首页 > 期刊投稿知识库 > 关于水虎反噬论文范文

关于水虎反噬论文范文

发布时间:

关于水虎反噬论文范文

每到一个新的纪元,想必人们就会产生各类的联想,会想在这一年出生的孩子命运发展好不好,其实这都是可以借助八字命数学的讲究来探出究竟的。一起来看看2022年出生的虎宝宝此生命运发展如何?有哪些显著的命数特征值得人们去了解的呢?2022年虎宝宝五行命数解析2022年是生肖为虎的一年,2022年属虎的是“水虎”命。2022年是壬寅年,寅为虎,壬的五行属水,五行纳音金箔金,所以2022年出生是水虎之命。以上为本年度的五行属性分析。水虎宝宝的性格特点有哪些对于这一年出生的虎宝宝而言,其实他们的个性较为固执,而且行事强硬专断独行,喜冒险逞强,越挫越猛,雄心万丈,对自己充满信心。富男子气概且热情勇敢,冒险精神过于常人。做事积极大胆表达自己,处事有霸道。一言九鼎说到做到,绝不反悔。好强性格刚烈,他们喜欢打抱不平,但他们也会非常宽容,怜悯之心很强,非常自信独立有个性。这是因为这样的性格才会有事业非常成功的虎宝宝,因为对于目标非常明确并会为之努力,所以这个时间出生的虎宝宝会得到一生的好运气,人生发展的目标也还算明朗有态度。今年出生的虎宝宝好不好关于这一年出生的孩子而言,其实他们未来的运势是不错的,一旦和他们成为一家人,就很容易产生火花,可以得到相当不错的好运势。由于虎年宝宝他们自身聪明,干练,自身拥有正直的性格,不怎么掩饰自己的想法,在任何时候都可以变得游刃有余,朝着自己希望的方向去成长。结婚之后,夫妻双方不怕风霜,能够把感情生活经营得为人称道。奇点星座网,很多人都会关注的星座知识百科。八字姻缘、八字事业、婚姻运势、财神灵签、情感合盘、看另一半、八字测算、姓名速配、一生运势、复合机会,您可以在底部点个赞或者在线咨询(仅供娱乐):

十二生肖生年论命之寅虎(易园三分地)

易园三分地:寅虎生肖运程

一、生肖总论

1、 火虎:丙寅年【山林之虎】 (年命属火)

丙火寅木,生人乃为逆风之虎。天地为炉,为炭,腾辉于宇宙,陶治于乾坤,故曰炉中火。丙寅生人,一生威仪性盛,正直平和,春生福寿双全,夏生财帛自有,秋生衣禄有余。冬生衣禄寒微,日生衣禄足用,夜生晚景荣华,十月生人四废八败,男忌四,十月,女忌三、七月。

丙寅生人,为人多学少成,心性不定,口快舌便,身闲心直,手足不停不住,利官进贵,女主贤良晓事,聪明伶俐之命。

丙寅年的人有明锐的灵感,大脑。动的很快,虽然充满斗志,却常有趁势直追反而触礁的忧虑,如果能把具有发展性的个性善加利用,而进退之间又有规律,一定会有完成大事业的力量。风云际会冠群英才财帛衣禄自然有余。

2、土虎:戊寅年【过山之虎】 (年命属土)

戊土寅木,生人乃过山为纵风之虎。天京玉垒,帝里金城,龙盘千里之形,虎踞四维之势,故曰:城头土。戊寅生人,一生慷慨英勇,多智多谋,刚强之人,众人钦敬尊服。春生富贵发达,夏生刚强,秋生衣禄丰足,冬生孤独自傲,日生常惊恐,夜生平平,十二月生人八败。男忌:四、十月,女忌:三、七月。

戊寅生人,过山之虎,为人猛烈,易好易恶,无情,早年勤俭,离祖方得发达。女主聪明伶俐。

戊寅年的人,性格刚毅不屈,极富心,常会为了主张己意而采取蛮横的态度,因而与人发生争吵。所以,虽然具有不平凡的能力,却得不到的接受,将会过着曲折多变的生活。如果能克服这些困难,便能崭露头角,创造出人头地的大成就。

3、木虎:庚寅年【出山之虎】 (年命属木)

庚金寅木,生人乃为森林出山之虎。泼雪凑霜,参天覆盖,风撼笙篁之秦,雨余旌旗之张,故曰:松柏木,庚寅生人,一生性格威仪,志气浩大,做事和平,外刚内柔,春生衣禄丰厚,夏生衣禄平平,秋生财帛丰足,冬生福寿康宁。日生财谷有余,夜生中平。六月生人八败。男忌:四、十月,女忌:三、七月。

庚寅生人,为人心性急燥,有口无心,有事不,易好易恶,反复无情,衣食丰足,财物早年耗散不聚,晚景荣华,女主操持,旺相之命。

庚寅年的人个性开朗,行动敏捷,在人群中极受欢迎。但心情散漫、情绪多变,不管什么事都容易失败,脾气也极为暴躁。如能抑制缺点,对人亲切和蔼,将会成为老成持重、品德高尚的掌权人。晚年家运兴旺发达。

4、金虎:壬寅年【过林之虎】 (年命属金)

壬水寅木,生人乃为深山风雨之虎,润色杯盘,增光宫室,打薄须借乎别金,描彩必假乎水力,故曰:金泊金。壬寅生人,一生性格多勇,爱学多能,志坚威仪,胆肝万千,近贵发达,春生有外财,夏生各利双收,秋生衣禄平常,冬生衣禄常缺。日生有福寿,夜生平平,四月八败,男忌:四、十月,女忌:三、七月。

壬寅生人,为人心直口快,有事不,夫妻见克,儿女见迟,初年作事颠倒,中末财帛足用,女人性情如意,发福之命。

壬寅年的人外表看来难以捉摸,但是,有骨气,从不屈服与他人强权之下,又充满除强扶弱的正义感。就工作方面而言,能率先从事,且责任感强烈,能赢得对方的信赖,绩效显著。但有因为女色而导致失败的忧虑,须小心注意。

5、水虎:甲寅年【立定之虎】 (年命属水)

甲木寅木,生人乃为立定食山之虎,惊涛薄岸,骇浪浮天,光涵万里之宽,碧倒千山之影,故曰:大溪水。甲寅生人,一生性格聪明,独立奋发,做事先败后成,春生离祖发达,夏生中平,秋生福寿双全,冬生衣禄平平。日生富贵,夜生中平,十一月生人八败,男忌:四、十月;女忌:三、七月。

