电泳论文参考文献

缓冲液用TAE就可以。胶的成分不同，其他和非变性胶没什么区别的

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5月25日 09:54 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ~ 65 °C）可以在65 °C时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。简单介绍一个关于琼脂糖凝胶电泳的实验CK同工酶的测定标本采集、处理和贮存CK同工酶检测血清和血浆均可。在4℃可保存数天，-15℃可保存2周，若用血浆宜用EGTA，而不用EDTA抗凝。冷冻血浆测定时，应在30℃以下融化，需反复冰融者应加还原剂——巯基乙醇以稳定酶活性，速冻及贮存于-20℃或-70℃，在有β-巯基乙醇和EGTA存在时，MM和MB可稳定数年，而BB则仅稳定半年。由于CK同工酶半衰期短，故酶活性的高低受标本采集时间的影响较大。琼脂糖凝胶电泳法1.原理CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体，在电泳条件下，CK-BB迁移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢。电泳后进行酶促反应显色，观察结果。显色原理是：CK催化磷酸肌酸(CrP)及ADP，产生肌酸(Cr)及ATP，在偶联的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P；在偶联的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-P-G，同时NADP+还原为NADPH。在365nm观察NADPH的荧光或用荧光光密度计扫描定量。也可用四氮唑盐显色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)将NADPH的氢传递给氯化碘代硝基四唑(INT)，使其还原成紫红色的甲鐟，显示CK同工酶区带。2.试剂① 50mmol／L Tris-巴比妥缓冲液()：称取巴比妥，Tris ，溶于蒸馏水中并稀释到1L，电泳用。② 30mmol／L Tris-巴比妥缓冲液()：称取巴比妥，Tris ，以蒸馏水溶解并稀释到500mL。③ 5g／L琼脂糖[内含14g／L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]：称取0．5g琼脂糖，，加试剂“②”100mL隔水煮沸溶解，分装后4℃保存。④ 400mmol／L Bis-Tris缓冲液(内含20mmol／L醋酸镁、4mmol／L EDTA)，：称取Bis-Tris ，EDTA Na2•2H2O ，加蒸馏水95ml溶解，用lmol／L醋酸调至后，称取醋酸镁(含4分子水)，加入，用蒸馏水稀释到100mL。4'C保存可用2个月，-20℃保存可用6个月。⑤ 辅酶溶液(ADP 4mmol／L，AMP10mmol／L，NADP+4mmol／L，葡萄糖40mmol／L)：称取ADP ，，NADP+，葡萄糖，加试剂“④”9mL平衡至25℃后，用lmol／L醋酸调pH至(约用lml)，在4℃保存可用半个月。⑥ 底物显色液甲(按两张载玻片计)：用前于甲管中加试剂“⑤”，己糖激酶 U，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6 U。混合后置37℃水浴5min，加入PMS (2g／LPMS )。PMS须避光。在加PMS前的5min内配好底物显色液乙，加PMS后，立即与乙液混合并覆盖于电泳凝胶板上。⑦ 底物显色液乙：先配制下列试剂；A. 450mmol几磷酸肌酸：存4℃可用3个月。B. 5g／L氯化碘代硝基四唑：置棕色瓶贮存，4℃可用3个月。C. ／L琼脂糖(含／L氯化钠及35g／L聚乙烯吡咯烷酮)：称取琼脂糖，加入100mL蒸馏水，隔水煮沸溶解后，再加入氯化钠及聚乙烯毗咯烷酮，溶解后分装，置4℃保存。用前于乙管中加入“A”液,“B”，置37℃水浴2min后，加入N-乙酰半胱氨酸(NAC)20mg，或还原型谷胱甘肽10mg。用预温至37℃的滴管吸人，隔水煮沸融化后，温度降至37～43℃(在37～43℃的水浴箱中平衡)的“C”液，滴管吹吸混合，使NAC溶解。⑧ 混合底物显色液：当乙液配成后，立即吸甲液入乙液中，混合后立即使用。在水浴箱中操作，防止琼脂糖凝固。必要时用蒸馏水代磷酸肌酸溶液制备对照显色液。如作荧光法，用不含PMS及INT的甲、乙液，用蒸馏水代INT溶液。3.操作(1)隔水煮沸溶解试剂“③”，取铺于1～厚的载玻片上。于近阴极端并行挖两个槽，作两份标本，或作标本与控制物。(2)加样5μL，80V电泳50min。(3)合理安排配制混合底物显色液的时间，使配制完成时电泳结束。