（通讯员 裴凯）2018 年9月18日，国际知名学术期刊《Nature Microbiology》在线发表了我校蛋白质科学研究团队关于AimR结合底物多肽复合物结构和功能的最新研究进展，论文以“Structural basis of the arbitrium peptide–AimR communication system in thephage lysis–lysogeny decision”为题，阐述了决定噬菌体溶原裂解途径的一类新型分子调控机制。温和噬菌体在侵染细菌后，可以根据环境不同选择进入裂解途径或者溶原途径。最经典的例子是l噬菌体侵染大肠杆菌，l噬菌体基因组上的pL和pR启动子决定着其溶原或者裂解的命运。近年来，科学家在枯草芽孢杆菌中发现了一类新的决定机制：AimR-AimP-AimX决定系统。AimP编码43个氨基酸的多肽，分泌至细胞外被切割成6个氨基酸的成熟短肽（arbitriumpeptide）；AimR是信号短肽的受体，同时作为转录调控因子调控aimX基因的表达；AimX是噬菌体溶原途径的负调控因子。信号短肽运至细胞内与AimR结合，解除AimR对aimX基因的调控作用，使噬菌体进入溶原周期。这类决定系统广泛存在于不同类噬菌体中。然而，噬菌体如何识别信号短肽，信号短肽又如何解除AimR与DNA结合的分子机制并不清楚。本研究利用细胞生物学、结构生物学、生物化学和生物物理等多重手段揭示了来源于SPbeta类噬菌体信号短肽的作用分子机制，并通过解析了AimR的晶体结构以及信号短肽结合状态下AimR复合物的高分辨率晶体结构，发现AimR呈现超螺旋结构，结构显示AimR属于RRNPP 蛋白家族（革兰氏阳性菌群体感应系统的关键蛋白），短肽结合在AimR的螺旋空腔里面。通过结构比对，AimR未结合和结合短肽分子均为二聚体，仅有一个轻微的变化，不足以脱离DNA。研究者们发现AimR的N端是结合 DNA的关键部位，但未能捕捉其构象。我校新引进的刘主教授擅长蛋白动态结构分析，团队人员密切合作，通过小角散射等一系列生化和生物物理实验验证了短肽结合下AimR 的N端更加舒张，从而可能使整个AimR脱离靶标DNA。该研究解释了SPbeta噬菌体溶原裂解途径中短肽识别的关键问题，为进一步研究噬菌体对溶原和裂解途径的选择提供重要线索。我校生科院研究生王强和官泽源为该论文共同第一作者，邹婷婷副教授为通讯作者。该研究是和农业微生物国家重点实验室彭东海副教授合作，体现了院室相互融合。同时蛋白质研究团队成员充分合作，研究手段互补。该研究工作获得了华中农业大学自主科技创新基金和国家自然科学基金青年基金项目资助，我校蛋白质平台为该研究提供了强有力的支持，上海同步辐射光源BL17U1、国家蛋白质科学中心BL19U1和BL19U2线站为晶体衍射和小角散射数据收集提供了必要保障。
链霉菌噬菌体ΦC31位点特异性整合酶的结构与功能初步探讨 论文摘要: ΦC31位（略）酶由于能介导携带有attB序列的目的基因位点特异性整合到 哺 乳动物细胞基因组中,因而该系统已成为基因操作及基因治疗的强有（略）,该整合酶在 哺 乳动物细胞上介导整合的位点特异性和整合效率仍需进一步提高.而解析ΦC31位点特异性整合酶结构与功能关系是解决上述问题的基础和关键.为此,本研究利用（略）ΦC31位点特异性整合酶结构进行预测,结合分子生物学技术对其结构与功能关系进行初步探讨,其结果如下: 1、利用生物信息学对包含ΦC31位点特异性整合酶在内的`丝氨酸位点特异性重组酶家族30个成员进行同源比对,结果显示:aa1—120为催化结构域,其在整个家族里是保守的；aa291-359含有许多带电残基(22aa)和极性残基(10aa),预测为蛋白多聚化相关区域,4个保守的Cys残基位于aa353—405,该区域可（略）合相关区域,aa416—504为Leu富含区,包含了14个Leu,aa457—527预测为α螺旋结构. 2、依据ΦC31位点特异性整合酶结构预（略）T22b-ΦC311-528等八个截断突变体质粒.这些质粒分别与ΦC31报告质粒共转在体内进... TheΦC31 site-specific integrase can promote gen（omitted）ration of plasmids carrying attB into native mammalian sequences. Consequently it has become a powerful to（omitted）e manipulation and gene therapy. However, the specificity and efficiency of integration in mammals need to be （omitted）proved. Analysis the relationship between structure and f（omitted） theΦC31 integrase is the basis and key for solving above problems. To this end, this stu（omitted）informatics to forecast the structure of theΦC3... 目录:缩写词 第5-6页 中文摘要 第6-7页 英文摘要 第7-8页 前言 第9-14页 材料和方法 第14-30页 ·.材料与试剂 第14-20页 ·.方法 第20-30页 结果 第30-44页 ·.ΦC31整合酶基因同源分析及结构预测 第30-32页 ·.ΦC31整合酶及其截断突变体表达质粒构建 第32页 ·.ΦC31整合酶及其截断体体内活性检测 第32-34页 ·.ΦC31整合酶及其截断体的表达与纯化 第34-36页 ·.ΦC31整合酶及其截断体蛋白DNA结合功能域的检测 第36-40页 ·.ΦC31整合酶及其截断体蛋白构象的远紫外CD谱测定 第40-44页 讨论 第44-47页 小结 第47-48页 参考文献 第48-52页 综述 第52-60页 参考文献 第57-60页 致谢 第60-61页 更多相关阅读推荐： 毕业论文
