伪狂犬病料接种家兔论文

伪狂犬病(Pseudorabies，PR又名Aujeszky\\\'s disease，AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。20世纪中期，PR在东欧及巴尔干半岛的国家流行较广，60年代之前，猪被感染后其症状比较温和，在养猪业中未造成重大经济损失。然而在60一70年代，由于强毒株的出现，猪场爆发Pr的数量显著增加，而且各种日龄的猪均可感染，其症状明显加剧。这种变化不仅存在于美国，在西欧各国如德国、法国、意大利、比利时、爱尔兰等国家也同样存在。几年之后，此病相继传入新西兰、日本、我国的台湾及南美的一些国家和地区。目前世界上有40多个国家都有本病报道，据不完全统计，我国已有20多个省、市流行过本病，近几年PR在我国许多省(市)种猪场呈爆发流行趋势。现将PR的病原、流行病学、临床症状、诊断、防治等作一概述。 病原 病原及其感染特点 伪狂犬病PRV属疱诊病毒科疱疹病毒甲亚科，暂定水痘病毒属，病毒粒子呈椭圆或圆形，无囊膜粒子直径为110-150nm；有囊膜的成熟病毒粒子直径180nm。囊膜表面有呈放射排列的纤突，长8-1Onm，DNA分子量为87×l06。 PRV是疱疹病毒中抵抗力较强的一种。在物体表面和液体中可存活7d。在pH4-9之间保持稳定。腐败条件下，病料中的病毒经lld失去感染力。PRV对乙醚、氯仿等脂溶剂，福尔马林和紫外线照射等敏感。5%石碳酸经2min灭活，氢氧化钠使其灭活。对热的抵抗力较强，55-60℃经30-50min才能灭活，80℃经3min灭活。 迄今为止，还没有发现抗原性不同的PRV毒株。在病毒与宿主的相互作用中，病毒的糖蛋白起着重要作用，现已发现在PRV至少有gⅠ、gⅡ、gⅢ、gp50、gp63、gX、gH、gL、gM、gN和gK等11种糖蛋白。 感染特点 潜伏感染被感染猪不表现临床症状，但感染性病毒却能在猪体内长期以潜伏状态存在，也分离不到病毒，但用聚合酶探针方法可查出病毒基因组DNA的存在，在外界不良环境刺激等造成的免疫力减弱时，潜伏状态的病毒可转化为具有感染性的病毒。 隐性感染在猪群使用疫苗接种或自然感染部分少量病毒后，该猪只得到部分免疫，可发生隐性感染猪和表现为亚临床症状的猪，这种带毒猪排毒可持续一年以上。 流行病学 易感动物PRV是感染动物种类多和致病性强的一种病毒。除各种年龄的猪、牛都易感外，在自然条件下使羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐等动物感染发病。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感。其中以家兔最敏感。 传播形式 垂直传播PRV可通过胎盘而传递给子体，而母体免疫球蛋白却不能，所以对胎儿的感染是致命的。 媒体传播带有病毒的空气飞沫核可随风传到9km或更远的地方，使健康猪群受到感染。被污染的饲料、或带病毒的鼠、羊等动物也可传播。 临床症状 病猪的临床症状和病程随年龄不同而有很大差异。哺乳仔猪最为敏感，15日龄以内的仔猪常表现为最急性型，病程不超过72h，死亡率100%，主要表现为体温升高、拉稀、发抖、运动不协调、流涎、颈部肌肉僵硬、四肢划水样运动，最后昏迷死亡。育肥猪则大多数伴有体温升高，呼吸困难，一般不发生死亡，耐过后呈长朗隐性感染带毒或排毒。成年猪常不呈现可见临床症状或仅表现为轻微体温升高，一般不发生死亡。母猪妊娠初期，可在感染后的20天左右发生流产，在妊娠后期，经常发生死胎和木乃伊，或者产出弱胎和死胎。 