甲寅生人,一生利官进贵,家道享通,衣食足用,财帛多招,父母有刑,双亲重拜方好,女主夫大,男主妻长,子息不孤。

甲寅年的人有不服输的性格,不论对方如何攻击,皆会抵抗到底,导致凡事都无法处理,人生路途曲折崎岖。反面而言,却充满人情味,肯提携后辈,受人尊崇。如能遵守不贪功、不卖弄小聪明的禁忌,迟早能事业有成。

二、性格总论

虎年生人:富有冒险性,顽强,威严自信,平生不怕事;敢想敢干,意志坚强,独善其身,具有独特孤傲的性格。有时要别人服从自己的意志,善于言谈,喜用行动表达,遇到困难不退缩,置之一笑之风度。

三、流年吉凶总论

1、属虎人逢鼠年,其年不利,本年犯天狗,灾祸时生,多逆少顺,其年多守家门,专利本业,云灾减祸,多往门走,少向行,一年也有小得,其年求则无望,应多干实事,切忌和围观斗殴,以免发生意外伤害和破财,在今年你更好带一块有图样的玉佩,多交猪年朋友,以显吉利。平时多求,可逢凶化吉。

2、属虎人逢牛年,其年大吉,自有好事临门,机不可失。岁初有黑牛接道,多加小心,此一过就无大碍,其年虽有头疼之病,天赐平安,可不药而愈。在你的身上今年应常配戴玉或金属圈手镯及与火有关的红色,以击退黑牛,以使你的运势更旺。

3、属虎人逢虎年,其年黑虎当道,多凶少吉,应避披麻执孝之事,伤财神散,浮沉不定,临事不如意,烦苦恼,在今年你必须随身携带一块有龙的玉佩,可逢凶化吉,遇难呈祥。

4、属虎人逢兔年,其年月德高照,即使有灾害,也能遇救。切记凡事适可而止,多留从余地,有时思无时,吉利之年,可尽力施为,机不可失,时不再来。今年你运势大吉,应抓住时机,大展鸿图,可投资创业,但切勿得意忘形,应行善事。

5、属虎人逢龙年,其年大凶少吉,大起大落,财利欠佳,百事难兴。本年应刻守本业,少进多守,可保一年平稳;亦可奋力外行、择机进出,事业有成,可克凶趋福。在今年你更好在身上戴一块龙凤图样的玉佩。

6、属虎人逢蛇年,其年运势稳中上。虽有才能双全,多有支出而无进取,劳而无功,谋财有波折;但有利之势仍存,重点进取,可望成功。

7、属虎人逢马年,其年万事亨通,有机会高升,则进如水;只是须防小人。求财问名,凡事如意,应注意急流稍缩,否则只恐物极必反,福缘成空,在今年您的运势很好,可向外投资创业,但交朋友一定要小心,切忌,若不信劝告,必定后悔莫及,今年在你的命根里亦有阴相,只是财高灾趋吉。

8、属虎人逢羊年,其年月德照临,虽有小耗财,小病痛,但并无大碍。其年 他乡,情利之诱,唯天时即合地利,只欠人和;本年宜息事,今年您的财运不错,应多交良朋益友,少家,多结识贵人,以得他们的帮助,在爱情上更好就地取才,牛郎织女,对你根本不合适,办事以忍和稳为妥。

9、属虎人逢猴年,其年寅虎申猴相冲相克,有时意外,年初小人作梗,兴事难成,岁中辛苦,年终虽有财,但谋事亦艰难,本年之解,宜在东部录缘,从今年的整个运势看,你只能在艰难中前进,应多干实事。

10、属虎人逢鸡年,其年紫徽星高照,凡事逢凶化吉,只是运势太旺,恐有不测之疫,故应见好就收,凡事有分寸,取财亦有道,当无大碍,可佩戴一以。

11、属虎人逢狗年,其年万事亨通,无往不利,无事不顺,出走四方,财喜并至;切忌劳心伤神过度,以免”虎落平阳被犬欺”;出门在外应少管闲事,多结识贵人,办事稳重,保重身体,就可无忧。

12、属虎人逢猪年,其年运势稍退,当心疯犬伤身;起伏明显,进退有方,小心稳重,自可岁终。今年在农村的人,要注意,生意人应精明起见,可多做善事。

四、一生运程总论

值年神

太岁

太阳

丧门

太阴

岁破

龙德

白虎

福德

天狗

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

太岁:(寅年)

太岁当头坐,无喜必有祸,宜安奉太岁,此年行事易极端,勿参加与土动工仪式,如逢太岁,此年有喜事则行事顺利。太岁年不宜婚嫁。如犯必凶没好结果,少变动,谨慎保守,少与人冲突。

太阳星君:(兔年)

吉祥年,过去霉运之事都被化解,一扫而空,运气顺畅,正当光明之事都很容易成功。虽然有财利,不宜冒险投机,以免破大财,太阳旺于夏,男人运程佳,女人防,夫妻不和。

丧门星君:(龙年)

不宜探视重病人及参加丧礼。此年六亲内必有丧事上门,六亲孝服,破财难免。家小病痛。

太阴星君:(巳年)

太阴当权,阴盛阳衰,恐贵极反否,女人应注意言行,切勿骄纵逞强,不宜深夜子时后行夜出事。男人防美人计,防被女友抛弃。

五星君:(午年)

即官府星,此年闲事少管,勿贪花好酒,忌进,易招惹官司,或小人暗算,得怪病。官非损财,言谈谨慎,易得罪人。

死星君:(未年)

即是非星,不利丧家,不宜参加丧礼,避见死尸,易招惹官灾,诉讼等事,受伤,不利於合伙投资做生意,防被偷盗,切勿探视重病之人。

岁破星君:(申年)

太岁逢冲,有吉也凶,主灾祸缠绵,易生曲折而破财损运,及财物。或官事,或纠纷,或疾病,或失信等事。亲友负义,求财求利事与愿违。忌动土修房屋及婚嫁。如当年结婚,次年必离婚,轻则夫妻吵闹一生。

龙德星君:(酉年)

去年的霉运已经消逝,财气胜过去年,是得意的一年,诸事皆吉。灾祸不生,犹如锦上添花,家庭。

白虎星君:(戌年)

如遇此星君值年,应该防止意外灾害,尤其是车祸,家中不和,朋友翻脸,或生病孝服,是非缠身,破财难免。

福德星君:(亥年)

今年如掌握其法则会有财进及贵人相助,宜惜福守规,多做善事,福水长流。

天狗星君:(子年)

即窃盗星,不利远行,少出门,出外不宜,否则遇小人陷害。防盗贼,破财,,官司等。不要与他人有金钱交往,遇事不要逞强或轻举妄动。

病星君(丑年)

病星君无孔不入,勿探病,有病之人远离之。勿食婚丧喜事之物,防流行病。忌入病家探视,回避祭仪,此年多到堂拜,少到公共场所。多做善事,可以化解。

以上就是与水虎之命和什么相克相关内容,是关于属虎的分享。看完2022年属虎几月出生好后,希望这对大家有所帮助!

