周子一中华老年医学杂志

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抗坏血酸抑制核因子κB受体活化子配体诱导细胞的分化和功能肖新华 周厚德 袁凌青 谢辉 廖二元作者单位：410011长沙，中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所【摘要】 目的 研究抗坏血酸对核因子κB受体活化子配体（RANKL）诱导体外培养的破骨前体细胞形成成熟多核破骨细胞的影响，探讨抗坏血酸在破骨前体细胞分化中的作用及机制。 方法 利用不同浓度的抗坏血酸与RANKL单独或共同处理细胞，MTT法测定细胞增殖，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法观察TRAP阳性多核细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定破骨细胞表型基因和功能基因的表达，Western印迹方法检测碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达，破骨细胞的骨吸收功能用骨吸收陷窝面积计数法分析。 结果 抗坏血酸和RANKL都抑制细胞的增殖 (P<)，但它们之间无协同作用。抗坏血酸本身不能诱导细胞形成破骨细胞，但可抑制RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成(P<)。抗坏血酸下调RANKL诱导的碳酐酶Ⅱ和 RANK基因 mRNA表达及碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达，抑制骨吸收功能(P<)。 结论 抗坏血酸能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和功能。【关键词】 抗坏血酸； 破骨细胞； 骨吸收抗坏血酸(AA)是一种重要的营养素和氧化还原剂,在骨盐代谢及骨形成中具有重要作用。在体外，它能增加钙盐的沉积，促进矿化结节的形成，并通过间充质细胞间接调节破骨细胞的分化〔1-4〕。流行病学调查表明，饮食中抗坏血酸的摄入与骨密度（尤其是绝经后妇女）呈正相关〔5，6〕。抗坏血酸在骨重建中的作用十分重要，但其细胞生物学机制仍不清楚。虽然在鼠的骨髓细胞与ST2基质细胞共培养下，它可通过ST2细胞表达核因子κB受体活化子配基(RANKL)诱导破骨细胞形成〔1〕，但是否可不通过成骨/基质细胞而直接作用于破骨前体细胞，进一步影响破骨细胞的分化和功能目前尚不清楚。本研究旨在探讨抗坏血酸对RANKL诱导破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞的影响及机制。材料与方法一、细胞培养小鼠的单核细胞系细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次, 细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。二、细胞增殖测定接种于96孔板的细胞用抗坏血酸(美国Sigma-Aldrich公司)和/或RANKL(美国Pierce公司)干预48 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml，美国Sigma-Aldrich公司) 20 μl, 继续培养4 h后弃上清，加人二甲亚砜（DMSO）150 μl/孔孵育10 min, 在酶标仪上测570 nm波长下的吸光值。三、破骨细胞形成分析RAW 细胞以1×104/孔接种于6孔板，培养过夜后分别用50 ng/ml RANKL和不同浓度（10～100 μg/ml）的抗坏血酸干预，细胞每3 d换液1次。第6天抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色(美国Sigma-Aldrich公司,387-A)，细胞用柠檬酸盐/丙酮溶液固定30 s, 在以萘酚AS�BI磷酸盐作为底物的孵育液中37°C孵育1 h，蒸馏水洗3次，苏木素复染2 min，干燥后二甲苯透明，DPX(聚苯乙烯+酞酸丁二酯+二甲苯)封固，光镜观察。显微镜下计数TRAP阳性多核破骨细胞（≥3个核）。四、骨吸收陷凹分析接种于钙磷覆盖的破骨细胞活性分析板（OAAS）(美国OCT公司)，100 ng/ml RANKL和抗坏血酸干预细胞6 d后，弃上清,磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，5%次氯酸钠孵育5 min，PBS漂洗。干燥后采集骨吸收凹陷图像，骨吸收面积用Image Pro-Plus软件（美国Media Cybernetics公司）分析。