你好，细菌遭遇噬菌体会有裂解或溶原由细菌细胞膜的构成有没有能够让世菌体识别到的酶而决定。
细菌遭遇噬菌体会有裂解或溶原由环境不同决定温和噬菌体在侵染细菌后，可以根据环境不同选择进入裂解途径或者溶原途径。最经典的例子是l噬菌体侵染大肠杆菌，l噬菌体基因组上的pL和pR启动子决定着其溶原或者裂解的命运。近年来，科学家在枯草芽孢杆菌中发现了一类新的决定机制：AimR-AimP-AimX决定系统。AimP编码43个氨基酸的多肽，分泌至细胞外被切割成6个氨基酸的成熟短肽（arbitriumpeptide）；AimR是信号短肽的受体，同时作为转录调控因子调控aimX基因的表达；AimX是噬菌体溶原途径的负调控因子。信号短肽运至细胞内与AimR结合，解除AimR对aimX基因的调控作用，使噬菌体进入溶原周期。这类决定系统广泛存在于不同类噬菌体中。然而，噬菌体如何识别信号短肽，信号短肽又如何解除AimR与DNA结合的分子机制并不清楚。
赤潮是在特定的环境条件下,海水中某些浮游植物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象。赤潮是一个历史沿用名,它并不一定都是红色,实际上是许多赤潮的统称。赤潮发生的原因、种类、和数量的不同,水体会呈现不同的颜色,有红颜色或砖红颜色、绿色、黄色、棕色等。原生动物和细菌一般都是单细胞的。而能引发赤潮的藻类称为“赤潮藻”(red-tide algae)。这些藻类分别隶属于蓝藻门、绿藻门、裸藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、隐藻门等8个门类,有些是单细胞生物,有些是多细胞。赤潮是局部海域因浮游生物突发性地大量增殖和高密度聚集（几百万~几千万个赤潮生物/ml海水）而使海水变色发臭的异常现象。它是海洋严重污染的结果。赤潮的成因首先是携带大量无机营养盐和有机物的工业废水和生活污水排入海洋所引起的海水富营养化，它是赤潮形成的物质基础。1．关于赤潮的治理方法，据报道已有多种，如工程物理方法、化学方法以及生物学的方法。物理法——粘土法国际上公认的一种方法是撒播粘土法。利用粘土微粒对赤潮生物的絮凝作用去除赤潮生物，撒播粘土浓度达到1000mg/L时，赤潮藻去除率可达当65%左右。有报道称在小型实验场去除率可达95%~99%。20世纪80年代初，日本在鹿儿岛海面上进行过具有一定规模撒播粘土治理赤潮的实验。1996年韩国曾用6×104T粘土制剂治理100km2海域赤潮。2、化学除藻法是利用化学药剂对藻类细胞产生的破坏和抑制生物活性的方法进行杀灭控制赤潮生物，具有见效快的特点。最早使用的化学药剂是CuSO4，易溶于水，在使用过程中极易造成局部浓度过高而危害渔业，同时在海水的波动下迁移转化太快，药效的持久性差，也易引起铜Cu的二次污染，有机化合物在淡水除藻中具有药力持续时间长、对非赤潮生物影响小等优点，用有机化合物杀灭和去除赤潮生物也已有相关的报道。已有多种化学制剂用于赤潮生物治理的实验研究：如硫酸铜和缓释铜离子除藻剂、臭氧、二氧化氯以及新洁尔灭、碘伏、异噻唑啉酮等有机除藻剂。3．生物学方法治理赤潮的办法主要是有三个方面，一是以鱼类控制藻类的生长；二是以水生高等植物控制水体富营养盐以及藻类；三是以微生物来控制藻类的生长。其中由于微生物易于繁殖的特点，使得微生物控藻是生物控藻里最有前途的一种控藻方式。这些杀藻微生物主要是包括细菌（溶藻细菌）、病毒（噬菌体）、原生动物、真菌和放线菌等五类。多数溶藻细菌能够分泌细胞外物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用，因此通过溶藻细菌筛选高效、专一，能够生物降解的杀藻物质是灭杀赤潮藻的一个新的研究方向。治理中比较现实的方法就是利用海洋微生物对赤潮藻的灭活作用，及其对藻类毒素的有效降解作用，可使海洋环境长期保持稳定的生态平衡，从而达到防治赤潮的目的。
噬菌体（phage）是侵袭细菌的病毒，也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的肠道里，都可以找到噬菌体。
问题一：形成水华的蓝藻主要有哪些？水华造成的危害有哪些 水华是水体中的蓝藻快速大量繁殖形成的。它是肉眼可见的蓝藻群体，通常水体颜色呈现老水的一种现象。严重时可在水体表面漂浮积聚形成一层绿色的藻席。 (1)消耗水体中的溶解氧。一方面抑制了浮游植物因光合作用所产生的氧气，另一方面也阻隔了空气中的氧气进入养殖水体。(2)产生大量有毒有害物质。会产生蓝藻毒素、大量羟胺及硫化氢等有毒有害物质，严重败坏养殖水体，直接危害养殖动物，间接通过食物链影响人类身心健康;另外死亡的蓝藻释放大量有机质，散发腥臭味， *** 了化能异养细菌的滋生，其中大部分化能异养细菌对水产养殖动物来说并不是有益菌，而是致病菌，从而进一步导致继发感染细菌性疾病的发生。(3)阻碍了其它藻类的生长繁殖。水体中的蓝藻大量繁殖时，养殖水体通风及光照条件就会发生持续恶化，从面抑制了水体中有益浮游生物的生长繁殖、阻碍了其它藻类的光合作用，使养殖水体中的丝状藻类和浮游藻类等不能合成本身所需要的营养物质而死亡。 