关于噬菌体的研究论文

(通讯员 裴凯)2018 年9月18日,国际知名学术期刊《Nature Microbiology》在线发表了我校蛋白质科学研究团队关于AimR结合底物多肽复合物结构和功能的最新研究进展,论文以“Structural basis of the arbitrium peptide–AimR communication system in thephage lysis–lysogeny decision”为题,阐述了决定噬菌体溶原裂解途径的一类新型分子调控机制。温和噬菌体在侵染细菌后,可以根据环境不同选择进入裂解途径或者溶原途径。最经典的例子是l噬菌体侵染大肠杆菌,l噬菌体基因组上的pL和pR启动子决定着其溶原或者裂解的命运。近年来,科学家在枯草芽孢杆菌中发现了一类新的决定机制:AimR-AimP-AimX决定系统。AimP编码43个氨基酸的多肽,分泌至细胞外被切割成6个氨基酸的成熟短肽(arbitriumpeptide);AimR是信号短肽的受体,同时作为转录调控因子调控aimX基因的表达;AimX是噬菌体溶原途径的负调控因子。信号短肽运至细胞内与AimR结合,解除AimR对aimX基因的调控作用,使噬菌体进入溶原周期。这类决定系统广泛存在于不同类噬菌体中。然而,噬菌体如何识别信号短肽,信号短肽又如何解除AimR与DNA结合的分子机制并不清楚。本研究利用细胞生物学、结构生物学、生物化学和生物物理等多重手段揭示了来源于SPbeta类噬菌体信号短肽的作用分子机制,并通过解析了AimR的晶体结构以及信号短肽结合状态下AimR复合物的高分辨率晶体结构,发现AimR呈现超螺旋结构,结构显示AimR属于RRNPP 蛋白家族(革兰氏阳性菌群体感应系统的关键蛋白),短肽结合在AimR的螺旋空腔里面。通过结构比对,AimR未结合和结合短肽分子均为二聚体,仅有一个轻微的变化,不足以脱离DNA。研究者们发现AimR的N端是结合 DNA的关键部位,但未能捕捉其构象。我校新引进的刘主教授擅长蛋白动态结构分析,团队人员密切合作,通过小角散射等一系列生化和生物物理实验验证了短肽结合下AimR 的N端更加舒张,从而可能使整个AimR脱离靶标DNA。该研究解释了SPbeta噬菌体溶原裂解途径中短肽识别的关键问题,为进一步研究噬菌体对溶原和裂解途径的选择提供重要线索。我校生科院研究生王强和官泽源为该论文共同第一作者,邹婷婷副教授为通讯作者。该研究是和农业微生物国家重点实验室彭东海副教授合作,体现了院室相互融合。同时蛋白质研究团队成员充分合作,研究手段互补。该研究工作获得了华中农业大学自主科技创新基金和国家自然科学基金青年基金项目资助,我校蛋白质平台为该研究提供了强有力的支持,上海同步辐射光源BL17U1、国家蛋白质科学中心BL19U1和BL19U2线站为晶体衍射和小角散射数据收集提供了必要保障。

链霉菌噬菌体ΦC31位点特异性整合酶的结构与功能初步探讨 论文摘要: ΦC31位(略)酶由于能介导携带有attB序列的目的基因位点特异性整合到 哺 乳动物细胞基因组中,因而该系统已成为基因操作及基因治疗的强有(略),该整合酶在 哺 乳动物细胞上介导整合的位点特异性和整合效率仍需进一步提高.而解析ΦC31位点特异性整合酶结构与功能关系是解决上述问题的基础和关键.为此,本研究利用(略)ΦC31位点特异性整合酶结构进行预测,结合分子生物学技术对其结构与功能关系进行初步探讨,其结果如下: 1、利用生物信息学对包含ΦC31位点特异性整合酶在内的`丝氨酸位点特异性重组酶家族30个成员进行同源比对,结果显示:aa1—120为催化结构域,其在整个家族里是保守的;aa291-359含有许多带电残基(22aa)和极性残基(10aa),预测为蛋白多聚化相关区域,4个保守的Cys残基位于aa353—405,该区域可(略)合相关区域,aa416—504为Leu富含区,包含了14个Leu,aa457—527预测为α螺旋结构. 2、依据ΦC31位点特异性整合酶结构预(略)T22b-ΦC311-528等八个截断突变体质粒.这些质粒分别与ΦC31报告质粒共转在体内进... TheΦC31 site-specific integrase can promote gen(omitted)ration of plasmids carrying attB into native mammalian sequences. Consequently it has become a powerful to(omitted)e manipulation and gene therapy. However, the specificity and efficiency of integration in mammals need to be (omitted)proved. Analysis the relationship between structure and f(omitted) theΦC31 integrase is the basis and key for solving above problems. To this end, this stu(omitted)informatics to forecast the structure of theΦC3... 目录:缩写词 第5-6页 中文摘要 第6-7页 英文摘要 第7-8页 前言 第9-14页 材料和方法 第14-30页 ·.材料与试剂 第14-20页 ·.方法 第20-30页 结果 第30-44页 ·.ΦC31整合酶基因同源分析及结构预测 第30-32页 ·.ΦC31整合酶及其截断突变体表达质粒构建 第32页 ·.ΦC31整合酶及其截断体体内活性检测 第32-34页 ·.ΦC31整合酶及其截断体的表达与纯化 第34-36页 ·.ΦC31整合酶及其截断体蛋白DNA结合功能域的检测 第36-40页 ·.ΦC31整合酶及其截断体蛋白构象的远紫外CD谱测定 第40-44页 讨论 第44-47页 小结 第47-48页 参考文献 第48-52页 综述 第52-60页 参考文献 第57-60页 致谢 第60-61页 更多相关阅读推荐: 毕业论文