五、RNA提取和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）用Trizol（美国Gibco公司）按操作说明提取细胞总RNA，用无RNA酶的DNA酶 I 消化痕量DNA，二乙基焦碳酸（DEPC）处理水溶解RNA。在Gene Amp 2400 PCR扩增仪上进行RT-PCR。取μg总RNA, 用逆转录试剂盒(美国Promega公司)合成cDNA, 再行PCR扩增RANK, 基质金属蛋白酶9(MMP9), 肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),TRAP,整合素αv ,整合素β3 , 组织蛋白酶K,碳酐酶Ⅱ, 扩增条件及引物序列见表1, 引物由上海博亚生物工程有限公司合成。半定量RT-PCR测定以β-肌动蛋白作为内部质控。PCR产物用琼脂糖电泳，溴乙啶染色后于紫外灯下拍照。表1 PCR引物及退火温度基因 正向引物 （5′→3′） 反向引物（5′→3′） 退火温度（℃） TRAP ACACAGTGATGC-TGTGTGGCAACTC CCAGAGGCTTCC-ACATATATGATGG 57 蛋白酶k CTGAAGATGCTT-TCCCATATATGGG GCAGGCGTTGTT-CTATTCCGAGC 56 RANK ACCTCCAGTCAG-CAAGAAGT TCACAGCCCTCA-GAATCCAC 57 MMP-9 CGAGTGGACGCG-ACCGTAGTTGG CAGGCTTAGAGC-CACGACCATACAG 64 β-肌动蛋白 GAAGAGCTATGA-GCTGCCTG CACAGAGTACTT-GCGCTCAG 57 碳酐酶Ⅱ CTTCAGGACAAT-GCAGTGC ATCCAGGTCACA-CATTCCAGC 55 TRAF6 AGCCCACGAAAG-CCAGAAGAA CCCTTATGGATT-TGATGATGC 53 整合素αv GCCAGCCCATTG-AGTTTGATT GCTACCAGGACC-ACCGAGAAG 55 整合素β3 TTACCCCGTGGA-CATCTACTA AGTCTTCCATCC-AGGGCAATA 53六、Western 印迹用细胞裂解液（150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris, pH , 1% NP-40, 去氧胆酸钠, 1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF), 1 mmol/L NaVO4, 2 mmol/L EGTA, 50 μg/ml 亮抑酶肽）冰上孵育裂解细胞20 min, 将匀浆于10 000 r/min，4℃离心5 min。BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司) 定量后，各取50 μg蛋白于10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜至PVDF膜（美国Millipore公司），含5%脱脂奶的PBST(含 吐温-20的PBS) 封闭液室温下振荡2 h，抗碳酐酶Ⅱ的抗体(1∶〖KG-*2〗1000)(美国Santa Cruz公司)孵育3 h, 含辣根过氧化酶标记二抗 (1∶5000) (美国Santa Cruz公司)孵育1 h, PBST室温下漂洗15 min后，化学发光法显影(美国Santa Cruz公司)。七、统计分析以上数据以 ±s表示,各组间比较采用One-way ANOVA过程的LSD法。结果一、抗坏血酸抑制细胞增殖抗坏血酸在10～100 μg/ml浓度范围内有促进细胞增殖的趋势，但差异无显著意义。高浓度的抗坏血酸（500 μg/ml）明显抑制细胞增殖(± vs ±，P<，图1A)。RANKL明显抑制细胞增殖(± vs ±)，但抗坏血酸10~100 μg/ml浓度与RANKL无协同作用(图 1B)。注:除对照外,每组为AA(μg/ml)加RANKL 50 ng/ml图1 抗坏血酸对细胞的增殖作用对细胞增殖的影响(与对照组相比, **P<)；B. AA联合/或RANKL对细胞增殖的影响(与对照组相比, *P<)二、抗坏血酸抑制RANKL诱导的细胞形成破骨细胞单独应用抗坏血酸不能使细胞形成TRAP阳性多核破骨细胞，但10～100 μg/ml浓度抗坏血酸均能抑制RANKL诱导细胞形成破骨样多核细胞（P<，图2）。注:每组为AA(μg/ml)加RANKL 50 ng/ml浓度图2 抗坏血酸(AA)对RANKL诱导细胞形成TRAP阳性多核细胞影响,与AA0组比较, *P<三、抗坏血酸选择性下调破骨细胞特征性基因mRNA的表达细胞受RANKL刺激后碳酐酶Ⅱ ,组织蛋白酶K, TRAP mRNA的表达均明显增加(分别为10、 和 倍)。