流式细胞技术的研究进展论文

流式细胞技术作为一个科学研究的一个手段，在国内的业务增长已经进入到稳步上升阶段。分析仪方面个人化小型分析仪的市场刚近两年刚被点燃，前期是AccuriC6铺路，CytoFlex以高性价比特征入场后收割果实，Millipore以Guava和Acea以Novocyte分食剩余市场。目前这个细分市场仍能保持年增长率30%以上，因此吸引了更多厂家进场，如美国的Cytek，其主营业务原本是为美国市场的存量BD用户提高供性价比的改装升级服务，高层以华人为主，发现了中国市场的巨大潜力，所以在2015年开始涉水中国市场，推出CytoFlex的对标产品Athena，也是主打性价比和小型易用。分选仪方面，近几年分选仪开始放下身段，从原先普通用户难以企及的高价位使用复杂的形象逐渐分化出个人化易用型流式分选仪。BD公司作为目前流式市场的最大供应商，最先主动拓展个人化小型分选仪的细分市场，这个市场要求产品必须方便易操作、上手门槛低、人人都能轻松使用。目前这个细分在欧美已经成熟，主要用户是Biotech和Biopharma类公司，以及对流式分选使用较多的Individuallab；但在国内情况不同，一来公司数量少且大都还在早期成长阶段，产品和药物开发还没发展到对流式大量需求，二来是funding问题，有足够经费自己购买一台分选仪的individuallab是少之又少。所以这部分市场需求在国内与corefacility相比几乎可以忽略。但BD公司在国内基本上复制在欧美的策略。其最早推出的产品是FACSJazz，声称其是一款个人型易操作的流式分选仪，但Jazz是基于Influx简配而来，无奈受限于原理和设计，操作依然非常繁琐，普通使用者面对这样的仪器还是无所适从，因而Jazz名不副实，是一次失败的试水，从2011年推出到2015年黯然停产退市。Biorad有款分选仪产品S3也是针对这个细分，价格做到100万人民币以下，在分选仪市场算是比较亲民了，只不过完成度欠佳及国内渠道缺乏的原因，使得它在国内没有真正被推广开。

中国优生与遗传杂志2003年第11卷第4期・145・ 流式细胞术的原理及临床应用 马洪星1张春斌2汪晶冰1庞玉军1张丽岩2 (1.黑龙江省大庆油田总医院检验科,1630012.黑龙江省佳木斯大学基础医学院生物教研室) 中图分类号:R331文献标识码:A文章编号:1006-9534(2003)04-0145-02流式细胞术(flowcytometry)是20世纪70年代发展起 来的对单细胞定量分析的一种新技术,它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以同时测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域内发挥着重要作用 [1] 排异,CD4/CD8持续下降,表明有感染发生,当其比值小于 012时必须停用免疫抑制剂。 (4)免疫性疾病分析:SLE患者的淋巴细胞变化可以反 映该病的活动情况和器官侵犯程度,活动或非活动性伴有多系统疾病,但无肾脏损害的患者可出现CD4/CD8T比值增高,伴有严重肾脏损害的SLE者可出现低CD4+。高 CD8+(5)),(GPI) 。 一、流式细胞仪检测的原理[2,3] 动系统、被制成单细胞悬液,流动室充满流动的鞘液,,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理、就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。 二、流式细胞仪在免疫学中的应用 (1)淋巴细胞亚群分析:淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群。各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群(包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+)区分开来,并计算出CD4+/CD8+的比例,可通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态,指导治疗。 (2)感染及其疗效观察:由于T淋巴细胞在人体的免疫系统中承担着重要功能,因此当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态和程度。当病毒感染发生时(如乙型肝炎.EB病毒和巨细胞病毒)CD8+细胞增多,对CD8+T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。 (3)流式细胞仪可以对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、、CD25+持续增加提示已开始发生 [4] DFA(CD55)与MIRI(CD59),来确诊此病,。 (6)HLA群体分析:FCM运用HLA-B27特异性单克隆抗体检测抗原,其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高,有助于强直性脊柱炎的辅助诊断。 (7)AIDS中的应用:用于CD4+细胞的绝对计数(CD4+阳性细胞是HIV病毒特异侵染细胞),另外还可以监测病程和治疗过程中患者的免疫状态,估计预后。 三、FCM在细胞生物学中的应用(1)细胞周期分析 在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DAN异倍体。 (2)可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱 或发射光谱是pH值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内pH值测定。 四、FCM在肿瘤中的应用(1)肿瘤诊断 DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志。细胞的 增值能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍体分析。辅助肿瘤诊断,包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面[5]。 (2)肿瘤预后估计 异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道,在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中,异倍体和/或较高的S期比率都是不良的预后标志。同样地,在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中,亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上,用流式细胞仪监测肿瘤 ・146・ DNA倍体可更客观地预测预后。 (3)监测癌基因和抑癌基因表达在肿瘤发生发展过程 中国优生与遗传杂志2003年第11卷第4期 血小板有关的抗原的临床意义有: (1)诊断遗传性血小板功能缺陷疾病:巨血小板综合征(BBS)患者血小板CD42a/CD42b复合物先天缺陷,FCM中表现CD42a与CD42b不仅严重缺乏,而且其平均荧光强度显著低于阴性对照,CD61代偿性增加。血小板无力症(GT)患者FCM表现血小板GPIIb、GPIIIa(CD41、CD61)明显缺乏,CD42a和CD42b基本正常或稍高,并可出现异常血小板亚群。 (2)血栓性病与血栓前状态:由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度的增高与疾病的发生发展有关。CD62p和CD63是血小板活化最特异和灵敏的分子标志物,正常人只有低水平活化,外周血CD62p只有3%～5%。 八、FCM,同时FCM分、。 ,该技术对基础医学和。 、流式细胞术在优生遗传领域中的应用 上世纪,一些学者相继证实母血循环中存在胎儿细胞,应用流式细胞术可使其中含量极微的胎儿有核红细胞得到富集,因为有核红细胞含有胎儿的全部基因,并具有不影响多胎妊娠等优点,结合FISH,PCR等技术,使之具有应用于无创性产前诊断的广阔前景。 参考文献 [1]王淑鹃,王建中,等.现代血细胞学图鉴[J].人民卫生出版社, 2000,(光盘的流式细胞术部分) [2]左连富,等.流式细胞术与生物医学[J].辽宁科学技术出版社, 1996:25-32 [3]李家增,等.血液实验学[J].上海科学技术出版社,1997:530-540 [4]龚非力,等.基础免疫学[J].湖北科学技术出版社,1998:10-26[5]FrankfurtOS,RobJA,[J].ExpCellRes,1996,226:387 [6][M].La Jolla,CA1994 中的作用 用流式细胞仪可以通过特异性的单克隆抗体监测肿瘤细胞中癌基因表达产物的水平以研究肿瘤调控因素。如有文献报道,p53蛋白在乳腺癌细胞中的表达与肿瘤的预后有关。而ras基因的产物P21蛋白的表达从萎缩性胃炎、癌前病变、胃癌依次增加,证实P21蛋白在癌变过程中起着重要作用。 五、流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用[6] 传统的光镜和电镜技术研究细胞凋亡不能进行定量,并且不能对单细胞进行分析。FCM对细胞凋亡进行分析和检测是目前应用较多的方法,结合荧光染色,可对单细胞做多参数分析,尤其适合于分析淋巴细胞、血细胞、骨髓细胞、培养细胞等。FCM除可定量监测凋亡细胞数和凋亡指数外,可同时测定凋亡细胞发生于某个特定的细胞周期;可同时测定细胞的增值率与死亡率,从而了解肿瘤细胞的生长/死亡速率,早期测知药物疗效。FCM分开来。 FCM变,(PS)暴露于细胞膜的外面;白表达如Bcl-2、Bax、ICE、c-myc、ras、p53、cyclin、TNF、Fas等,以探讨凋亡分子机制与凋亡细胞周期的关系;还可测定线粒体膜电位的改变。 六、FCM在药理学中的应用 多重耐药性(multidrugresistance,MDR)MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)亲脂化合物,包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时,患者对化疗药物开始出现耐药性,需要考虑其他治疗方式。 七、流式细胞仪在血小板功能评价方面的应用血小板糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。用GP单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,用FCM分析单个血小板或血小板亚群,是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展,该方法简便、快速、标本用量少,灵敏度高,结果准确。与 (上接第107页) 收稿日期:2002-05-12 [4]ToyoakiM,JefferyR,HorowitzBS, growthfactor/Vascularpermeabilityfactorenhancesvascularper2meabilityvianitricoxideandprostacyclin[J].Circulation,1998,97:99-107 [5]HyderSM, thefemalereproductivetractbyestrogensandprogestins[J].MolEndocrinol,1999,13(6):806-811 [6]GargettCE,[J].Repro2 duction,2001,121(2):181-186 Intrauterinecontraceptionintheyear2001:canintrauterinedevice useberevivedwithnewimprovedcontraceptivetechnology[J]?EurJContraceptReprodHealthCare,2000,5(4):295-304 [2]TaylorRN,LebovicDI,HornungD, regulationofendometrialangiogenesis[J].AnnNYAcadSci,2001,943:109-121 [3]冯力民,夏恩兰,丛捷,等.应用月经失血图评估月经量[J].中 华妇产科杂志,2001,36(1):51 收稿日期:2002-10-18