deliver examines the sickness pig 3 heads. This partial pigs only one after another have symptoms and so on high fever, skin cyanosis, scant of breath, the course continue generally for 5~7 days, the morbidity pig take die generally as the extension turn over. In the disparity in age section's pig group has the varying degree occurrence, clinical manifestation basic similar. Split through the clinical symptoms and the pathology examine, I doubt that the sickness pigs mixed infection with PRRSV virus、PCV-2 virus 2 and . According to this,We decide to finish it in the southwest university of Rongchang campus animal disease fast diagnostic word: Porcine circovirus type 2 Eperythrozoon Mixed infection Integrated Control1 材料与方法1．1Bio-Rad PCR仪、菲恰尔（GL-16A）离心机、JUNYI紫外灯（JY04S-3C）、苏静安泰超净工作台、微量可调移液器等。所有实验均在西南大学荣昌校区动物疾病快速诊断中心进行。1．2猪圆环病毒（PCV）核酸扩增检测试剂盒、猪蓝耳病病毒（PRRSV）核酸扩增检测试剂盒均购自北京索奥生物技术有限公司。2 临床症状2．1病猪体温41～42℃，稽留热、精神沉郁、皮毛粗乱、心跳和呼吸加快、双侧性震颤，耳部、腹下、腹股沟、四肢出现不规则的紫斑，指压不褪色，有较浓的眼屎、眼结膜苍白、厌食或不食、呼吸困难、后躯无力、行走摇摆，病猪初期便秘，呈粪球状，小便深黄色，发病后期下痢和便秘交替出现。3 病料采集 对濒死期的或刚刚死亡的猪进行仔细剖检，无菌操作下分别采集心血、肝、脾、肾等病料，供实验室检测用。4 细菌学检查 4．1血液压片 取抗凝血或鲜血一滴，加3－4倍生理盐水稀释，盖上盖玻片，1000倍油镜下观察，可见大多数红细胞边缘呈锯齿状、星芒状或不规则状，并有微微颤动，即可诊断为附红细胞体感染阳性。判定标准:在油镜下检查20个视野，有25个以下附红细胞体的为感染+，有25－50个附红细胞体的为感染++，有50－70及70以上个附红细胞体的为感染+++。4．2组织涂片 将无菌采取的肝、脾、肾及淋巴结涂片，革兰氏染色镜检。5 PRRSV和PCV－2的PCR检测5．1核酸提取 病料RNA和DNA的提取分别用Trizol reagents(RNA提取液)和核酸提取液B（DNA）提取，按照说明书提供的方法进行。首先将血清稀释，取100ul释出血清加入500ul Trizol reagents（RNA提取液）充分震荡，混匀后室温放置5min。加入100ul氯仿，用力振荡15s，室温静置10min，4℃13，000 rpm离心5min。小心将上层水相转移到干净的离心管，加入等体积的异丙醇，充分混匀，13，000 rpm离心5min。弃上清，加入75％DEPC 乙醇，充分混匀，13，000 rpm离心5min，小心吸去大部分乙醇。将提取管口敞口在室温空气中干燥5min，待乙醇挥发干净，用20ul DEPC H2O溶解沉淀。5．2逆转录 根据标本数取逆转录反应管，取2ul上述获得的RNA并加入7ul PRRSV－SM RT MIX引物进行逆转录。PRRSV 逆转录的反应体系为25ul，反应条件为：30℃5min，42℃45 min后98℃5min灭活转录酶。PCV－2 PCR检测则省去RNA提取与逆转录步骤，直接进行相应的扩增。5．3扩增PCR PRRSV PCR扩增的反应体系为25ul。