你好,细菌遭遇噬菌体会有裂解或溶原由细菌细胞膜的构成有没有能够让世菌体识别到的酶而决定。

细菌遭遇噬菌体会有裂解或溶原由环境不同决定温和噬菌体在侵染细菌后,可以根据环境不同选择进入裂解途径或者溶原途径。最经典的例子是l噬菌体侵染大肠杆菌,l噬菌体基因组上的pL和pR启动子决定着其溶原或者裂解的命运。近年来,科学家在枯草芽孢杆菌中发现了一类新的决定机制:AimR-AimP-AimX决定系统。AimP编码43个氨基酸的多肽,分泌至细胞外被切割成6个氨基酸的成熟短肽(arbitriumpeptide);AimR是信号短肽的受体,同时作为转录调控因子调控aimX基因的表达;AimX是噬菌体溶原途径的负调控因子。信号短肽运至细胞内与AimR结合,解除AimR对aimX基因的调控作用,使噬菌体进入溶原周期。这类决定系统广泛存在于不同类噬菌体中。然而,噬菌体如何识别信号短肽,信号短肽又如何解除AimR与DNA结合的分子机制并不清楚。

关于杨虎城论文范文资料

建议你上中知网

先被将介石囚禁在南京,后在南京的雨花台全家被枪杀

1949年9月17日,杨虎城将军在重庆被国民党特务秘密杀害,终年56岁。同时被害的还有杨虎城的儿子杨拯中及不满10岁的女儿、杨虎城秘书宋绮云夫妇及孩子宋振中、副官阎继明、警卫员张醒民。 杨虎城,陕西蒲城人,1892年生。早年曾参加辛亥革命,1924年加入国民党,历任国民党第17路军总指挥,陕西省主席等职。1936年12月,与张学良发动了“西安事变”,逼迫蒋介石抗日。西安事变后,杨虎城被蒋介石逼迫出国。“七·七”事变后,要求回国抗日,遭蒋拒绝。1937年11月由法国回到香港,准备参加抗日工作,后囚禁达12年之久,其间杨的夫人于1947年逝世。1938年春,蒋介石命戴笠将杨虎城解往长沙,后多次迁移囚禁地点,在贵州息烽的玄天洞关了8年。1946年,国民党又派人将他押至重庆渣滓洞的中美合作所杨家山。1949年2月,再移至贵阳黔灵山麒麟阁。1946年在重庆政协会议上,毛泽东曾提出释放杨虎城,被蒋介石否决。1949年蒋介石“引退”后,代总统李宗仁曾下令释放张学良、杨虎城,但因蒋阻挠,没有执行。9月,蒋介石下达杀杨命令。 1949年9月,周养浩到贵阳,对杨虎城说蒋介石要在重庆见他,把他送往台湾,杨虎城信以为真,17日乘车重返重庆中美合作所。车一出发,周养浩就给毛人凤打了电报,让重庆特务安排好行刺。当晚11时许,杨虎城和儿子拯中及秘书宋绮云等人到达戴公祠。特务张鹄引他们进入房内,杨虎城走在最前面,儿子拯中双手捧着母亲的骨灰盒跟在后面。 当拯中正要进入卧室时,特务杨进兴从杨拯中身后下手,匕首刺进了杨拯中的腰间,杨拯中一声惨叫: “爸!……”杨虎城猛一回头,还未来得及看清自己儿子被刺的惨状,就被刽子手的利刃杀害了。宋绮云夫妇和他们的孩子也一同被害,杨虎城年仅九岁的幼女也未能逃过这一劫难。一时血流满阶,惨不忍睹。 凶手们在杨虎城父子二人的面部淋上硝镪水,然后把杨虎城的遗体掩埋在花园的一座花坛里。 1949年11月30日,重庆解放,解放军第二野战军领导当天调查杨虎城的下落,第二天发现杨虎城的遗体。12月16日,中共中央委员会和中央人民政府分别发来唁电。1950年1月15日,重庆市政府举行隆重的追悼会,刘伯承、邓小平等党政负责人及民主党派、人民团体、文教界、新闻界代表共1000余人参加了追悼会。同年,将杨虎城迁葬于西安城南长安县韦曲镇的“杨虎城将军烈士陵园”。

1893年生,原名忠祥,陕西蒲城人。早年参加陕西民军、护国军、靖国军。后任国民军第三师师长、国民军联军第十路军司令、第十军军长、暂编第二十一师师长、新编第十四师师长、第七军军长、第十七路军总指挥兼任陕西省政府主席、西安绥靖公署主任。1936年底与张学良发动西安事变。1937年被撤职,被迫出国。全国抗战爆发后,被国民党囚禁。1949年9月惨遭杀害。

关于虎妈猫爸论文范文资料

人流不会,吃避孕药很可能会发胖因为避孕药一般都是含激素类的药物对人体副作用较大,如果长期靠避孕药来避孕对身体影响很大建议使用避孕套或上环等措施来避孕

必胜诀

黎明即起,鸡叫之前。

语文英语,大声诵念。

还没睁眼,已念多遍。

数理公式,牢记心间。

公式难背写手背,有事没事抬手记。

上课争坐第一排,课上讲评要听细。

多跟好生谈理想,不与差生闲扯蛋。

单词多了别心烦,分片分组来攻占。

名人名言多摘抄,作文分数低不了。

开门见山扣紧题,直接了当最简单。

考前错题编辑好,心里有数不慌乱。

答题不会越过去,先易后难树信心。

实在不会就填B,概率保你分不低。

交卷之前查三遍,铃响收卷再落笔。

不能偷懒与侥幸,光明就在黑暗里。

胜男胜男莫放弃,全力以赴争第一!

