有关巨噬细胞功能性研究的论文

心脏肥大是对心脏各种刺激的代偿反应，但在持续压力下，会导致心力衰竭。有研究表明，巨噬细胞在代偿性到失代偿性肥大转变中发挥重要作用，但其在心脏超负荷早期及心衰进展中的确切作用尚不明确。因此来自尼苏达大学医学院和密歇根大学的研究团队对此展开研究， 发现来自心脏自身的免疫细胞或许可以帮助我们对抗心力衰竭 。其研究成果以题为“Cardiac Resident Macrophages Prevent Fibrosis and Stimulate Angiogenesis“在线发表于《Circulation Research》（IF=）杂志期刊。

首先研究人员通过质谱流式细胞（CyTOF）剖析了假性手术（Sham）以及TAC术后1周以及4周后的心脏非心肌免疫细胞亚群丰度。研究发现TAC术后1周小鼠的CD64+F4/80+mψs细胞富集最多，其次为单核细胞、树突状细胞、多型核白细胞（PMNs）以及B细胞（Fig 1. A-B）。CD11b+CD64+mψ细胞亚群表达不同水平的CX3CR1、CD206、MHC-II、CCR2和Lyve-1（Fig 1. C）。随后研究人员基于CD11b、CD6418、Timd4、CXC3CR1和CCR2进一步分析了驻留巨噬细胞（Res）和单核细胞衍生巨噬细胞（MoMF）变化，研究发现TAC术后1周，Res和MoMFs mψs占比显著升高，并在术后4周恢复至假性对照水平（Fig 1. D）。此外，基于CCR2和MHCII表达的圈门策略同样发现术后1周，CCR2-亚群表达占比增多（Fig 1. E)。 这些结果表明mψs细胞在心脏肥大性重塑过程的早期发挥重要作用。

 CyTOF深度剖析压力过载引起的心脏免疫细胞重塑

为了进一步研究心脏mψs在心脏压力负荷早期时的响应，研究人员对4个假性手术和TAC术后1周小鼠的心脏免疫细胞进行了单细胞转录组测序，发现单核巨噬细胞对心脏负荷响应最强，其次为T细胞和B细胞（Fig 2）。

 scRNA-seq剖析压力负荷引起的心脏免疫细胞表型

随后研究人员进一步分析了驻留及招募mψ细胞亚群的转录表达谱，发现Res Mψs和MoMFs间具有不同的细胞内在调控机制，比如Res mψs特异性表达Lyve1，CD163和CCl24，Timd4以及多种CC趋化因子配体；MoMFs细胞特异性表达Ccr2，MHC-II，Ccl5，Cxcl10，Ifit1、Il1b和纤维化介导基因Spp1、Thbs1和Fn1 等（Fig 3. A-C）。对调控差异基因的IPA分析发现，同MoMFs相比，Res Mψs中上游调控因子IL10RA、IL4、STAT3和IRF2通路激活，而IFNG、IRF3和IRF7调控基因下调（Fig 3. D）。

对假性手术和TAC术后小鼠样本的Mψs差异表达基因分析，TAC术后小鼠Res Mψs细胞Lyve1，Cd163， klf2、 klf4，AP-1转录因子（Jun，JunB，JunD），Fos 和 FosB，Nfκb，Ccr2、 Trem2、 cxcl10和 Lgals3基因表达上调（Fig 3. E）。差异表达基因的 IPA 分析预测了关键调节因子 NR1H2和NR1H3以及 STAT3和 STAT6信号的激活， IRF3和 IRF7以及 NFATC2，MYD88的抑制(Fig 3. F)。这些结果揭示了当心脏从适应性肥大状态过渡到心衰时，Res Mψs和 MoMF 中发生关键变化 。

 心脏驻留细胞的基因表达特征

研究人员利用CD115抗体耗尽mψs，进一步研究了mψs在心脏压力超负荷引起的适应性肥大反应中的作用。通过荧光流式和质谱流式研究发现，注射CD115抗体的TAC术后小鼠心脏免疫细胞，尤其是心脏mψs细胞表达显著降低（Fig 4. B-C)。尽管Res  mψs细胞耗尽，但不会显著改变心脏压力超负荷引起的心肌肥大，射血分数和缩短分数（Fig 4. E）。