(4)将电泳凝胶板置涂以黑漆的铝盒中，吸底物显色液铺于凝胶板上，加盖，待凝后置37 ℃水浴1小时。(5)置固定液(乙醇：醋酸：水＝150:10:40)中2～4小时，转入蒸馏水中数小时，取出观察结果或用光密度计在500nm波长下扫描定量。需要时可平推至空白卡片纸上，37℃孵箱过夜，干片保存。或用无PMS、INT底物显色液，37℃水箱孵育20min。(6)再置60℃干燥箱中20min,在紫外灯(365nm)下观察荧光。有条件者用荧光光密度计扫描定量，激发波长360nm，发射波长460nm。4.结果观察琼脂糖凝胶电泳法的结果观察如图9-14所示。5.注意事项广泛存在于各种组织的腺苷酸激酶(AK)催化ADP产生ATP，干扰同工酶结果的判断。加入AMP可抑制此反应，但过量AMP也抑制CK。NaF抑制AK，不抑制CK，与AMP合用可抑制各种AK同工酶的97％。NaF与CK激活剂Mg2+可逐渐形成MgF2沉淀，所以，NaF与Mg2+分开配制，临时混合，不影响各自的作用。电泳需较高pH，酶反应需较低pH，本法中用低离子强度，pH低于的电泳缓冲液；高离子强度，pH低于的基质缓冲液。当含琼脂糖的基质显色剂覆盖于电泳后的凝胶板，上下凝胶中的成分相互扩散后的pH，恰为酶作用的最适pH。Bis-Tris全名为Bis(2-羟乙基)亚氨基-Tris(羟甲基)甲烷，25℃时pKa＝，是CK同工酶。测定优选的缓冲剂，200mmol/L时，CK活力最大。如无Bis-Tris；亦可用咪唑加EDTA作基质缓冲液。EDTA作Ca2+的络合剂，因Ca2+抑制CK活力。血清CK活力随温度升高而增加，直至45℃；更高温度迅速下降，56℃时很快失活。琼脂糖电泳法测CK同工酶，绝不能象作LDH同工酶用温度较高的琼脂糖基质显色液，否则CK活力丧失。而非脱氢酶反应(Nothingdehydogenase，NDH)显著。NDH是相当于白蛋白及β球蛋白区带处的紫红色区带，与蛋白质的巯基有关，标本用量大，pH高时尤其明显，仅四唑盐及PMS就可与标本产生，用测NADPH荧光法可避免。本法中标本用量少，显色时pH较低，NDH反应不明显。CK是巯基酶，绝对需要巯基试剂活化。但巯基试剂可还原四唑盐，N-乙酰半胱氨酸及谷胱甘肽还原四唑盐能力弱，可使背景清晰。PVP是隋性聚合体，作为酶扩散的障碍物加入，可改善区带分离效果。CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充C02后塞紧管口，置冰室或-30℃保存，至少可稳定半个月，及时测定更好。不主张加巯基活化剂保存。影响CK同工酶电泳与显色的因素很多，必须同时作控制物。附件：新建 Microsoft Word 文档.doc 该回答在5月25日 09:58由回答者修改过参考文献：仪器信息网，

【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 ( to ), HLADR ( to ), CD83 ( to ), CD86 ( to ) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(±) ng/L to (±) ng/L, P＜〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(上升至)，HLADR(上升至)，CD83(上升至)，CD86(上升至)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(±→±，P＜)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 统计软件分析.2结果 总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83低表达，仅；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83 ，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（±) ng/L vs (±) ng/L； n=6，P＜〕. 介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（±）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(±)%和(±)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors 〔J〕. J Clin Invest, 2002, 109(3):409-417. 〔8〕 Kalady MF, Onaitis MW, Emani S, et al. Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells 〔J〕. J Gastrointest Surg, 2004, 8(2):175-181.