问题二：富营养化水体出现水华现象，为什么可以说明物质循环的特点 是怎么说明的 生活污水中(比如衣服的肥水)，由于含有大量的氮磷钾等营养元素，由于人类排放流入水中，使水体富营养化，然后水中的藻类植物利用这些营养大量繁殖。体现了物质循环 问题三：造成赤潮或水华的原因是水体中的______、______元素严重超标 藻类生长需要大量的N、P元素，如果水体中N、P元素严重超标，会引起藻类疯长，从而导致水中氧气含量降低，水生生物大量死亡，海水中常称为赤潮，淡水中称为水华．故答案为：N、P． 问题四：水体富营养化使蓝藻等生物迅速生长和繁殖，导致水华的频繁发生，水华不仅破坏水体生态系统，还会损害人体 （1）绿藻属于真核生物中的单细胞藻类，它具有叶绿体能够进行光合作用；而蓝藻属于原核生物，它之所以能够进行光合作用，是因为细胞中含叶绿素和光合作用有关的酶，并没有叶绿体．（2）蓝藻能够进行光合作用，能够利用光能将无机物转变为有机物，属于自养型生物．从生态系统的能量流动角度分析，蓝藻同化的能量除了自身呼吸消耗和被下一营养级同化以外，还有一部分能量被分解者分解利用．（3）对于大面积的水华现象，若不加以治理，大量繁殖的藻类死亡后被分解，会引起水体溶氧量继续下降，进而造成鱼类大量死亡，水质恶化加剧，这种现象在生态学上被称为正反馈调节．长期以往会造成生物多样性降低降低，引起自我调节能力降低，破坏了生态系统的稳定性．（4）绿藻和蓝藻都属于单细胞生物，因此计数需要借助于显微镜．用轮叶黑藻浸提液与铜绿微囊藻混合，观察对铜绿微囊藻生长的影响，柱形图中可以看出，随着时间的推移，5天后抑制率超过了80%，可能是轮叶黑藻中存在着某种或某些能够抑制铜绿微囊藻生长的物质．（5）据图3可以看出，实验的自变量为实验组加入轮叶黑藻浸提液，来观察叶绿素a含量的变化．（6）图3也可以看出，加入轮叶黑藻浸提液后，绿藻的叶绿素a的含量随着时间的推移也逐渐下降，并且抑制率也超过了80%，由此可知，轮叶黑藻不仅对铜绿微囊藻（蓝藻）有较强的抑制作用，对池塘混合藻类（绿藻）也有抑制作用．故答案为：（1）绿藻具有成型的细胞核（可以附加：有叶绿体），蓝藻没有成型的细胞核（可以附加：无叶绿体）．或者答二者之一亦可．（2）自养型生物；被分解者利用．（3）正反馈调节（反馈调节）；生物多样性降低．（4）显微（镜）计数法；轮叶黑藻中存在着某种或某些能够抑制铜绿微囊藻生长的物质．（5）轮叶黑藻浸提液．（6）轮叶黑藻不仅对铜绿微囊藻（蓝藻）有较强的抑制作用，对池塘混合藻类（绿藻）也有抑制作用． 问题五：今年初夏，无锡太湖又大面积发生了水华，严重危及市民的正常饮水．造成这种现象的原因是（）A．工业 赤潮是在特定环境条件下产生的，相关因素很多，但其中一个极其重要的因素是海洋污染．大量含有各种含氮有机物的废污水排入水中，促使水域富营养化，这是赤潮藻类能够大量繁殖的重要物质基础，国内外大量研究表明，浮游藻是引发赤潮的主要生物，在全世界4000多种浮游藻中有260多种能形成赤潮，其中有70多种能产生毒素．他们分泌的毒素有些可直接导致海洋生物大量死亡，有些甚至可以通过食物链传递，造成人类食物中毒．故选：A． 问题六：淡水水域污染、富营养化，会长出讨厌的水华．造成水华的生物通常是（）A．噬菌体B．细菌C．蓝藻D．草 水华主要是由于生活及工农业生产中含有大量氮、磷、钾的废污水进入水体后，蓝藻、绿藻、硅藻等藻类成为水体中的优势种群，大量繁殖后使水体呈现蓝色或绿色的一种现象．故选：C． 问题七：蓝藻水华爆发产生哪些气体?谢谢 甲烷吧
医学科研实验基础知识笔记（四）：细胞自噬研究策略
细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下， 细胞利用溶酶体降解自身受损、 变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬是细胞的一种自我保护机制， 广泛存在于真核细胞内， 在调节细胞生存和死亡的过程中， 起着重要的作用。
当细胞发生自噬后， 在自噬相关基因的调节下， 细胞通过单层或双层膜， 包裹待降解的细胞质或细胞器， 形成囊泡状的自噬体（autophagosome） 。然后自噬体再和溶酶体（lysosome）
发生融合形成自噬溶酶体（autolysosome） ， 由溶酶体内的一系列水解酶， 降解自噬溶酶体内所包裹的内容物， 以实现细胞对自身代谢和能量的更新。
1.自噬的细胞学分类及过程
根据细胞内物质运输到溶酶体的方式以及生理功能的差异， 哺乳动物的细胞自噬可以分为三种类型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。
1） 大自噬/宏自噬：我们通常所说的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的过程中， 细胞质中可溶性的大分子物质以及变性的细胞器， 被内质网、 线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体。接着自噬体的外膜与溶酶体膜融合， 进一步形成自噬溶酶体， 自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解， 最终完成整个的自噬过程。
2） 小自噬/微自噬：与大自噬过程不同， 是溶酶体膜自身发生内陷， 包裹和吞噬细胞内待降解的底物， 并在溶酶体内发生降解。小自噬与大自噬的区别就在于， 在小自噬过程中胞质成份是直接被溶酶体包裹， 没有形成自噬体的过程。