 CD115介导心脏巨噬细胞耗竭

尽管mψs对心脏超负荷前期的肥大影响较小，但TAC术后mψs细胞中促炎细胞因子IL6和抗炎细胞因子IL10以及转化生长因子Tgfb1表达升高，表明整体免疫活化(Fig 5. A-B)。此外，Res  mψs细胞损耗会加重心脏的纤维化（Fig 5. C-D）。与假性手术组相比，TAC术后小鼠会表达更高水平与心脏纤维化发展相关的的细胞因子和生长因子（TGFβ、IL10），且TGFβ和IL10与肌成纤维细胞分化、肌成纤维细胞生长和胶原生成呈剂量依赖性关系(Fig 5. E-F)。这些结果表明 心脏mψs在缓解压力过载引起的纤维化中发挥着关键作用。

驻留巨噬细胞抑制心脏纤维化

TAC术后小鼠mψs 中检测血管内皮生长因子(Vegfa)的表达上调，且TAC术后能够增加心脏微血管密度，CD115抗体处理能够钝化微血管密度（Fig 6. A-B）。为了进一步研究mψs在微血管调节中的作用，研究人员将mψs与脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)共培养，研究发现心脏mψs 能够刺激血管生成。

驻留巨噬细胞刺激血管生成

通过CCR2 KO和C57Bl/6j小鼠模型，研究人员进一步验证了MoMFs能够促进纤维化这一假设。尽管未观察到CD115抗体阻断对TAC术后1周小鼠心脏肥大及其功能的影响。但相比于C57Bl/6j小鼠，CCRO小鼠显示较低程度的纤维化，表明 MoMFs的促纤维化作用 （Fig 7. C-E）。此外，同时缺乏Res mψs和MoMF的CCR2KO小鼠未受纤维化影响，表明 MoMF是心脏纤维化的有力促进者，其过程最终取决于Res mψs对纤维化的抑制作用。

 单核细胞巨噬细胞能够促进纤维化

最后研究人员检测了TAC术后6周的心功能以评估了α-CD115治疗后的长期响应。研究发现术后6周，免疫细胞数量（包括Res mψs以及MoMFs）变化没有显著差异，但TAC术后小鼠心肌细胞横截面积增大，纤维化程度较高，尤其是CD115抗体治疗TAC小鼠（Fig 8. C-F）， 表明Res mψs在心脏负荷早期预防心脏功能恶化和防止纤维化发展发挥重要作用。

巨噬细胞耗竭能够加速心衰发展

该研究中，研究人员结合了CyTOF，scRNA测序研究了心脏负荷早期免疫细胞的重构。研究鉴定了不同的mψs亚群，分析了其在心脏负荷早期的亚群丰度变化及基因表达差异，确定了Res m ψs以及MoMFs在心脏负荷早期 调节中的重要作用。随后研究人员通过阻断或基因敲除小鼠模型，将巨噬细胞耗竭，研究发现Res mψ s耗竭会导致心脏中血管的生成反应减弱，心脏的纤维化程度会增加。尽管后续巨噬细胞得以恢复，但是早期耗尽巨噬细胞的心脏依旧出现了心脏功能的降低和纤维化，说明心脏中的巨噬细胞在早期预防心力衰竭中就有着重要的作用。 该研究为更好地理解心脏巨噬细胞刺激和补偿调节机制以及心衰的靶向治疗提供了参考。

【参考文献】

Revelo X,  et al. Cardiac Resident Macrophages Prevent Fibrosis and Stimulate Angiogenesis.  Circ Res. 2021.