扩展资料

《虎妈猫爸》是一部与教育小孩有关的都市家庭轻喜剧,讲述的是一对原本幸福的小夫妻虎妈毕胜男(赵薇饰)和猫爸罗素(佟大为饰),及两亲家毕胜男父亲(毕姥爷,韩童生饰)和罗素母亲(奶奶,潘虹饰)。

在面对孩子的教育难题接踵而至时,小夫妻之间、两亲家之间、父女之间等,因教育观念分歧,引发了一场场的家庭矛盾及情感冲突。

特别是最后几集,围绕“必胜诀”的冲突更是激烈。剧中的毕姥爷是一个有着40年教师生涯的老一辈教育工作者,信奉严师出高徒,将自己40年培养学霸的经验,提炼成一个200字的“必胜诀”,以此来教育自己的女儿和外孙女。

因为这个必胜诀,女儿毕胜男成了学霸,另外一个邻居家的孩子牛牛从“成绩中下”变成了“全校第一名”,而准备参加成人高考的毕胜男弟弟毕然也把“必胜诀”当作应考的必胜法宝。但也因为这个必胜诀,外孙女茜茜却因压力过大,患上了儿童抑郁症。

家庭教育是终身教育,孩子上了幼儿园、小学、中学后,家庭教育既是学校教育的基础,又是学校教育的补充和延伸。家庭教育的意义,一定是父母受益,孩子也受益,家长在教育孩子的时候要讲究方式方法。

孩子一旦有心认真学习,很多家长却学不会见好就收,总会给孩子施加更多的压力。孩子压力一大,便会有消极的心态。

总结来说,家长要学会讲究火候和技巧,不能孩子一说什么家长就一下子加码,让孩子产生逆反心理。

要培养阳光的孩子,需要帮助孩子形成他们内在的发展动力,父母应该避免给他们更多的压力,并且使他们的失败感和自责最小化。这和中国的传统文化价值一致。

这需要父母更多的勇气和愿望,用自己的方式来养育孩子,而不被那些外在的压力所左右。

参考资料来源:百度百科-虎妈猫爸

参考资料来源:百度百科-必胜诀

剧中的虎妈赵薇一出来就用一股子虎劲儿稳稳抓住观众,“虎妈精神”在教育女儿兔妞方面贯彻其中:孩子不讲礼貌欺负小朋友,一巴掌下去不手软;孩子不愿意自己刷牙,被警告“要么呆在这房间(厕所)里,要么自己刷”;孩子没有按时完成当天的作业,在睡梦中被虎妈硬拉起来做作业……而与虎妈相对的猫爸佟大为走的却是温暖路线:提倡快乐教育,出色地充当家庭润滑剂、万能灭火器,总能在母女冲突中成功安抚好女儿情绪。两相对比,兔妞难免发出“讨厌坏妈妈”的心声。孩子缺乏威严的爱父亲呈现的是男性的力量,阳刚、雄性、粗犷,有界限和规则意识,他给孩子带去保护、支持和安全感;母亲呈现的则是爱,感性、柔软、细致和温暖。妈妈唱白脸所变现出来的是一种强势,,而这种强势并不是孩子真正需要的“强”的教育。在孩子成长的阶段,不论男孩还是女孩,都需要一种很强、很有力量、很权威的爱。而这种爱是母亲给不了的,只有父亲才能给得起。这与男女天生的差别有关。俗话说“母爱如水父爱如山”说的就是这个道理。孩子缺少与父亲相处的机会妈妈唱白脸所变现出来的另一方面就是“管”。对这唯一一个孩子过分呵护、管教,孩子就越成为她的‘私有物’,她甚至不信任自己的丈夫,因而剥夺了孩子与爸爸互动的机会,爸爸就被边缘化。孩子与父亲之间的亲子关系就会渐渐疏远。所以,父亲在孩子教育中有着不可或缺的作用。呼唤爸爸归来,其实正是很多“虎妈猫爸”家庭所需要的。爸爸们也要有意识承担孩子教育中的责任,不能单纯担任一个“讨喜”的角色。同时,爸爸有意识地给妈妈的支持,那么妈妈在情感上会得到的滋养,她就不会那么焦虑,孩子也会成长得更加舒适。

位于徐州市的云龙湖是古彭徐州最为著名的风景胜地之一,它像一颗闪耀着天蓝色光芒的翡翠镶嵌在古彭徐州这篇美丽的大地之上,它是那么令人向往,令人赞美……云龙湖那美丽的身姿,在春暖花开的阳春三月,浑黄的湖水变成了碧绿色,还变的柳树姑娘柔软的长发上 别上了许多嫩绿色的“发卡”,开出了五颜六色的花苞,这一切倒映在清澈的湖水之中,俨然就是一幅绚

关于自噬现象研究的小论文

医学科研实验基础知识笔记(四):细胞自噬研究策略

细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下, 细胞利用溶酶体降解自身受损、 变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬是细胞的一种自我保护机制, 广泛存在于真核细胞内, 在调节细胞生存和死亡的过程中, 起着重要的作用。

当细胞发生自噬后, 在自噬相关基因的调节下, 细胞通过单层或双层膜, 包裹待降解的细胞质或细胞器, 形成囊泡状的自噬体(autophagosome) 。然后自噬体再和溶酶体(lysosome)

发生融合形成自噬溶酶体(autolysosome) , 由溶酶体内的一系列水解酶, 降解自噬溶酶体内所包裹的内容物, 以实现细胞对自身代谢和能量的更新。

1.自噬的细胞学分类及过程

根据细胞内物质运输到溶酶体的方式以及生理功能的差异, 哺乳动物的细胞自噬可以分为三种类型:大自噬/宏自噬(macroautophagy) , 小自噬/微自噬(microautophagy) 和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA) 。

1) 大自噬/宏自噬:我们通常所说的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的过程中, 细胞质中可溶性的大分子物质以及变性的细胞器, 被内质网、 线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体。接着自噬体的外膜与溶酶体膜融合, 进一步形成自噬溶酶体, 自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解, 最终完成整个的自噬过程。

2) 小自噬/微自噬:与大自噬过程不同, 是溶酶体膜自身发生内陷, 包裹和吞噬细胞内待降解的底物, 并在溶酶体内发生降解。小自噬与大自噬的区别就在于, 在小自噬过程中胞质成份是直接被溶酶体包裹, 没有形成自噬体的过程。

3) 分子伴侣介导的自噬:在分子伴侣介导发生的自噬过程中, 其待降解的底物都是可溶性的蛋白质分子。分子伴侣蛋白识别带有特定氨基酸序列的底物蛋白质分子, 并与之结合, 然后再经溶酶体膜上的受体 Lamp2a(lysosome-associated membrane protein 2, Lamp2) 转运到溶酶体;底物蛋白分子再在溶酶体内, 被水解酶降解。因此, 分子伴侣介导的自噬与前两者不同, 在降解蛋白时具有选择性。而大自噬和小自噬现象中, 一般而言, 在降解蛋白时没有明显的选择性。

