pcr生物技术论文参考文献

分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW， mentsearehtool . 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I THINK IT IS GOOD. AND IT IS BETTER. PCR技术王霄鹏 推荐：栗瑞丰摘要：PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作1. PCR的基本原理PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。2. PCR的基本成分PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。PCR的基本操作PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。1. 基础研究方面的应用目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：l 扩增目的基因和鉴定重组子；l 克隆基因；l 基因功能和表达调控的研究；l 基因组测序；l 制备单链模板；l 致突变；2. PCR在临床上的应用l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。l 检测病原体l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3. 在法医学中的应用例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年

PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。 关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作 1. PCR的基本原理 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 2. PCR的基本成分 PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。 特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。 热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。 缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。 一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。 PCR的基本操作 PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成： 1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。 以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用 最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。 1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： l 扩增目的基因和鉴定重组子； l 克隆基因； l 基因功能和表达调控的研究； l 基因组测序； l 制备单链模板； l 致突变； 2. PCR在临床上的应用 l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。 l 检测病原体 l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。 3. 在法医学中的应用 例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。 所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。 参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年