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思得不瑞奥
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斗真山下

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药物色谱分析课程的教学探索论文

药物色谱分析是药学类专业本科生及研究生学习阶段的专业基础课。本课程主要讲述色谱法的基本理论、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和色谱联用技术,以及这些色谱分析法在化学药物、中药、生化药物及体内药物分析中的应用。药物色谱分析以介绍《中国药典》中被广泛采用的气相色谱法和高效液相色谱法为主,主要教学目的是使学生掌握各种色谱分析技术的基本原理与基本方法,在化学药物、生化药物、中药及体内药物分析中应用这些技术,并进行定性或定量分析,帮助学生依据不同的药物类型,建立最佳的色谱分析思路。这些色谱知识的学习与色谱方法的掌握有利于学生建立正确的体内外药物色谱分析方法。色谱分析法是非常重要的分离技术,具有分析效率高、样品用量少、分析速度快、灵敏度高等优点。在药品研发、生产、流通及临床应用各个环节中都已广泛应用,是药品质量控制必备的方法。目前,大多数学生并未认识到本课程的重要性,在学习过程中缺乏足够的兴趣,很多学生都是为了应付考试而学习,考试结束后,基本忘光了所学知识,因此,教学效果亟须提高,教学方法也要改进,让学生带着兴趣、带着问题进行学习,从而在以后的学习工作中,遇到有关色谱分析的问题能够游刃有余。

1.色谱分析在药物分析中占据重要地位

药物色谱分析课本的第一章是绪论,主要介绍色谱法的一些基本情况。如果教师照本宣科,按课本顺序依次介绍色谱法的定义、特点、分类和发展历史等,很难让学生觉察到这门课程有什么重要性,也很难使其对这门课程有足够的兴趣。学生已学习了药物分析,对色谱分析有所了解,所以本课程应该首先强调色谱分析技术在药物分析中的地位,让学生对课程内容充分重视。可以从以下3个方面介绍:

(1)用流程图的方式讲解从药品研发、生产到临床应用各个环节中色谱分析的用途;

(2)介绍色谱分析在不同药物种类中质量控制的应用,包括化学药物、中药、中成药及生物药物等;

(3)对比各国药典,介绍药典中应用色谱法的品种数,突出色谱法在药物分析中具有不可或缺的地位及其在药物定量分析、体内分析方面的地位尤其重要。

通过这些介绍,学生基本明白色谱分析的重要性,然后再介绍色谱法的定义、特点、分类、发展等。另外,不同色谱分析方法的重要性也不同,柱色谱、纸色谱及薄层色谱的内容可以一带而过。键合型色谱是重点,尤其是反相色谱是重点中的重点。在讲解中要讲清楚每种色谱分析方法在药物分析中是如何使用的,主要可以分析哪些药物,使学生有一个清晰的认识,有利于认识这门课的重要性。

2.多媒体辅助教学

为提高学生的学习兴趣,可较多地采用多媒体计算机辅助教学。相比于传统教学,多媒体辅助教学的优势在于克服传统教学的单一性,将学习内容进行多元整合。运用多媒体技术,将学习内容有关的文本、声音、图形、动画、视频等进行有机的融合,学生学习起来不会感觉枯燥乏味,这种多感官的剌激也可以提高学习效果。例如,在介绍有关色谱仪操作时,先用文字的形式讲述一遍,然后再播放仪器使用的小视频,这样学生对学习内容能更好地理解与掌握。另外,将各种多媒体技术合理安排,充分应用,能让学生愉快地学习,达到寓教于乐的目的。最后,很多多媒体技术对学生而言是新鲜的,如用Flash动画、3D图片去表现学习内容,往往能有效地吸引学生的注意力,从而提高他们的学习兴趣。

目前,互联网上有很多优秀的教学资源,可以通过建立群组与论坛的形式与学生进行问题的讨论。采用这种方法的好处有以下3个方面:

(1)通过对课本知识的讨论,有利于学生进一步理解书本上的重点与难点,增加学生的学习兴趣;

(2)网络上可以査找一些本学科的前沿知识(一般课本较少提到前沿知识),扩大学生的视野,使学生了解本学科的'动态;

(3)在网络上与学生互动可增加学生对教师的亲切感,使学生喜欢上这门课;

(4)这种课后的互动,让学生感觉到学习不仅仅是课堂听讲,课后的讨论也能受益匪浅。这种网络上的学习,需要教师投入较多的时间与精力,对教师是一个考验,要经常在群组中发布大家感兴趣的问题,触发学生互动的兴趣。

3.启发引导式教学

传统的教学方式以教师和教材为中心,向学生灌输知识,学生依靠死记硬背的方式,能够应付考试,拿到学分,但是不利于学生思维能力的提高,在以后的学习和工作中,遇到有关专业问题,仍然束手无策。启发引导式教学方式已在药物分析教学上取得较好效果,因此,可以将这种教学方式引入药物色谱分析的教学中,通过巧设问题,让学生边想边学,集中注意力,同时用适当的提问鼓励学生进行思考,真正地让学生主动学习、主动思考,使教与学紧密结合。例如,在讲解高效液相色谱时,要问学生在前面的章节,讲气相色谱时,为什么不说高效气相色谱?高效液相色谱的分离效果有多高?有没有分离效果更好的色谱?通过这些问题的思考,使学生基本掌握各种色谱方法分离效果的不同。