3） 分子伴侣介导的自噬：在分子伴侣介导发生的自噬过程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白质分子。分子伴侣蛋白识别带有特定氨基酸序列的底物蛋白质分子， 并与之结合， 然后再经溶酶体膜上的受体 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 转运到溶酶体；底物蛋白分子再在溶酶体内， 被水解酶降解。因此， 分子伴侣介导的自噬与前两者不同， 在降解蛋白时具有选择性。而大自噬和小自噬现象中， 一般而言， 在降解蛋白时没有明显的选择性。
2.自噬信号通路
3.自噬与凋亡的关系
细胞凋亡也被称为 I 型程序性细胞死亡；自噬则被称为 II 型程序性细胞死亡。凋亡和自噬是两种显著不同的细胞死亡形式， 两者在形态、 生化指标以及调控细胞死亡的过程上都存在着较大的差异， 但两者又不是两个完全独立的过程。许多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情况下也是相互影响和制约的。自噬和凋亡之间存在着三种不同类型的相互作用，而且每种类型都对应着相应的特定的细胞类型、 刺激和环境。
1） 自噬和凋亡互相协同， 共同促进细胞死亡。两种效应之间， 可以其中一种效应影响另一种效应；自噬也可以作为凋亡的上游调节因子， 直接调控细胞凋亡， 从而影响细胞的死亡；
2） 自噬可以通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。比如， 可以通过去除因氧化应激受损的细胞器， 或降解变性的大分子物质， 为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量；或者通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。自噬的这些功能将会抑制促凋亡信号的产生， 从而起到拮抗细胞凋亡的作用。
3） 自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡， 但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些 ATP 依赖的凋亡过程。
4.自噬的分子机制和特征
1） 自噬诱导阶段（induction） ：正常生理状态下， 细胞保持很低的基础自噬水平。这时细胞内能量充足，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1(也就是 mTOR 复合物 1，也叫做 mTORC1)处于活化的状态。活化的 mTORC1 通过磷酸化的方式使得 ATG13 发生磷酸化反应， 从而抑制细胞的自噬。
2） 成核过程（vesicle nucleation） ：成核过程和 Vps34-ATG6 复合物密切相关。这个复合物还包含有调节性蛋白激酶 Vps15， 共同作用于膜泡的成核， 介导 PAS(也就是前自噬体结构pre-autophagosomal structure)的形成。
Vps34-ATG6 复合体还可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3， 并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。请大家注意， Vps34 在哺乳动物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳动物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以 Vps34-ATG6 复合体， 也被称为 PI3K-Beclin-1复合物。
3） 自噬体的延伸阶段：这个过程的分子机制是最为复杂的。哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个类泛素化的系统：a） ATG12 的结合过程；b） LC3 的修饰过程。
ATG12 的结合过程是类似泛素化的过程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。ATG12 首先由 E1样酶 ATG7 活化， 再通过 E2 样酶 ATG10 转运并结合 ATG5， 然后和 ATG16 结合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面， 并参与前自噬体外膜的扩张。
LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修饰过程同样需要类似泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。LC3 前体形成后被 ATG4 加工成胞浆可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 样酶 ATG7 和 E2样酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合， 直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物， 也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。
哺乳动物的 ATG12-ATG5 类泛素化过程和 LC3 类泛素化过程并不是独立运行的， 它们之间可以相互作用、 相互调节。
4） 自噬体的成熟阶段：自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(Rab S)作用下， 与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。