2.自噬信号通路

3.自噬与凋亡的关系

细胞凋亡也被称为 I 型程序性细胞死亡;自噬则被称为 II 型程序性细胞死亡。凋亡和自噬是两种显著不同的细胞死亡形式, 两者在形态、 生化指标以及调控细胞死亡的过程上都存在着较大的差异, 但两者又不是两个完全独立的过程。许多研究表明, 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情况下也是相互影响和制约的。自噬和凋亡之间存在着三种不同类型的相互作用,而且每种类型都对应着相应的特定的细胞类型、 刺激和环境。

1) 自噬和凋亡互相协同, 共同促进细胞死亡。两种效应之间, 可以其中一种效应影响另一种效应;自噬也可以作为凋亡的上游调节因子, 直接调控细胞凋亡, 从而影响细胞的死亡;

2) 自噬可以通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。比如, 可以通过去除因氧化应激受损的细胞器, 或降解变性的大分子物质, 为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量;或者通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。自噬的这些功能将会抑制促凋亡信号的产生, 从而起到拮抗细胞凋亡的作用。

3) 自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡, 但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些 ATP 依赖的凋亡过程。

4.自噬的分子机制和特征

1) 自噬诱导阶段(induction) :正常生理状态下, 细胞保持很低的基础自噬水平。这时细胞内能量充足,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1(也就是 mTOR 复合物 1,也叫做 mTORC1)处于活化的状态。活化的 mTORC1 通过磷酸化的方式使得 ATG13 发生磷酸化反应, 从而抑制细胞的自噬。

2) 成核过程(vesicle nucleation) :成核过程和 Vps34-ATG6 复合物密切相关。这个复合物还包含有调节性蛋白激酶 Vps15, 共同作用于膜泡的成核, 介导 PAS(也就是前自噬体结构pre-autophagosomal structure)的形成。

Vps34-ATG6 复合体还可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3, 并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。请大家注意, Vps34 在哺乳动物中的同源蛋白是 class III PI3K;ATG6在哺乳动物中的同源蛋白是 Beclin-1, 所以 Vps34-ATG6 复合体, 也被称为 PI3K-Beclin-1复合物。

3) 自噬体的延伸阶段:这个过程的分子机制是最为复杂的。哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个类泛素化的系统:a) ATG12 的结合过程;b) LC3 的修饰过程。

ATG12 的结合过程是类似泛素化的过程, 需泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。ATG12 首先由 E1样酶 ATG7 活化, 再通过 E2 样酶 ATG10 转运并结合 ATG5, 然后和 ATG16 结合, 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面, 并参与前自噬体外膜的扩张。

LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修饰过程同样需要类似泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。LC3 前体形成后被 ATG4 加工成胞浆可溶性的 LC3-Ⅰ, 然后在 E1 样酶 ATG7 和 E2样酶 ATG3 的作用下, 和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的 LC3-PE(也就是 LC3-II),并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合, 直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成。因此, LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物, 也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。

哺乳动物的 ATG12-ATG5 类泛素化过程和 LC3 类泛素化过程并不是独立运行的, 它们之间可以相互作用、 相互调节。

4) 自噬体的成熟阶段:自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(Rab S)作用下, 与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括:LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。

5) 自噬体的裂解阶段:是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、 能量或循环利用。

5.自噬诱导剂

a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激

b) Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)

c) Earle's平衡盐溶液:制造饥饿

d) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂

e) Rapamycin:mTOR抑制剂

f) Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂

6.自噬抑制剂

a) 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂

b) Bafilomycin A1:质子泵抑制剂

c) Hydroxychloroquine(羟氯喹)

除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。

7.自噬的检测手段

自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物,因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段降解被抑制所致,所以设置合适的对照很有必要。

(1)透射电镜,电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构;

(2)WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1;生化检测自噬体膜标志蛋白, 特别是ATG12、 ATG5 和 LC3;荧光显微镜检测 LC3 或GFP-LC3 斑点的形成;生化检测自噬底物 p62。

(3)WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。

(4)组织蛋白酶Cathepsin活力检测。

(5)IF检测自噬潮autophagic flux

自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:

(1)观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV)

(2)在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。

(3)利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

(注意:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。需要多种检测方法结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)

(4)检测长寿蛋白的批量降解:非特异

(5)MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。

(6)CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。

自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。

由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位:

Lamp-2:溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针:有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito:载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。

MitoTraker探针:特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60:定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin(钙网织蛋白):内质网腔

(注意:这些蛋白均为胞浆蛋白,爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜(permeablize),可采用0.1%SDS处理。)

8.自噬研究常规思路

通常情况下,除了研究自噬现象本身,大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来,把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激,如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等,通常的研究模式:

(1)证明自噬参与了相关研究表型(电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等)

(2)证明自噬在表型中起到关键作用(通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究)找到表型与自噬桥梁分子(检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员)

(3)在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。

9.研究自噬的文献参考

[1]. Emerging Mechanisms in Initiating and Terminating Autophagy. Trends Biochem Sci. 2017 Jan;42(1):28-41.

[2]. Targeting autophagy in cancer. Nat Rev Cancer. 2017 Sep;17(9):528-542.

[3]. Autophagy: controlling cell fate in rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2016 Sep;12(9):517-31.

[4]. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol. 2016 Nov;16(11):661-675.

[5]. Autophagy and Neurodegeneration: Pathogenic Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Neuron. 2017 Mar 8;93(5):1015-1034.

[6]. Activating autophagy to potentiate immunogenic chemotherapy and radiation therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Apr;14(4):247-258.

[7]. Epigenetic Control of Autophagy: Nuclear Events Gain More Attention. Mol Cell.2017 Mar 2;65(5):781-785.

[8]. Pharmacological modulation of autophagy: therapeutic potential and persisting obstacles. Nat Rev Drug Discov.2017 Jul;16(7):487-511.