抗坏血酸单独能上调组织蛋白酶 K, TRAP mRNA的表达(分别为和倍)。然而，RANKL与抗坏血酸合用与单用RANKL相比，前者明显抑制碳酐酶II和 RANK mRNA表达(分别为60%和20%)。MMP9, 整合素 αv 、整合素 β3 ,TRAF6基因不受RANKL和抗坏血酸的影响(图3)。四、抗坏血酸抑制破骨细胞骨吸收抗坏血酸不能诱导细胞形成破骨细胞，故无骨吸收陷窝。抗坏血酸和RANKL合用与单用RANKL组相比，骨吸收陷窝的数目及面积明显减少（P<，图4）。五、碳酐酶Ⅱ蛋白表达碳酐酶Ⅱ蛋白的表达光密度比，对照组、AA（50 μg/ml）组、RANKL（50 ng/ml）组、RANKL (50 ng/ml)+AA(10 μg/ml)组、RANKL（50 ng/ml）+AA(50 μg/ml)组分别为±、±、±、±±。RANKL组与对照组相比，碳酐酶Ⅱ蛋白表达无明显增加。低浓度的抗坏血酸（10 μg/ml）与RANKL合用与单用RANKL相比，碳酐酶Ⅱ蛋白表达明显减 50 ng/ml； 50 ng/ml+AA 50 μg/ml； 50 μg/ml；4.对照组图3 破骨细胞表型基因和功能基因的表达注：每组为AA（μg/ml）加RANKL 100 ng/ml,与AOO组比较，*P<图4 抗坏血酸对破骨细胞骨吸收活性的影响少（P<）。讨 论尽管抗坏血酸的发现与应用已有200多年，但其在人类健康和疾病中的意义与作用机制尚未完全阐明，研究结论不一致。了解抗坏血酸调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能的分子机制有重要意义。抗坏血酸是胶原合成的原料, 参与脯氨酸羟化以合成胶原，缺乏时可导致脯氨酸和赖氨酸羟化作用减弱从而影响胶原的合成，同时还是成骨细胞标志物表达和矿化所必需〔7-9〕。抗坏血酸在胶原合成中起关键作用，又是胶原翻译后修饰酶所需的羟化酶和单氧酶的协同因子〔10，11〕。最近，我们的研究发现，抗坏血酸协同并上调雌激素增加成骨细胞OPG基因表达与碱性磷酸酶（ALP）活性〔12〕。而抗坏血酸对破骨细胞的分化及功能的研究了解较少。有研究认为，抗坏血酸在破骨细胞发生的过程中发挥生理作用，可能依赖于其氧化还原特性，促进羟化反应以维持金属离子活化中心保证羟化酶和单氧酶的活性〔1〕。基质细胞与骨髓细胞共培养时，抗坏血酸与1α,25(OH)2D3 联用与单用1α,25(OH)2D3相比，前者的破骨细胞分化明显增加，基质细胞的RANKL mRNA表达量较后者增加了倍〔1〕。Ragab等的研究结果表明，抗坏血酸可使破骨前体细胞TRAP表达及融合成成熟的多核破骨细胞增加，其作用是通过调节间充质细胞的分化状态而间接支持破骨细胞分化〔4〕。目前，许多体外破骨细胞形成体系采用基质/成骨细胞与破骨前体细胞共培养，因此并不清楚抗坏血酸能否不通过基质/成骨细胞而直接作用于破骨前体细胞影响破骨细胞的形成。我们采用的RANKL诱导破骨前体细胞细胞形成破骨细胞可避免了基质/成骨细胞对破骨细胞的干扰。抗坏血酸本身不能诱导细胞形成破骨细胞，但与RANKL合用明显抑制破骨细胞形成和功能，其详细机制尚不清楚。由于抗坏血酸可促进成骨细胞合成胶原从而促进骨形成，在有基质/成骨细胞的条件下促进破骨前体细胞分化有利于骨吸收，而我们发现抗坏血酸不但可抑制破骨前体细胞的增殖，还可抑制破骨前体细胞的分化和功能而抑制骨吸收，因此抗坏血酸在成骨与破骨的生理调节中作用应是这3种作用的综合，在人体和动物模型上最终表现为有利于成骨作用。抗坏血酸在体外无基质/成骨细胞条件下抑制破骨前体细胞分化成成熟破骨细胞, 这一发现可能为抗坏血酸在骨代谢中的生理作用提供又一机制。参考文献1 Otsuka E, Kato Y, Hirose S, et al. Role of ascorbic acid in the osteoclast formation: induction of osteoclast differentiation factor with formation of the extracellular collagen matrix. Endocrinology, 2000，141: Udagawa N, Takahashi N, Akatsu T, et al. Oringin of osteoclasts:mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow�derived stromal cells. Proc Natl Acad Sci,1990,87， Suda T,Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation,Endocr Rev，1992，13， Ragab