5） 自噬体的裂解阶段：是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、 能量或循环利用。
5.自噬诱导剂
a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
e) Rapamycin：mTOR抑制剂
f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
6.自噬抑制剂
a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
c) Hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
7.自噬的检测手段
自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物，因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段降解被抑制所致，所以设置合适的对照很有必要。
（1）透射电镜，电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构；
（2）WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1；生化检测自噬体膜标志蛋白， 特别是ATG12、 ATG5 和 LC3；荧光显微镜检测 LC3 或GFP-LC3 斑点的形成；生化检测自噬底物 p62。
（3）WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。
（4）组织蛋白酶Cathepsin活力检测。
（5）IF检测自噬潮autophagic flux
自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
（1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
（2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
（3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。需要多种检测方法结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
（4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异
（5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。
由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）
8.自噬研究常规思路
通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：
（1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）
（2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）
（3）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。
9.研究自噬的文献参考
[1]. Emerging Mechanisms in Initiating and Terminating Autophagy. Trends Biochem Sci. 2017 Jan;42(1):28-41.
[2]. Targeting autophagy in cancer. Nat Rev Cancer. 2017 Sep;17(9):528-542.
[3]. Autophagy: controlling cell fate in rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2016 Sep;12(9):517-31.
[4]. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol. 2016 Nov;16(11):661-675.
[5]. Autophagy and Neurodegeneration: Pathogenic Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Neuron. 2017 Mar 8;93(5):1015-1034.
[6]. Activating autophagy to potentiate immunogenic chemotherapy and radiation therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Apr;14(4):247-258.
[7]. Epigenetic Control of Autophagy: Nuclear Events Gain More Attention. Mol Cell.2017 Mar 2;65(5):781-785.
[8]. Pharmacological modulation of autophagy: therapeutic potential and persisting obstacles. Nat Rev Drug Discov.2017 Jul;16(7):487-511.