4.案例教学

教师通过对典型案例的分析,组织学生有针对性地进行讨论,引导学生从个别到一般,从具体到抽象,通过实际案例进一步理解和掌握课程的基本理论与方法,这种教学方法称为案例分析。这种教学法能体现学生的主体性,有很强的针对性。在药物色谱分析中应用案例教学法,能激发学生的学习兴趣,帮助学生提高对实际问题的分析和解决能力。例如,讲解气相色谱相关基本理论知识后,给学生展示一个用气相色谱法测定复方丁香吸入剂中有效成分含量的实例,可以帮助学生理解如何选择固定相成分,如何进行程序升温,加入内标有什么作用等内容。案例教学法也可以帮助学生理解一些难点。例如,讲解如何判定一种药物是否能用气相色谱法分析时,学生往往难以做出判断。课堂上通过对能用气相法分析的药物进行结构分析,并给出代表性药物,学生就容易理解这些内容。学生往往对具体实例有较深刻的印象,以后碰到类似问题能很快回忆起所学知识,因此,案例教学法较好地解决了理论与实践相结合的问题。

5.实践教学

药物色谱分析是一门技术性很强的学科,实验教学是药物色谱分析课程必不可少的环节。通常要开设填充柱气相色谱实验、毛细管柱气相色谱实验、反相高效液相色谱实验及薄层色谱实验。在有条件的情况下,可以开设毛细管柱气相色谱-质谱联用实验、高效液相色谱-质谱联用实验及毛细管电泳实验。这些实验大多都要用到大型精密仪器,所以要严格要求学生实验课前书写预习报告,实验课上认真听从教师讲解仪器操作规范及注意事项,规范操作仪器,认真做好实验记录和结果分析,以写出完整的实验报告。

在理论课上已经讲解了仪器的构成,但学生没有直接印象,可以利用实验课程,通过拆解仪器的方式,让学生进一步直观感受仪器的内部结构,并对每一个部件的详细结构,如何保养及使用注意事项进行讲述。实验课中所用仪器一般都有对应的软件程序,这个内容在理论课上是没有的,所以,应对每一种仪器对应的软件程序内容作详细介绍,让学生熟练应用这些软件。

通过一些实验操作,也可以让学生加深对一些知识点的理解。例如,通过改变流动相的组分、比例、流速、柱温等方式来改善色谱的分离能力。在实验课上就可以演示,如通过改变这些参数,让2个原本未分离的组分达到完全分离。待学生熟悉基本操作后,可以通过设计性实验,提高学生的创新能力?。如果有学生对色谱分析特别感兴趣,可以让他们组成一个兴趣小组,在教师的指导下完成一些科研课题,训练他们的科研能力。

综合运用上述5种教学策略后,课堂上更多的学生认真听讲,积极参与课堂讨论,课后有更多学生问一些色谱相关问题,这些都说明学生的学习兴趣明显增加,学习主动性得到提高,由死记硬背、应付考试的学习方式转变成主动接受知识,能够应用学到的知识解决一些实际问题。

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凹凸威小姐

硅材料的想不出 。 随着科学的不断发展,运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多,本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用,并对其发展前景作出展望。 关键词: 蛋白质,质谱分析,应用 前言: 蛋白质是生物体中含量最高,功能最重要的生物大分子,存在于所有生物细胞,约占细胞干质量的50%以上, 作为生命的物质基础之一,蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用,因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究,一直是化学家及生物学家极为关注的问题,其研究的内容主要包括分子量测定,氨基酸鉴定,蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展,仪器分析手段的更新,尤其是质谱分析技术的不断成熟,使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来,随着生命科学及生物技术的迅速发展,生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一,在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1.质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点:很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息,能最有效地与色谱联用,适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2.质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种:1)电喷雾电离质谱;2)基质辅助激光解吸电离质谱;3)快原子轰击质谱;4)离子喷雾电离质谱;5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中,以前面三种近年来研究得最多,应用得也最广泛[3]。 3.蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子,复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级,三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 3.1蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析,由于新的离子化技术的出现,如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化,各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是:通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知蛋白质。 3.2蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能,建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等,这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法,又称PTH法),测序速度较慢(50个氨基酸残基/天);样品用量较大(nmol级或几十pmol级);对样品纯度要求很高;对于修饰氨基酸残基往往会错误识别,而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针,其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下,质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中,灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低,所以肽的序列分析比蛋白容 易许多,许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation,ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization,MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善,极性肽分子的分析成为可能,检测限下降到fmol级别,可测定分子量范围则高达100000Da,目前基质辅助的激光解吸电离飞行时 间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具,也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库,能为解析FAST谱图提供极大的帮助,并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。