PRRSV PCR扩增反应条件为：94℃变性2min,93℃→2min，93℃ 30 s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35个循环；PCV-2 PCR扩增反应条件为：93℃→2min，后93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35个循环。5．4电泳检测 取15ul PCR扩增产物直接用加样枪点样于2％琼脂糖凝胶胶孔中，以5 v/cm电压，1 x TAE中电泳20min后，紫外灯下观察结果。用DL2000 Marker作为参照。PRRSV和PCV－2的阳性扩增带分别为396bp和143bp。6 结果6．1剖检变化 濒死期病猪的典型表现为：病猪尸体消瘦，不同程度的贫血和黄疸，体表皮肤、粘膜黄染，血液稀薄呈水样；皮下水肿，呈黄白色；体表和肠系膜淋巴结充血、出血和水肿；淋巴结肿大4～5倍，切面外翻，尤以腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管和支气管淋巴结明显，切面多汁呈黄色；肺部的病变主要是肿胀、间质增宽，有散在的橡皮样硬块；肝脏变性且有轻微黄疸、肿大，呈黄棕色；脾脏肿大；肾脏水肿，颜色呈灰白色，覆盖有小出血点。部分病猪心肌变软，心包积液。6．2细菌学检查结果 6．2．1血液压片 1000倍油镜下观察，可见大多数红细胞边缘呈锯齿状、星芒状或不规则状,诊断为附红细胞体感染阳性，标记为：+++,结果见图2。6．2．3组织涂片 革兰氏染色镜检，未见细菌。6．3电泳检测结果：猪圆环病毒（PCV－2）为阳性；蓝耳病病毒（PRRSV）检测为阴性。结果见图1。 图1 PCV-2和PRRSV PCR检测结果 图2 血液压片油镜观察M：DL2000 Marker；1：PCV-2 PCR产物；2：PRRSV PCR产物7 防治措施7．1该病目前尚无疫苗预防，改进饲养管理，对发病严重的病猪立即淘汰，发病轻微的猪进行隔离治疗。用2％ ～3％的烧碱对猪舍进行彻底消毒，保持猪舍饲养用具的清洁卫生；切断附红细胞体病的传播途径。给予全价饲料增加机体的抗病能力，减少不良应激的发生。改进饲养管理，减少应激是控制继发感染的关键。特别是仔猪断奶后的3～4周是预防该病最关键最有效的时期，要降低饲养密度，尽量减少猪群的应激因素，做好猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪蓝耳病疫苗的接种工作，做好猪群平时药物预防工作，母猪在产前1周和产后1周在饲料中可添加土霉素等抗菌药物，仔猪在断奶前1周至断奶后1个月在饲料中可添加强力霉素等抗菌药，同时也拌料一些有预防作用的中药，如清温败毒散进行预防，以减少该病在猪群中流行。7．2猪圆环病毒是猪的免疫抑制性疾病，引起和继发感染的疾病已成为世界养猪业的大敌。目前仍无有效防治措施，采取的方法是控制继发感染，特别要加强断奶仔猪的营养和管理，采取药物预防，降低猪群死亡率，减少经济损失。7．3对症治疗 7．3．1治疗圆环病毒病目前尚无特效的治疗药物，应早发现，早确诊，早治疗。对发病不严重的猪只，选用新型的抗病毒剂如干扰素、白细胞介导素、免疫球蛋白、转移因子等进行治疗；同时采用黄芪多糖注射液并配合Vb1、Vb12、Vc肌肉注射，增强猪自身免疫力；另外，也要采用抗菌药物，控制继发感染，如氟苯尼考、阿米卡星、盐酸林可壮观霉素等配合治疗，尽量少用磺胺类药物和地塞米松进行治疗。7．3．2目前对猪附红细胞体病疗效较好的药物有长效土霉素，四环素，贝尼尔等，按说明剂量肌注24h后，可见临床症状改善，连用3～5d。另外，对阳性猪群的贫血猪，可应用铁制剂(右旋糖酐铁)、土霉素、Vb12、VC等对症治疗。8 小结与讨论8．1此次疫病根据流行病学、临床症状和剖检变化及实验室诊断，最后确诊为猪圆环病毒2型与附红细胞体混合感染。8．2猪圆环病毒病是由猪圆环病毒感染所引起的以免疫抑制为特征的一类病毒性传染病。PCV-2感染新生仔猪及断奶仔猪，使仔猪发生先天性震颤和断奶后全身消耗性综合征，是一种慢性消耗性疾病，导致断奶仔猪生长缓慢、发育障碍、机体免疫力下降、易继发其他疾病(附红细胞体病、弓形体病、猪瘟等)而加重病情。要抓住关键时期，减少应激，仔猪断奶后3～4周，是预防圆环病毒的最关键时期，最有效的方法和措施是尽可能减少断奶仔猪的应激。