1、 自噬的定义: 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。2、 自噬的过程: 从一张图片开始: 步骤1:细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构,然后不断扩张,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一个由2层脂双层组成的碗,可在电镜下观察到,被称为Phagophore,是自噬发生的铁证之一。 步骤2:Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分,包括细胞器,全部揽入“碗”中,然后“收口”,成为密闭的球状的autophagosome,我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。 步骤3:自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(加了个“可”字,意思是这种情况不是必然要发生的)。 步骤4:自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,2者的内容物合为一体,自噬体中的“货物”也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。3 、自噬的特性: 1)自噬是细胞消化掉自身的一部分,即self-eating,初一看似乎对细胞不利。事实上,细胞正常情况下很少发生自噬,除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多,也是研究的热门。既有来自于细胞外的(如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等),也有细胞内的(代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等)。由于这些因素的经常性存在,因此,细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2)自噬过程很快,被诱导后8min即可观察到自噬体(autophagosome)形成,2h后自噬溶酶体(autolysosome)基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3)自噬的可诱导特性:表现在2个方面,第一是自噬相关蛋白的快速合成,这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成,这是执行阶段。 4)批量降解:这是与蛋白酶体降解途径的显著区别 5)“捕获”胞浆成分的非特异性:由于自噬的速度要快、量要大,因此特异性不是首先考虑的,这与自噬的应急特性是相适应的。 6)自噬的保守性:由于自噬有利于细胞的存活,因此无论是物种间、还是各细胞类型之间(包括肿瘤细胞),自噬都普遍被保留下来(谁不喜欢留一手呢?)。4 、自噬过程的调控: 从上面总结的自噬特点中可以看出,自噬这一过程一旦启动,必须在度过危机后适时停止,否则,其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察,任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前,已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬,如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等,这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。 关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有: 抑制类 1)Class I PI3K pathway(PI-phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)与IRS (Insulin receptor substrate)结合,接受胰岛素受体传来的信号(血糖水平高抑制自噬) 2)mTOR pathway(mammalian target of rapamycin) mTOR在人类中的同源基因是FRAP1(FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1),是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号,如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂. 激活类 1)Class III PI3K 结构上类似于Class I PI3K,但作用相反。3-MA是Class III PI3K的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂. 5 、自噬的研究方法: 正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,经报道的工具药有: (一)自噬诱导剂    1)Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin :  模拟内质网应激 2 )Carbamazepine/L-690,330/ LithiumChloride(氯化锂): IMPase  抑制剂 (即Inositolmonophosphatase,肌醇单磷酸酶) 3 )Earle's平衡盐溶液:  制造饥饿 4 )N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3KPathway抑制剂 5 )Rapamycin:mTOR抑制剂 6 )Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂 (二)自噬抑制剂 1 )3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂 2 )Bafilomycin A1:质子泵抑制剂 3 )Hydroxychloroquine(羟氯喹):Lysosomal lumenalkalizer(溶酶体腔碱化剂)除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有: 1)观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV) 2)在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成:(常用) GFP-LC3单荧光指示体系:由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术:无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。双荧光指示体系:汉恒生物科技(上海)有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。mRFP用于标记及追踪LC3,GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体,即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感,当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。 3)利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。 自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。 (Note:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响) 4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是选择性降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是p62蛋白,p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。 5)MDC或者Cyto-ID染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。 6)Cell Tracker TM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。 6、自噬体的发生: 目前认为,自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网,而是在胞浆中重新生成的,但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后,胞浆中先形成很多个membrane source(自噬体膜发生中心),在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome),VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上(VMP1又叫TMEM49,已知唯一与自噬有关的  跨膜 蛋白),同时,MAP1-LC3由胞浆型(即LC3-I)转位到自噬体膜(即LC3-II),LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到,现已成为监测自噬体形成的推荐方法。7、自噬与细胞死亡的关系:       有必要说明一下的是,细胞死亡是一个非常复杂的过程,为了研究方便,需进行分类,但我们思考时不要局限于这些 人为的分类,而应注重于现象本身来研究其背后的机制。       一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡,并把细胞的死亡方式分为2类:坏死和凋亡,因为两者有着明显的区别,其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性,内容物被释放出来,染料可自由进入细胞,而凋亡细胞保持完整,无内容物释放,染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡,这将在后面一一介绍,如同刚刚说明的那样,这些实验只能说明细胞膜的通透性(必要条件,不是充分必要条件),而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。一般认为坏死是被动的,不可控的,而凋亡是主动的,可控的。为了强调这一点,凋亡被定义为程序性细胞死亡(program celldeath,PCD)。但无论是坏死还是凋亡,都是一个过程,是需要时间的(尤其是凋亡,从启动到完成,细胞要执行很多反应),而且细胞死亡后都有“尸体”。在研究自噬与凋亡的关系时,人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体,但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点,如核固缩(pyknosis), 核破裂(karyorhexis)、细胞皱缩(shrinkage)、没有凋亡小体的形成等,被称为自噬样细胞死亡(autophagic celldeath,ACD),它是一种新的细胞程序性死亡,为了与凋亡区别,被命名为Type II cell death,相应的,凋亡为Type I cell death,坏死为Type III cell death。尽管这样,但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death  by  autophagy(自噬引起死亡)还是Cell death  with  autophagy(死亡时有自噬发生,但不是直接原因)?对此,自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别,但通过阻断自噬,观察细胞的结局可区分开来:Cell death  by  autophagy细胞存活,而Cell death  with  autophagy细胞死亡。8、自噬与肿瘤的关系:       与凋亡(在肿瘤细胞中一般都存在缺限)不同,自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞,保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”(破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等)都需要及时清除,而这主要靠自噬来完成,因此,  自噬具有维持细胞自稳的功能 ;如果将自噬相关基因突变失活,如神经元会发生大量聚集蛋白,并出现神经元退化。同时,自噬的产物,如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物,可以说,  自噬就是一个 “ 备用仓库 ” 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是,自噬活性可在代谢应激(饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等)时大大增强,表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体,这一现象被称为“自噬潮”(autophagic flux),广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持,有利于细胞的存活。 