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巨噬细胞（Macrophage, M）是一类位于外周血，炎症组织中的白细胞。在动物体内主要通过吞噬细菌，死亡细胞及细胞残片等作用参与非特异性免疫调节（先天性免疫）而随后将吞噬的物质消化并将其特征递呈倒后续淋巴细胞及其他免疫细胞参与特异性免疫调节（后天性免疫）。

巨噬细胞隶属于免疫细胞中单核细胞类群，其主要来源为造血干细胞。造血干细胞能够分化为髓样干细胞及淋巴样干细胞两个类群，髓样干细胞后续主要分化为单核细胞，红细胞及血小板等细胞类群而淋巴样干细胞后期主要分化为T，B及NK细胞等。巨噬细胞主要由造血干细胞，单核细胞（Monocyte，注意与单个核细胞mononuclear cell是不一样的，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞），巨噬细胞分化顺序分化而来。

图1 免疫细胞分化类群

巨噬细胞首先在骨髓中发育形成单核细胞，巨噬细胞进入血液后以单核细胞的前体形式存在。当单核细胞浸润在组织及器官之中后，最后分化完全，成为巨噬细胞。巨噬细胞主要存在于淋巴结，肺泡壁，骨髓，肝脏以及脾脏等器官。

巨噬细胞根据功能及炎症因子分泌水平分为M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞两种亚群。M1巨噬细胞（经典激活巨噬细胞），主要由LPS及IFNγ激活，分泌高水平的IL2及较低水平的IL10，主要起到促进炎症发生发展，杀菌及吞噬等作用。而M2巨噬细胞（交替激活巨噬细胞）主要由IL4炎症因子激活，主要通过分泌IL10等抗炎细胞因子抑制M1巨噬细胞，在伤口愈合及组织修复等进程中起作用。

图2 M1/M2细胞分化示意

在临床研究中，研究人员主要通过M1，M2巨噬细胞表面marker及炎症因子表达水平进行M1，M2类群分析。如利用F4/80，CD80，CD206流式抗体通过流式细胞仪分析细胞亚群中M1，M2细胞比例。也可以通过qPCR，ELISA等研究方法研究IL10，TNFα等炎症因子表达水平分析M1，M2细胞类群分类比例。具体marker选择可以参考相关网站： 。

、巨噬细胞亚型在炎症疾病中研究

M1型巨噬细胞在体内主要起到吞噬细菌等外来物质及凋亡细胞碎片等内源性物质，起到保护组织器官免受外来物质侵袭。在炎症性疾病中，M1型巨噬细胞在早期炎症部位富集，并被LPS，TNFα，IFNγ等促炎因子激活，并随后通过分泌IL12等炎症因子的方式促进炎症的发生发展，保护机体免受外来物质侵袭。而在炎症后期，M2细胞则起到了抑制炎症，修复组织，及组织结构重建等作用。在炎症发生发展M1/M2巨噬细胞类群数目比例随着时间的推移不断变化，最终完全消除炎症的影响。而在某些慢性炎症及特定急性验证进程中，M1/M2细胞类群比例失调，过度M1细胞类群激活会导致组织严重损伤，并导致后续更严重的炎症因子风暴等不良症状。

因此，在炎症疾病治疗中可以通过抑制M1细胞类群数目，提高M2细胞类型比例的方式对炎症开展治疗。

、巨噬细胞亚型在肿瘤疾病中研究

肿瘤相关巨噬细胞（tumor associate macrophage，TAM）指被募集到肿瘤微环境中的巨噬细胞。早期研究认为巨噬细胞具有抑制肿瘤的作用，但是后续研究发现TAM能够通过抑制免疫反应，促进血管生成，刺激肿瘤细胞浸润及转移等机制促进肿瘤恶化。

图3 TAM在肿瘤发生发展中作用

TAM作为肿瘤微环境中重要的细胞组成部分，在肿瘤微环境组成及功能构成方面起到了重要的作用。肿瘤微环境中TAM细胞多数表现出M2型巨噬细胞特征，高表达IL10，起到抑制肿瘤微环境免疫反应的作用。而后续肿瘤微环境的研究也证明M1/M2比例失调是肿瘤发生发展，免疫逃逸以及后续转移耐药等疾病进程中起到关键作用。因此以巨噬细胞极化为治疗靶点的抗肿瘤药物开发及治疗也是当前治疗的重点。

巨噬细胞是先天免疫系统的重要成分，以高度异质性和可塑性为特征。研究不同亚型巨噬细胞在不同疾病及肿瘤中的功能能够通过调控免疫系统活性的方式调控疾病发病进程起到事半功倍的作用。因此，掌握巨噬细胞相关背景知识也是研究人员必备技能储备。