经分析，猪长途贩运，使动物机体产生一定的应激反应，加上抵抗力下降，特别是感染附红体和弓形体病后，进一步降低机体的免疫力，当遇到传染性疾病流行时，特别是遇到猪圆环病毒感染侵袭，就会造成病猪死亡率增高。8．3猪附红细胞体病是由猪附红细胞体引起猪的一种血液病，蚊虫是重要的传播媒介，尤其在多雨季节蚊虫易孳生，加上猪群感染圆环病毒，机体抵抗力下降，而发生猪附红细胞体病。防治该病应消灭蚊虫，切断传播途径，加强器械的消毒，提高管理水平。从现在的季节来看，正是春季，气温时高时低，忽热忽冷，春季又是病菌活动频繁季节，所以加快了疫病流行。另外，老鼠可传播多种疾病，若鼠害控制不力，则易引起疾病的发生，因此，必须控制鼠害。8．4为了减少疾病的发生，规模化养猪场必须坚持自繁自养，做到全进全出，加强平时消毒工作，这样尽可能地避免或减少疫病的传入和流行。8．5附红细胞体病的死亡率很低，但与猪圆环病毒混合感染后，死亡率就会显著上升，可达60％以上，这也是造成病猪死亡率增高的重要原因。采用综合措施后，该猪场的病情基本稳定，得到了有效控制，到2月下旬逐渐恢复正常。参考文献：[1] 马其国,商绍彬,申会刚. 猪圆环病毒2型诊断技术的研究进展[J]. 浙江畜牧兽医, 2008, 33(5): 7-9.[2] 谷训国. 猪附红细胞体病的鉴别诊断与防治[J].2008,(6): 81.[3] 苏双,吕雪峰. 猪附红细胞体病研究进展[J]. 兽医导刊,2008,(8): 25-27.[4] 孙波,王俊珍,窦续鑫. 猪附红细胞体病的诊治[J]. 湖北畜牧兽医,2007,(2): 39-40.[5] 刘殿忠. 猪圆环病毒与附红细胞体混合感染的诊治[J]. 兽医导刊，2008,(3): 43[6] 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猪蓝耳病目录[隐藏]一、病 原二、流行病学三、发病机理四、临诊症状五、病理变化六、鉴别诊断七、防治八、药物防治本病以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎）及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已经成为规模化猪场的主要疫病之一。本病曾称为“神秘猪病”、“新猪病”、“猪流行性流产和呼吸综合症”、“猪生殖与呼吸综合症”、“蓝耳病”、“猪瘟疫”等，我国将其列为二类传染病。[编辑本段]一、病 原猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒为单股正链RNA病毒，属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。不凝集哺乳动物或禽类红细胞，有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，好在中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强。[编辑本段]二、流行病学本病是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。持续性感染是PRRS流行病学的重要特征，PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。[编辑本段]三、发病机理PRRSV可通过血液循环穿过胎盘使胎猪受到感染，从而引起妊娠后期母猪流产等繁殖障碍。[编辑本段]四、临诊症状本病的潜伏期差异较大，引入感染后易感猪群发生PRRS的潜伏期，最短为3天，最长为37天。本病的临诊症状变化很大，且受病毒株、免疫状态及饲养管理因素和环境条件的影响。低毒株可引起猪群无临诊症状的流行，而强毒株能够引起严重的临诊疾病，临诊上可分为急性型、慢性型、亚临诊型等。1、急性型：发病母猪主要表现为精神沉郁、食欲减少或废绝、发热，出现不同程度的呼吸困难，妊娠后期（105～107天），母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔。母猪流产率可达50%～70%，死产率可达35%以上，木乃伊可达25%，部分新生仔猪表现呼吸困难，运动失调及轻瘫等症状，产后1周内死亡率明显增高（40%～80%）。