诊断 病毒分离和鉴定采取脑组织、扁桃体，用PBS制成10%悬液或鼻咽洗液接种猪、牛肾细胞或鸡胚成纤维细胞，于18-96h出现病变，有病变的细胞用H•E染色，镜检可看到嗜酸性核内包涵体。 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin，取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔，通常在36-48h后注射部位出现剧痒，病兔啃咬注射部位皮肤，皮肤脱毛、破皮和出血，继之四肢麻痹，体温下降，卧地不起，最后角弓反张，抽搐死亡。 血清学诊断 中和试验(NT)NT有较高灵敏度，是一种常用的诊断方法。将标准病毒株与连续倍比稀释的等量血清混匀后，37℃中和lh，接种在96孔微量培养板上的单层猪肾继代细胞(PK-l5)或鸡胚成纤维细胞，置37℃，5%CO2培养观察CPE，以能完全中和试验病毒的血清最高稀释度的倒数为该血清的中和效价，中和效价大于或等于1:2的判为阳性。 酶联免疫吸附试验(ELISA)程由铨等应用单克隆抗体介导的固相微球直接ELISA检测感染，小白鼠额下腺、耳下腺混合物、肝、脾、肺、肾等材料，PRV的阳性检出率为98%。黄骏明等用过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A建立的Dot-ELISA对猪血清PRV抗体具有特异强、灵敏度高的优点，与血清中和试验比较，Dot-ELISA阳性检出率为(53/188)、NT阳性检出率为(39/188)。 免疫荧光抗体试验(FA)程由铨等[10]建立了检测病料组织中PRV间接荧光抗体试验，并和病毒分离(VI)作了比较，对肺和扁桃体中PRV抗原检出率分别为FA86%和92%，V194%和88%。黄骏明等建立了直接FA技术检测PRV，对病猪活体取鼻咽试子涂片，对病死猪取扁桃体、三叉神经节、脑、脊髓和鼻粘膜涂片，检出率高达95%以上。 核酸探针检测技术郭万栓等用斑点杂交法应用32P标记PRV全基因组DNA和重组质粒作探针检测细胞培养物中的PRV一DNA，均能检测lOpg的PRV一DNA，且有较高特异性。魏伟等用光敏生物素标记PRV特异性糖蛋白GP50克隆重组颗粒PUP作为探针，检测实验感染乳猪15头份，证明通过PCR和分子克隆技术制备的PRV特异性糖蛋白基因片段的光敏生物探针，能有效地用于检测伪狂犬病。 PCR技术冉多良等，石建平等，周复春等，冉智光等先后应用PCR技术对PRV进行基因扩增，均获得了特异敏感的结果。 防治 目前尚无治疗该病的特效药物，应用猪业科技的苓草败毒散+健胃散+复合B+替米考星能迅速控制感染、降低死亡。对PRV控制除常规隔离、消毒、控制人员流动以外，疫苗接种是防止PR发生流行的重要措施。Lens[3]报道用DNA重组技术研制的低毒力PR疫苗进行田间免疫，安全有效，应用该疫苗接种的猪再发生接独感染。目前国内主要应用灭活苗和弱毒苗预防PR，具有良好的免疫效果。灭活苗和弱毒苗只能降低接种猪的发病率和死亡率，但不能阻止带毒猪排毒。PR一旦传入猪场就很难根除，在发生过PR的猪场，停止使用疫苗后又会引起本病的发生。因此，在疫区进行疫苗接种外，非疫区应加强对引进猪的检疫，隔离饲养，搞好圈舍卫生，从而控制该病的发生和传播。