1、 自噬的定义： 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。2、 自噬的过程： 从一张图片开始： 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。3 、自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别 5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。 6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。4 、自噬过程的调控： 从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。 关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有： 抑制类 1）Class I PI3K pathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS (Insulin receptor substrate)结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬） 2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin） mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂. 激活类 1）Class III PI3K 结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。3-MA是Class III PI3K的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂. 5 、自噬的研究方法： 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有： （一）自噬诱导剂 1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin ： 模拟内质网应激 2 ）Carbamazepine/L-690，330/ LithiumChloride（氯化锂）： IMPase 抑制剂 （即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶） 3 ）Earle's平衡盐溶液： 制造饥饿 4 ）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制剂 5 ）Rapamycin：mTOR抑制剂 6 ）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂 （二）自噬抑制剂 1 ）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂 2 ）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂 3 ）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1）观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV） 2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成：(常用) GFP-LC3单荧光指示体系：由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。 3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。 自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。 (Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响) 4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是选择性降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是p62蛋白，p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。 5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。 6）Cell Tracker TM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。 6、自噬体的发生： 目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome)，VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的 跨膜 蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。7、自噬与细胞死亡的关系： 有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些 人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。 一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（program celldeath，PCD）。但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagic celldeath，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的，凋亡为Type I cell death，坏死为Type III cell death。尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death by autophagy（自噬引起死亡）还是Cell death with autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？对此，自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：Cell death by autophagy细胞存活，而Cell death with autophagy细胞死亡。8、自噬与肿瘤的关系： 与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此， 自噬具有维持细胞自稳的功能 ；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说， 自噬就是一个 “ 备用仓库 ” 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。 鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处： 1 ）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。 2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括 Beclin 1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。 9、在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。 pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。 MitoTracker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeabilize），可采用0.1%SDS处理 自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法： 1）△ψmdissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。 2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜。 3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonylacridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。 4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。 5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。 6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。 10、如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy？ 第一步：利用上述方法证实细胞死亡 第二步：证实细胞死亡前发生了自噬 第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡 第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬 第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。 自噬的抑制根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下： 1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。 2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。 3）对溶酶体降解的抑制:自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。11 、自噬领域的大牛们： 1）YoshinoriOhsumi博士。日本科学家，克隆了第一个酵母自噬基因Atg1以及LC3，主要成果在酵母模型下自噬研究； 2 ）Daniel J. Klionsky博士。美国科学家，主要成果在酵母模型的自噬研究。最早在《Science》上发表综述介绍自噬，2005年创办了第一本自噬杂志《Autophagy》；2007年举办了第一次自噬国际会议，为自噬的宣传做了大量工作。 3 ）Noboru Mizushima博士。日本科学家，2001年主要报道了Atg5的功能，被认为是哺乳动物分子机制研究的第一环，以及参与克隆自噬标志物LC3，而且制备了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3转基因老鼠； 4 ）Beth Levine博士。美国科学家，首先克隆了第一个哺乳动物自噬基因Beclin 1； 5 ）Guido Kroemer博士。法国科学家，是细胞凋亡和死亡领域中引用率第一的科学家。在细胞凋亡研究中作出了卓越贡献而且涉猎及其广泛。目前也从事自噬研究，例如p53，Bcl2家族与细胞自噬。 6 ）Tamotsu Yoshimori博士。日本科学家，2000年克隆了目前广泛使用的自噬标志物LC3文章的通讯作者，而且也参与了2010年ATG5机制研究，是通讯作者之一。在方法学上也有关键贡献。目前主要研究ATG14和ATG16。值得注意的是，上述三位日本科学家合作紧密，克隆了目前大部分的ATG基因，经常共享文章通讯作者。 7 ）Patrice Codogno博士。法国科学家，2000年首先证实了PI3K信号通路在自噬的作用，I型抗自噬，III型促自噬，是自噬信号通路的开拓者。 8 ）Ana Maria Cuervo博士。美国科学家，是分子伴侣自噬的开拓者。 9 ）David Rubinsztein博士。英国科学家，2004年首次报道了mTOR与自噬的关系，抑制mTOR促进自噬。目前利用rapamycin诱导自噬成为经典模型之一。2010年Nature的报道首次证实了自噬对mTOR的负反馈调节。 12 、自噬信号通路： 1 ） KEGG 2 ） Abcam 3 ） CST 4) Enzo 13、我在做自噬课题中的一些心得： 自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断： 1 ）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。 2 ）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。 3 ）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。 4 ）检测胞浆长寿蛋白的降解。 WesternBlot 检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方： 1 ）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高 2 ）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。 3 ）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。
细菌与真菌与人类和自然界的一切生物是相互依存的，从人类健康的角度看，可以将细菌和真菌简单的分为病原微生物和有益菌，病源微生物是可以引起疾病的微生物，但也非绝对的，人体大量存在的正常菌群，当菌群失调时就会致病，有益菌就是对人体有益的细菌，比如肠道存在的细菌，可以产生维生素K，比如乳酸杆菌等都是人体必须的，真菌就比较好理解，一般致病的如黄曲霉菌，白色念珠菌等，有益菌如冬虫夏草，酵母菌，灵芝菌等。自然界有益菌远多于病原菌，但它在不同的环境条件下可以相互转化。细菌是危害人体的一个小的不能再小的东西了，但它的危害极大呢，呵呵细菌与真菌与人类和自然界的一切生物是相互依存的，从人类健康的角度看，可以将细菌和真菌简单的分为病原微生物和有益菌，病源微生物是可以引起疾病的微生物，但也非绝对的，人体大量存在的正常菌群，当菌群失调时就会致病，有益菌就是对人体有益的细菌，比如肠道存在的细菌，可以产生维生素K，比如乳酸杆菌等都是人体必须的，真菌就比较好理解，一般致病的如黄曲霉菌，白色念珠菌等，有益菌如冬虫夏草，酵母菌，灵芝菌等。自然界有益菌远多于病原菌，但它在不同的环境条件下可以相互转化。 希望对你有帮助。