少数母猪表现为产后无乳、胎衣停滞及阴道分泌物增多。1月龄仔猪表现出典型的呼吸道症状，呼吸困难，有时呈腹式呼吸，食欲减退或废绝，体温升高到40℃以上，腹泻。被毛粗乱，共济失调，渐进性消瘦，眼睑水肿。少部分仔猪可见耳部、体表皮肤发紫，断奶前仔猪死亡率可达80%～100%，断奶后仔猪的增重降低，日增重可下降50%～75%，死亡率升高（10%～25%）。耐过猪生长缓慢，易继发其他疾病。生长猪和育肥猪表现出轻度的临诊症状，有不同程序的呼吸系统症状，少数病例可表现出咳嗽及双耳背面、边缘、腹部及尾部皮肤出现深紫色。感染猪易发生继发感染，并出现相应症状。种公猪的发病率较低，主要表现为一般性的临诊症状，但公猪的精液品质下降，精子出现畸形，精液可带毒。2、慢性型：这是目前在规模化猪场PRRS表现的主要形式。主要表现为猪群的生产性能下降，生长缓慢，母猪群的繁殖性能下降，猪群免疫功能下降，易继发感染其他细菌性和病毒性疾病。猪群的呼吸道疾病（如支原体感染、传染性胸膜肺炎、链球菌病、附红细胞体病）发病率上升。3、亚临诊型：感染猪不发病，表现为PRRSV的持续性感染，猪群的血清学抗体阳性，阳性率一般在10%～88%。[编辑本段]五、病理变化1、大体病变：无继发感染的病例除有淋巴结轻度或中度水肿外，肉眼变化不明显，呼吸道的病理变化为温和到严重的间质型肺炎，有时有卡他性肺炎，若有继发感染，则可出现相应的病理变化，如心包炎、胸膜炎、腹膜炎及脑膜炎等。2、病理组织学：PRRSV感染引起的繁殖障碍所产仔猪和胎儿很少有特征性病变，PRRS致死的胎儿病变是子宫内无菌性自溶的结果，没出现特异性；流产的胎儿血管周围出现以巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的动脉炎、心肌炎和脑炎。脐带发生出血性扩张和坏死性动脉炎。生长猪较成年猪更常见特征性组织性病理变化，肺的组织学病变具有普遍性，有诊断意义。单纯的PRRS感染引起的肺炎以间质性肺炎伴随正常的呼吸道上皮为特征。其特点为肺泡间隔增厚，单核细胞浸润及Ⅱ型上皮细胞增生，肺泡腔内有坏死细胞碎片。PRRS和细菌、病毒混合感染时，病变应和并发感染的细菌/病毒的不同而有所变化，合并感染细菌性病原常引起复杂的PRRS肺炎，间质性肺炎常混合化脓性纤维素性支气管肺炎或被化脓性纤维素性支气管肺炎所掩盖。有些感染病例还可见胸膜炎。鼻甲部黏膜的病变是PRRS感染后期的特征，其上皮细胞纤毛脱落，上皮内空泡形成和黏膜下层淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润。淋巴结、胸腺和脾脏的组织病理学变化，以发生肥大和增生、中心坏死、淋巴窦内有多核巨细胞浸润为特征，病早期可见脾脏白髓、扁桃体滤泡淋巴细胞坏死，后期脾核淋巴结细胞增生；另外PRRS感染引起的血管、神经系统、生殖系统的病变也主要表现为淋巴、巨噬细胞、浆细胞的增生和浸润。[编辑本段]六、鉴别诊断本病应与其它繁殖障碍和呼吸道疾病进行鉴别诊断，如应与伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪细小病毒病、猪瘟、猪流行性乙型脑炎、猪呼吸道冠状病毒病、猪脑心肌炎、猪血凝性脊髓炎以及其他细菌性疾病进行区分。[编辑本段]七、防治1、坚持自繁自养的原则，建立稳定的种猪群，不轻易引种。如必须引种，首先要搞清所引猪场的疫情，此外，还应进行血清学检测，阴性猪方引入，坚决禁止引入阳性带毒猪。引入后必须建立适当的隔离区，做好监测工作，一般需隔离检疫4～5周，健康者方可混群饲养。2、规模化猪场要彻底实现全进全出，至少要做到产房和保育两个阶段的全进全出。3、建立健全规模化猪场的生物安全体系，定期对猪舍和环境进行消毒，保持猪舍、饲养管理用具及环境的清洁卫生，一方面可防止外面疫病的传人，另一方面通过严格的卫生消毒措施把猪场内的病原微生物的污染降低到最低限，可以最大限度地控制和降低PRRSV感染猪群的发生率和继发感染机会。4、做好猪群饲养管理。在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪场，应做好各阶段猪群的饲养管理，用好料，保证猪群的营养水平，以提高猪群对其他病原微生物的抵抗力，从而降低继发感染的发生率和由此造成的损失。