本病一年四季都可发生但以冬春和产仔 旺季多发，传播途径主要是直接或间接接触，还可经呼吸道黏 膜、破损的皮肤和配料等发生感染。往往是分娩髙峰的母猪 舍首先发病，窝发病率可达100%。发病猪主要在15日龄以 内的仔猪，发病最早日龄是4日龄，发病率98%，死亡率85%随着年龄的增长，死亡率可下降。[病理变化]一般无特征性病变。如有神经症状，脑膜 明显充血，出血和水肿，脑脊髓液增多。扁桃体和脾均有散在 白色坏死点。肺水肿，有小叶性间质性肺炎。胃黏膜有卡他 性炎症，胃底黏膜出血。流产胎儿的脑和臀部皮肤出血点，肾 和心肌出血，肝和脾有灰白色坏死灶。[诊断要点]根据母猪的繁殖障碍、仔猪的神经症状和 髙死亡率可以做出初步诊断。确诊需进行实验室诊断。包括 PCR检测病原法、ELISA检测野毒抗体法和实验动物法。其 中前两种实验方法都需要一定的仪器设备和技术，不适合在应用黄芪多糖等中药制剂配合治疗。对未发病受威胁猪进行 紧急免疫接种。可使用伪狂犬病疫苗（Bartha-k61)，乳猪股 内侧肌内注射毫升，3月龄以上，股内侧肌内注射1毫 升，妊娠母猪或成年猪臀部肌内注射2毫升。猪伪狂犬病的防控难点在于：猪群感染后潜伏期长，猪一旦 感染，终身带毒并可间断排毒；血清抗体不能完全中和病毒，可保护不发病但不能完全阻止感染；病毒感染时机体细胞免疫扮演 重要角色。

伪狂犬病毒感染一般无特征性病变。眼观主要见肾脏有针尖状出血点，其他肉眼病变不明显。可见不同程度的卡他性胃炎和肠炎，中枢神经系统症状明显时，脑膜明显充血，脑脊髓液量过多，肝、脾等实质脏器常可见灰白色坏死病灶，肺充血、水肿和坏死点。子宫内感染后可发展为溶解坏死性胎盘炎。组织学病变主要是中枢神经系统的弥散性非化脓性脑膜脑炎及神经节炎，有明显的血管套及弥散性局部胶质细胞坏死。在脑神经细胞内、鼻咽黏膜、脾及淋巴结的淋巴细胞内可见核内嗜酸性包涵体和出血性炎症。有时可见肝脏小叶周边出现凝固性坏死。肺泡隔核小叶质增宽，淋巴细胞、单核细胞浸润。猪伪狂犬病诊断鉴别根据疾病的临诊症状，结合流行病学，可做出初步诊断，确诊必须进行实验室检查。同时要注意与猪细小病毒、流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、弓形虫及布鲁氏菌等引起的母猪繁殖障碍相区别。后躯麻痹，耳一前一后，运动失衡 猪伪狂犬病分离病毒分离鉴定病毒的分离是诊断伪狂犬病的可靠方法。患病动物的多种病料组织如脑、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体等均可用于病毒的分离，但以脑组织和扁桃体最为理想，另外，鼻咽分泌物也可用于病毒的分离。病料处理后可直接接种敏感细胞，如猪肾传代细胞(PK-15和IBRS-2)、仓鼠肾传代细胞 (BHK-21)或鸡胚成纤维细胞(CEF)，在接种后24～72小时内可出现典型的细胞病变。若初次接种无细胞病变，可盲传3代。不具备细胞培养条件时，可将处理的病料接种家兔或小鼠，根据家兔或小鼠的临诊表现做出判定，但小鼠不如家兔敏感。分离到病毒后再用标准阳性血清做中和试验以确诊本病。猪伪狂犬病切片组织切片荧光抗体检测取患病动物的病料如脑或扁桃体的压片或冰冻切片，用直接免疫荧光检查。其优点是快速，在几小时内即可获得可靠结果，对于新生仔猪，其敏感性与病毒分离相当，但对于育肥猪与成年猪，该法则不如病毒分离敏感。猪伪狂犬病PCRPCR检测猪伪狂犬病病毒利用PCR可从患病动物的分泌物如鼻咽拭子或组织病料中扩增猪伪狂犬病病毒的基因，从而对患病动物进行确诊。PCR与病毒分离鉴定相比，具有快速、敏感、特异性强等优点，能同时检测大批量的样品，并且能进行活体检测，适合于临诊诊断。