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德古拉之吻~

进入 21 世纪,现代科学技术的发展对分析测试技术提出了新的挑战。与经典的化学分析方法和传统的仪器分析方法不同,现代分析科学中,原位、实时、在线、非破坏、高通量、高灵敏度、高选择性、低耗损一直是分析工作者追求的目标。在众多的分析测试方法中,质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的方法。电喷雾解吸电离技术、电晕放电实时直接分析电离技术和电喷雾萃取电离技术的提出,满足了时代的需要,满足了科学技术发展的要求,为复杂样品的快速质谱分析打开了一个窗口。便携式质谱仪是新型质谱仪的研究热点之一,便携式质谱仪的研究主要集中在离子化技术、质量分析技术方面,检测器多采用 Detech 公司和 SGE 公司的商品化检测器。为适应离子化技术、质量分析技术的快速发展,开发高性能离子检测技术已迫在眉睫,而低噪音、高稳定性、宽质量范围、较低的质量岐视、长寿命、低成本将是离子检测技术发展中所要追求的目标。质谱和光谱、核磁共振等方法是并列关系,暂时很少有交叉领域。实际上,质谱和这些经典谱学方法之间的交叉,也是应该值得重视的研究领域。生物质谱可提供快速、易解的多组分的分析方法,且具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点,其适用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围,生物质谱在检验医学中主要可用于生物体内的组分序列分析、结构分析、分子量测定和各组分含量测定。1.核酸检测的应用:核酸的分子生物学研究已经成为生命化学、分子生物学及医学领域中最具有活力的研究方向之一。通过现代生物质谱技术,我们不但能够得到寡聚核苷酸的分子质量,而且能够通过相关的技术得到它的序列信息。2.小分子生物标志物检测的应用:质谱在检验医学中应用较早、较广泛的是用核素稀释GC—MS分析小分子生物标志物,该方法是很多生物小分子检测的参考方法,主要分析项目有氨基酸、脂肪酸、有机酸及其衍生物、单糖类、前列腺素、甲状腺素、胆汁酸、胆固醇和类固醇、生物胺、脂类、碳水化合物、维生素、微量元素等,其中很多项目的方法比较完善,如激素的检测和利用串联质谱法进行新生儿氨基酸、游离肉毒碱和酰肉碱的筛查系统,2004年l2月24目美国食品药品管理局(FDA)还专门制订了“用串联质谱法分析新生儿氨基酸、游离肉毒碱和酰基肉碱筛选检测系统”的指导性文件。生物质谱作为参考方法,在临床检验的量值溯源工作中也发挥着重要作用。由于质谱方法在测量的准确性和可靠性上所具有的巨大优势,很多国际组织或校准品制造商都用质谱法作为参考方法,对一些测定项目的校准品进行定值,如:葡萄糖、尿酸、T4、肌酐等。3.大分子生物标志物检测的应用:大分子生物标志物按结构可分为蛋白质、糖蛋白和低聚核苷酸。蛋白质是疾病的重要生物标志物,当异常基因产生异常蛋白质后,临床实验室可通过测量代谢物浓度、代谢物组变化、检测疾病相关异常功能蛋白、结构蛋白或蛋白指纹图谱 等来提供用于诊断疾病的数据。代谢物组、蛋白质组、基因组分析间的相互作用将是今后几年我们面临的主要挑战与发展机遇。临床检验将通过连续地进行这些分析,先鉴别与疾病有关系的代谢物组,然后通过对蛋白质和(或)DNA的分析验证鉴别结论,再连同其他临床信息和实验室数据,最后确定疾病的严重程度,并制定治疗策略。肿瘤标志物的测定是生物质谱技术在临床检验应用中最为突出和有价值的领域,生物质谱技术最有希望成为肿瘤的早期检测方法。根据生物质谱技术对乳腺癌等l2种肿瘤的血清及尿液检测结果已证实,其检测灵敏度82%~99%;诊断特异性为85%~99%,这是一个令人震惊的结果。4.微生物鉴定的应用:通过每种细菌分离物的生物质谱可得到基于每种细菌惟一的肽模式或指纹图谱来鉴别细菌,Hsu已用串联质谱鉴定了沙门菌。由于蛋白质在细菌体内的含量较高,生物质谱可常用于细菌属、种、株的鉴定;而串联质谱还可针对糖类或脂类的脂肪酸组成进行鉴定;此外,通过对生物样本进行处理后,串联质谱也可从单细菌水平发现和确定病原菌及孢子;对特殊脂质成分的分析则可了解样本中病原菌的活力和潜在感染。5.药物分析的应用:质谱在药物分析中的应用包括:合成药物组分分析,天然药物成分分析,肽和蛋白质药物(包括糖蛋白)氨基酸序列分析,药物代谢研究和中药成分分析。在检验医学中应用较多的是治疗药物监测(TDM),以前药物检测主要使用免疫化学技术和高效液相色谱技术。虽然,免疫化学技术简单易行,但是所测定药物种类比较少。高效液相色谱技术测定药物种类虽较多,但定性的可靠性差。然而,液相色谱与质谱(LC.MS)联用技术检测药物准确、快速,几乎可以用于所有药物检测,如抗癌药、免疫抑制剂、抗生素以及心血管药,LC.MS技术有望成为药物检测的最强有力的工具。

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