鉴于自噬的上述作用,自噬可为肿瘤细胞带来几大好处: 1 )肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点,对营养和能量的需求比正常细胞更高,但肿瘤微环境往往不能如意,如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断,而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。 2)当化疗、放疗后,肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分,而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质,并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会,而对于肿瘤细胞群体而言,需要一部分细胞发生坏死,以引发适度的炎症(有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等)。研究发现,很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬(由于凋亡通路已受阻,抑制自噬会促进坏死),但具体机制尚不清楚。自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞,自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时,自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段,自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强,是由于此时肿瘤的血管化作用不足,癌细胞的营养供给有限,需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累,使包括 Beclin 1在内的众多抑癌基因失活,自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死,但是坏死组织产生的细胞因子(包括部分生长因子)反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定,但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用,自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。 9、在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位: Lamp-2:溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM探针:有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。 pDsRed2-mito:载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。 MitoTracker探针:特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60:定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin(钙网织蛋白):内质网腔   Note:这些蛋白均为胞浆蛋白,爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜(permeabilize),可采用0.1%SDS处理 自噬与细胞死亡经常需一起考虑,下面介绍一些检测细胞死亡的方法: 1)△ψmdissipation(线粒体跨膜电位的消失):TMRM发红色荧光,DiOC6(3)发绿色荧光。 2)Phosphatidylserine Externalization(磷脂酰丝氨酸外翻):Annexin V-FITC(绿色)染细胞膜。 3)检测线粒体产生的ROS:无荧光的HE(hydroethidine,氢化乙啶)可被ROS氧化为EthBr(ethidium bromide,溴乙啡啶),发红色荧光。NAO(nonylacridine orange,烷化吖啶橙,可发荧光)能与非氧化的cardiolipin(心磷脂,可被ROS氧化)反应而失去荧光。 4)线粒体IMS蛋白的释放:AIF,细胞色素c,分别用荧光二抗染色。 5)Capase 3a 染色:用荧光二抗染色,胞浆弥散分布。 6)细胞膜完整性检测:DAPI(蓝色)、Hoechst 33342或PI(红色)染核。胞膜完整的细胞(活细胞和早中期凋亡细胞)排斥,可联用annexin V。 10、如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy? 第一步:利用上述方法证实细胞死亡 第二步:证实细胞死亡前发生了自噬 第三步:在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡 第四步:利用遗传学手段(反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34)或工具药抑制自噬 第五步:细胞存活则为Cell death by autophagy,反之,细胞死亡则为Cell death with autophagy。 自噬的抑制根据自噬形成的过程,自噬的抑制也分为不同的阶段,包括自噬的起始阶段,自噬泡和溶酶体融合阶段,以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下:     1)对自噬体形成的抑制:主要是PI3K通路的抑制剂(如3-MA, Wortmannin,LY294002等),这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂,可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成,被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外,渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。            2)对自噬体与溶酶体融合的抑制:对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用,这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素,分子式C35H58O9,是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂,具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时,巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明,在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1,可使蛋白降解被抑制,自噬体增多而自噬溶酶体数目减少,并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低,从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的,在去除了药物作用后,自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体,继续自噬进程。     3)对溶酶体降解的抑制:自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解,它首先经过囊泡酸化,达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解,降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制,使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内,而不能释放出来进入细胞内再循环利用,这也同样起着抑制自噬的作用。因此,蛋白酶抑制剂,如E64d、Pepstatin A等,在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂,二者以1:1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明,在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A,可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展,而自噬体的形成并没有受到明显影响。11 、自噬领域的大牛们:    1)YoshinoriOhsumi博士。日本科学家,克隆了第一个酵母自噬基因Atg1以及LC3,主要成果在酵母模型下自噬研究; 2 )Daniel J. Klionsky博士。美国科学家,主要成果在酵母模型的自噬研究。最早在《Science》上发表综述介绍自噬,2005年创办了第一本自噬杂志《Autophagy》;2007年举办了第一次自噬国际会议,为自噬的宣传做了大量工作。 3 )Noboru Mizushima博士。日本科学家,2001年主要报道了Atg5的功能,被认为是哺乳动物分子机制研究的第一环,以及参与克隆自噬标志物LC3,而且制备了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3转基因老鼠; 4 )Beth Levine博士。美国科学家,首先克隆了第一个哺乳动物自噬基因Beclin 1; 5 )Guido Kroemer博士。法国科学家,是细胞凋亡和死亡领域中引用率第一的科学家。在细胞凋亡研究中作出了卓越贡献而且涉猎及其广泛。目前也从事自噬研究,例如p53,Bcl2家族与细胞自噬。 6 )Tamotsu Yoshimori博士。日本科学家,2000年克隆了目前广泛使用的自噬标志物LC3文章的通讯作者,而且也参与了2010年ATG5机制研究,是通讯作者之一。在方法学上也有关键贡献。目前主要研究ATG14和ATG16。值得注意的是,上述三位日本科学家合作紧密,克隆了目前大部分的ATG基因,经常共享文章通讯作者。 7 )Patrice Codogno博士。法国科学家,2000年首先证实了PI3K信号通路在自噬的作用,I型抗自噬,III型促自噬,是自噬信号通路的开拓者。 8 )Ana Maria Cuervo博士。美国科学家,是分子伴侣自噬的开拓者。 9 )David Rubinsztein博士。英国科学家,2004年首次报道了mTOR与自噬的关系,抑制mTOR促进自噬。目前利用rapamycin诱导自噬成为经典模型之一。2010年Nature的报道首次证实了自噬对mTOR的负反馈调节。 12 、自噬信号通路:    1 ) KEGG    2 ) Abcam    3 ) CST    4) Enzo 13、我在做自噬课题中的一些心得: 自噬小体的增多有两种可能:一是形成增加即自噬被诱导;另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢?自噬体增多,也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多,二是与溶酶体融合受阻(如使用了氢化氯喹或氯喹,另外,溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合),使自噬体不能降解而积聚,这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。鉴于这样的原因,单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据,可联用多个方法来判断:   1 )加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂,如氯喹,观察自噬潮的变化。   2 )或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。   3 )或Knockdown掉LAMP-2基因(溶酶体膜蛋白)。   4 )检测胞浆长寿蛋白的降解。  WesternBlot 检测LC3时除了上述的原因外,还有几个需考虑到的地方: 1 )抗体的亲和力:有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高 2 )结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。 3 )自噬过程很快,一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短,其中自噬体形成阶段更迅速,数分钟即可完成,而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此,设置多个检测时间点(time frame)是非常重要的。

  • 索引序列
  • 关于水虎反噬论文范文
  • 关于噬菌体的研究论文
  • 关于杨虎城论文范文资料
  • 关于虎妈猫爸论文范文资料
  • 关于自噬现象研究的小论文
  • 返回顶部