如果您进行了一项关于细菌调查的研究，并且在数据分析方面得出了有意义的结果，那么您可以将这些结果用于论文写作。关于细菌的研究可以是非常广泛的，例如调查人体内的细菌群落、自然环境中的细菌多样性、细菌在食品加工和储存中的作用等等。只要您的研究有实际的贡献并且是经过科学验证的，您都可以撰写一篇关于细菌的论文并且提交给相关的期刊进行发表审核。
1 没有发现可以写论文的细菌。2 因为细菌是单细胞微生物，它们的主要生命活动是吸收营养、繁殖和适应环境，没有智慧和语言能力，无法进行学术研究和写作。3 然而，研究细菌的科学家可以通过对细菌的生态、代谢、遗传等方面的研究，发表相关的学术论文，推动细菌领域的研究进展。此外，也可以通过比较分析细菌与其他生物的差异和相似性，为生命科学的发展做出贡献。
已发至邮箱，请查收采纳！
弗莱明的生平介绍：
弗莱明的学术贡献有：
弗莱明的 发明成就：
很多我们所熟知的伟大发明都诞生于偶然。
阿基米德洗澡时，发现了浮力原理；瓦特看到祖母烧水时，沸腾的水把壶盖顶起，发明了蒸汽机；牛顿在树下玩耍被苹果砸中，发现了万有引力定律。
但是实际上他们都孕育在必然。青霉素的发现亦是如此。 短短70年间 ，拯救了上亿人性命的青霉素，源于亚历山大·弗莱明的一个喷嚏。
亚历山大·弗莱明出生于苏格兰基马尔诺克附近的洛克菲尔德。他幼年时，父亲离世。母亲每天为生计奔波，没有多余的精力和时间来管教弗莱明和他的几个兄弟。山野森林就是他们的游乐场，虫鸣鸟叫就是童年的乐章。
春生夏长，秋收冬藏，弗莱明在这里看到了大自然点点滴滴的变化，也养成了善于观察的能力。
直到十三岁时，弗莱明离开苏格兰，去伦敦投奔同父异母的哥哥汤姆。汤姆是一名眼科医生，他对弗莱明后期成长规划起到很大帮助。
初到伦敦时，弗莱明在一家技校学习。毕业后，他在一家贸易船务公司找了一份工作。
弗莱明的人生转折发生在 20岁的那年 。终身未婚的舅舅离世，弗莱明继承了舅舅的250英镑遗产。哥哥汤姆认为要好好地利用起这笔钱，建议他去学习医学。他听从了哥哥的想法，认真准备入学考试。
同年，弗莱明通过了16门功课考试，取得了进入伦敦大学圣玛丽医学院就读的资格。
在校期间，他获得各种类型的奖学金，使得他顺利地完成了自己的学业。从某种意义上讲， 这时期弗莱明在医学上的天赋开始显露出来。
1906年，弗莱明毕业后留在了圣玛丽医学院，跟随他的老师赖特博士从事免疫研究。
莱特博士作为学术界的权威，并不制止和干涉弗莱明按照自己的兴趣进行的研究和 探索 ，这使得弗莱明的研究有一定的自主权。
一战爆发时，弗莱明作为赖特研究小组的一员随赖特奔赴法国战场前线，研究疫苗对付伤口感染的效果。长期以来， 杀菌剂被用来给创口消毒杀菌。
但是小组在前线的研究发现，杀菌剂杀死病毒的同时，也杀死了人体的正常细胞，很可能对治疗起到反作用，使得伤口感染更加严重。
经过试验，他们建议使用浓盐水对创口杀菌，而且越早处理效果才有效果。可惜，当时这一提议并未引起重视。
二战时，浓盐水消毒杀菌才被广泛应用，挽救了许多战士的生命。弗莱明的许多研究在前线得到验证， 也因此弗莱明在医学界逐渐崭露头角。
回国后，弗莱明专心研究能杀死葡萄球菌的方法，以帮助伤员降低感染几率。弗莱明有一个实验习惯，不论是哪种培养基，都会长久放置后，再进行观察，没有有用的发现后才去清洗干净。
在培养一种新的黄色球菌的时候，弗莱明重感冒还未痊愈， 打了个喷嚏 ，他突发奇想取了自己一滴 鼻腔液 放在了培养基上。
两个星期后，弗莱明观察发现培养基上遍布球菌的克隆群落，鼻腔黏液所在位置却没有，而且其稍远位置有一种半透明的玻璃状新克隆群落。但是进一步的研究发现，这其实只是细菌融化所致。
1921年，弗莱明开始抗菌素的研究， 实验结果表明鼻腔黏液中含有抗菌素 。他认为这种抗菌素是一种酶，而且几乎存在于人体的大部分体液和分泌物中。
赖特建议把这种酶命名为 “溶菌酶” 。
接下来的七年，弗莱明带领他的研究小组深入研究落菌酶的作用，但是收效甚微，他们失望地发现它的杀菌能力不强，对多种病原菌都没有作用，于是放弃了研究。
1927年，弗莱明看到了一篇关于最新金葡菌(医院内导致交叉感染的主要致病菌)变异的研究文献，并产生了浓厚的兴趣，决定重复该实验。
他在培养基边缘发现了一块因溶菌而显示的惨白色，这就是青霉素。
实验表明，它的分泌物可以杀死某些葡萄球菌，这这些葡萄球菌容易引起创口感染。
弗莱明将青霉素粗提物用在家兔和小白鼠身上，证实了他的结论。弗莱明的追随者们，在一些深受感染危害的患者上使用过青霉素粗提物，并且取得了良好的效果。
但是在大量实验过程中， 弗莱明发现葡萄球菌遇到青霉素，会很快产生抗性。 而且在天竺鼠身上试验时，致死率非常高。弗莱明不得不非常慎重使用青霉素。粗提物成品里含有太多杂质，必须提纯后才能用于人员伤口治疗。
由于当时的技术条件限制，弗莱明很难提取高纯度的青霉素，更别提应用于临床治疗，他最终放弃了青霉素的继续研究。
青霉素的发现并未引起医学界的重视。弗莱明发表了《关于霉菌培养的杀菌作用》论文后，将青霉素菌种移交给牛津研究小组后，其研究重心放在了其他方面。
1932年，弗莱明所在医院的一位医生再次使用青霉素治疗眼疾成功时，他向当时的牛津小组领导弗洛里提起青霉素的重要作用时。弗洛里不以为然，并没有重视。 青霉素就此尘封。
1939年，德国生物化学家钱恩加入牛津小组，查阅大量文件和实验记录后，向弗洛里极力推荐青霉素，青霉素的研究才得以继续。
钱恩和弗洛里从青霉菌的株菌培养到青霉素的分离、提纯，然后应用到动物身上进行观察，发现效果非常好。通过深入研究，提取到高纯度的青霉素，其抗菌能力提高了几千倍。
牛津小组在给一位面部严重感染的警官医治时，使用青霉素取得了非常好的治疗效果。但是因为剂量不够，这名警官最终离世。
医学界终于注意到了青霉素的重要作用。
当时二战全面爆发，战争带来的了非常惨重的伤亡，钱恩说服美国政府加入到青霉素的研发当中，积极推动了青霉素的生产工艺在短时间内飞速发展， 成为了美国仅次于核工业的高端研究项目 ，并且正在临床实验中广泛使用，挽救了数以百万计伤员和病人的生命。
弗莱明和牛津小组的弗洛里、钱恩共同荣获1945年诺贝尔生理学及医学奖。但是在青霉素发明人这个定位上，弗莱明一直饱受争议。
虽然他发现了青霉素，却没有发现它的重大价值。
如果没有钱恩和弗洛里的潜心研究，以为为它的应用和推广做出的各种努力，青霉素也许就不能这么快被造福于人类，甚至于很可能被埋没在医学研究的 历史 长河中。
各种媒体报道中对弗莱明大篇幅的报道和夸赞，而对牛津小组的贡献往往一笔带过。也许我们从诺贝尔奖为三个人配发的却耐人寻味的文字能获得一些信息。
青霉素为人类医学的发展做出了巨大的贡献， 短短70多年，拯救了上亿人的性命。 甚至将来，青霉素依然在临床医学上发挥着重大的作用。
世界上任何一个伟大发明必然要经历漫长的孕育阶段，才能恰逢其时的“偶然”诞生。而其成长也必然离不开同领域里许多人坚持不懈的 探索 ，才能成为真理而被广泛应用。