AA,Lavish SA,Banks MA, et al. Osteoclast differentiation requires ascorbic acid. J Bone Miner Res,1998,13， Ilich JZ, Brownbill RA, Tamborini L. Bone and nutrition in elderly women: protein, energy, and calcium as main determinants of bone mineral density. Eur J Clin Nutr， 2003，57: Morton DJ, Barrett�Connor EL, Schneider DL. Vitamin C supplement use and bone mineral density in postmenopausal women. J Bone Miner Res，2001，16: Xiao G, Cui Y, Ducy P, et al. 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〖药材及成分〗 为五加科多年生草本植物人参panax ginseng C．A．Mey．的干燥根。栽培者为“园参”。野生者为“山参”。主产于我国的吉林、辽宁、黑龙江，以及朝鲜半岛、苏联东西伯利亚等地。园参：9月间挖取生长5～7年的园参根部，刷洗干净，即称为“园参水子”。山参：7月下旬至9月间果实红熟时上山采挖，一般用骨针拔开泥土，小心挖取，尽可能保持支根和须根的完整，去净泥土、茎叶，即称“野山参水子”。炮制时将鲜园参剪去小支根，用硫黄熏后，置日光下晒干，即生晒参；如不去除小支根而晒干，称全须生晒参；煎下的小支根及须根晒干，称白参须。若将剪去小支根的园参鲜根蒸2～小时，取出晒干或烘干，即为“红参”；其中带有较长支根者，又称为“边条红参”。将剪下的支根和须根如法蒸熟并干燥。即为“红参须”。鲜山参不去支根，极为精细地将整体晒干，即为“生晒山参”。生晒参、红参用时润透，切薄片，干燥，或用时捣碎。生晒山参用时，直接粉碎或捣碎。 含有13种以上的皂甙，其总称为人参皂甙Rx。人参皂甙水解后生成皂甙元人参二醇、人参三醇及齐墩果酸。此外，尚含多种氨基酸、糖类、人参酸、维生素、黄酮类，以及确定人参特殊香味的β-榄香烯与人参炔醇等挥发性成分等，还含镁、铝、磷、钾及锗等无机物质。 〖药性功效〗 甘、微苦、微温。归脾、肺经。 人参味甘微苦，性症偏温，其功重在大补正元之气，以壮生命之本，进而固脱、益损、止渴、安神。故男女一切虚证，阴阳气血诸不足均可应用，为虚劳内伤第一要药。 1．大补元气 用于气虚欲脱的重证。表现为气息微弱、呼吸短促、肢冷汗出、脉搏微弱等。单用人参可大补元气，强心救脱，如独参汤。气脱兼见亡阳，可配附子同用。 2．补肺益气 用于肺气不足，气短喘促，少气乏力，体质虚弱。 3．益阴生津 治疗津气两伤、热病汗后伤津耗气。 〖临床应用〗 1．治疗老年人病窦综合征：红人参～，每日1剂或分2次放口中逐渐含化咽下，20～30天为1疗程，一般1～2疗程。（《中华老年医学杂志》，1990；（1）：49） 2．治疗脱肛：人参芦1个研末，开水送服，1日1次，连服20天。（《四川中医》，1985；（1）：33） 3．新生儿危重症抢救：每日以红参～3g（切成薄片，近似1g/kg体重/日），加水40～50ml蒸半小时取汁，加少许白糖，每次5ml，每3小时喂服（或滴服，或鼻饲）一次，疗程4～6天，最长10天左右。配合西医抢救处理，常规治疗及1级护理。（《中成药研究》，1987；（7）：34）。 〖使用禁忌〗 1．久服常规用量短期服用人参及其制剂安全性好，偶可见轻度不安、兴奋。长期服用则会出现不适，表现为失眠、抑郁、头痛、心悸、血压升高、性功能减退、体重减轻。国外曾报道133例服用人参及其制剂，两年后分别出现了腹泻、皮疹、失眠、神经过敏、高血压、欣快或忧郁，性功能也受到影响。 2．用量过大 短期或一次超量服用人参及制剂引起不良反应的报道很多。如口服3%人参酊剂200毫升出现头昏、发热，服用500毫升者造成死亡；因疲劳而注射人参注射液4毫升出现休克；一次炖服朝鲜红参10克，4小时后出现头痛、烦躁、抽搐；一次炖服红参15克出现头晕、视物模糊、手颤、燥热；一日内煎服红参80克出现呕吐、抽搐、神昏、大小便失禁、发热、双侧瞳孔不等大，被诊为脑出血，后因急性左心衰竭而死亡；3例新生儿出生当日服人参～克煎剂引起1例死亡，2例中毒。用量过大对神经系统、心血管系统、消化系统、水电解质代谢都有损害作用。报道中的病例多数是自觉乏力体弱，急于峻补正气，结果损伤了机体，甚至导致死亡。临床用人参补益身体，切不可急于求成而超量使用。 3．用药不当 人参适用于体虚者，常规用量使用确能纠正虚损状态。但长期服用可出现皮质类固醇中毒样损害。