5、做好其他疫病的免疫接种，控制好其他疫病，特别是猪瘟、猪伪狂犬和猪气喘病的控制。在猪繁殖一呼吸综合征病毒感染猪场，应尽最大努力把猪瘟控制好，否则会造成猪群的高死亡率；同时应竭力推行猪气喘病疫苗的免疫接种，以减轻猪肺炎支原体对肺脏的侵害，从而提高猪群肺脏对呼吸道病原体感染的抵抗力。6、定期对猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染状况进行监测，以了解该病在猪场的活动状况。一般而言，每季度监测一次，对各个阶段的猪群进行采样进行抗体监测，如果4次监测抗体阳性率没有显著变化，则表明该病在猪场是稳定的，相反，如果在某一季度抗体阳性率有所升高，说明猪场在管理与卫生消毒方面存在问题。应加以改正。7、对发病猪场要严密封锁；对发病猪场周围的猪场也要采取一定的措施，避免疾病扩散，对流产的胎衣、死胎及死猪都做好无害处理，产房彻底消毒；隔离病猪，对症治疗，改善饲喂条件等。8、关于疫苗接种，总的来说目前尚无十分有效的免疫防制措施，目前国内外已推出商品化的PRRS弱毒疫苗和灭活苗，国内也有正式批准的灭活疫苗。然而，PRRS弱毒疫苗的返祖毒力增强的现象和安全性问题日益引起人们的担忧。国内外有使用弱毒疫苗而在猪群中引起多起PRRS的暴发，因此，应慎重使用活疫苗。虽然灭活疫苗的免疫效力有限或不确定，但从安全性角度来讲是没有问题的，因此在感染猪场，可以考虑给母猪接种灭活疫苗。[编辑本段]八、药物防治本病重在预防，应控制好应激及其他疾病的感染。现将有效的预防程序推荐如下：1、 公猪每月或每季度预防一次：每吨饲料添加蓝圆康泰500g+支原必净500g，连用7天；2、 母猪妊娠70～80天，产前7天～产后7天：每吨饲料添加蓝圆康泰500g+支原必净500g，连续饲喂；3、 母猪断奶当天～7天：每吨饲料添加蓝圆康泰500g+支原必净500g，连续饲喂；4、 后备母猪配种前7～15天：每吨饲料添加蓝圆康泰500g+支原必净500g，连续饲喂；5、 仔猪断奶前3天～断奶后2周：每吨饲料添加蓝圆康泰500g+支原必净500g，连续饲喂；6、 第18、22周龄分别使用一周：每吨饲料添加蓝圆康泰500g+支原必净500g，连续饲喂；7、 每周两次消毒：速洁1：500倍稀释带猪喷雾。每月两次熏蒸：速洁1：25倍稀释带猪熏蒸，每瓶（500ml）可熏蒸1250立方米。对于已发病猪，可以采用中西药结合的方法进行治疗，方法如下。猪蓝耳病的中药治疗：生石膏50克，生地黄18克，牡丹皮10克，赤芍10克，玄参15克，黄芩15克，连翘10克，银花藤20克，板蓝根15克；如有高热加水牛角30克,麦冬15克,丹参10克，加水2000毫升，浸泡30分钟,煎沸10分钟后,自然放凉。大猪每次100毫升,3-6次/日小猪每次20-50毫升,3次/日，患猪可保基本存活。西药治疗：注射猪血清，口服阿莫西林粉，打干扰素，病猪隔离淘汰，所有的猪都做治疗。若有继发症，须使用混合血清，以增强效果。注意事项：当病猪退烧并恢复食欲后，不可喂食，每日以少量清水掺以中药或西药饮之。否则，病情会反复持续发作，并不断加重。空腹使之饥饿，十余天后，肥猪渐渐变瘦，病情随之日渐缓解，或者康复。该法经试验表明，效果良好。治疗方案2猪干扰素（IFN），每40公斤体重用量1毫升肌注，每日一次，连用3日，重症加量。全群强力霉素与黄芪多康拌料，连用7天。特福（猪用转移因子），用法用量同干扰素，用注射用水分别稀释后，混合在一起注射。圆环菌毒杀（复方甲磺酸培氟杀星注射液）每公斤体重毫升肌注，连用3－5天。方解：干扰素通过抑制病毒核酸的合成复制，具有广谱抗病毒作用；转移因子能增强肌体免疫机能，提高肌体抵抗力，二者协同使用效果加强。圆环菌毒杀：有效抗菌成分作用于细菌复制所必需的DNA旋转酶的A亚基和B亚基，使细菌DNA的复制受阻，达到杀菌功效；其中，特殊抗病毒成分进入被病毒感染的细胞后，迅速磷酸化，竞争性抑制病毒合成酶，有效抑制病毒体内单磷酸次黄嘌呤（IMP）脱氢酶，从而阻断病毒核酸的合成，对RNA和DNA病毒都具有广谱抗病毒活性。与干扰素转移因子同用，抗病毒作用加强，效果更好。本组方具有，广谱抗病毒、广谱抗菌和解热镇痛作用。对病毒性疫病，特别对蓝耳病、圆环病毒及其他细菌性混合感染，效果明显，治愈率很高。
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