论文的进展情况要分多个角度写，如何时选定题目、收集齐材料、拟定好论文提纲、开题报告的撰写、初稿和修改稿的完成时间、定稿等过程的具体时间
科学或社会研究工作者在学术书籍或学术期刊上刊登，并用来进行科学研究的，从而描述或呈现自己研究成果、对前任工作总结的回顾及做出评价的文章，这类文章特别强调原创性。论文类别有学年论文、毕业论文、学位论文、科技论文、成果论文等。
论文的进展情况即是对于写作时间和写作顺序上的安排，在这个过程上，材料的收集、文章的撰写和改动等都要有明细的安排，对于发表有个具体时间，要考虑到论文课题研究中的每个阶段的重难点，且要根据学习毕业论文答辩时间来安排自己论文的进度。
论文的进展情况要分多个角度写，如何时选定题目、收集齐材料、拟定好论文提纲、开题报告的撰写、初稿和修改稿的完成时间、定稿等过程的具体时间。更为详细时间更应该根据要求细分，如学校毕业论文规定时间内完成。
论文的进展情况（1）提交开题报告，参加开题答辩。（2）编写调查问卷，进行调研活动。（3）撰写论文初稿。（4）修改论文初稿，完成正稿。进展情况：1.查阅了大量的相关资料，包括国内外有关文献，国内外众学者的相关论文、专著，以及国内外相关新闻报道等，对所要着手研究的课题作全面地了解与认识。2.在对所搜集资料认真研究的基础上，拟定论文题目，填写开题报告。3.对论文作初步构思，构建主体框架，写出论文提纲。4.在老师的指导下，完成论文的初稿。
太湖蓝藻生长特征的非线性动力学分析 --- 周婕 曾诚 王玲玲中华鳖性腺的发生与发育研究 --- 朱道玉中国鱼腥藻属的八个新记录种 --- 杨丽 虞功亮 李仁辉蛭弧菌BDH5221株理化特性和16S RDNA序列分析 --- 梁思成 房文红 汪开毓 贾娴野生和养殖裂腹鱼血液学指标的比较研究 --- 陈永祥 肖玲远 严太明 赵海涛 沈诗军 周定刚不同季节升温条件下余氯对桡足类的毒性 --- 江志兵 曾江宁 陈全震 廖一波 徐晓群 寿鹿 刘晶晶 高爱根 赵永强 黄逸君铜绿微囊藻在不同供磷水平下对砷胁迫的响应 --- 龚艳 吴幸强 肖邦定 方涛 刘剑彤 宋立荣饲料中HUFA影响草鱼脂质代谢的研究 --- 吉红 曹艳姿 刘品 苏尚顺 林亚秋 曹福余 奥宏海 周继术 叶元土饲料蛋白水平对血鹦鹉幼鱼生长、体组成和肠道蛋白消化酶活性的影响 --- 石英 冷向军 李小勤 刘满仔 史少奕三峡库区消落带芦苇穗期光合生理特性研究 --- 冯大兰 刘芸 黄建国 杨娟 马菲 谢君溶藻细菌DC-L5的分离、鉴定及其溶藻特性 --- 卢兰兰 李根保 沈银武 胡明明 刘转日本新糠虾胚胎发育及母体大小与幼体关系研究 --- 王小艳 杨筱珍 王金锋 吴旭干 赵柳兰 成永旭马氏珠母贝DMRT5基因的克隆及时序表达模式分析 --- 于非非 桂建芳 周莉 王梅芳 余祥勇力竭性运动锻炼和饥饿对南方鲇运动后过量耗氧的影响 英文 --- 曹振东 付世建金藻吞噬微囊藻产生的无毒变异株与产毒原始株的比较 --- 欧丹云 刘媚 甘南琴 宋立荣高铁酸钾对几种常见鱼类病原菌的杀菌效果测定 --- 刘乾甫 汪建国 李明 凌飞 龚小宁电子废物污染地区水生生物体内多氯联苯的异构体分布特征和毒性 --- 张晓岭 杨方星 闻胜 金士威 惠阳 徐盈 长江江豚MHCD-RB基因第二外显子的分离鉴定 --- 杜合军 郑劲松 武敏 赵庆中 王丁草鱼RAGS的克隆及不同发育阶段的表达分析 --- 张琼宇 范嗣刚 罗琛鲫鱼RAG基因的克隆及表达分析 --- 范嗣刚 张琼宇 罗琛4龄中华鲟垂体的EST分析 英文 --- 曹宏 周莉 桂建芳阿部鲻鰕鯱P450 1A1克隆与分析 --- 程章 聂湘平 王芳 李凯彬稀有鮈鲫鳍细胞系的建立及其作为测定重金属毒性模型的探讨 --- 谭凤霞 杨方星 王卫民 王敏人工藻结皮技术及其在沙漠治理中的应用 --- 饶本强 刘永定 胡春香 李敦海 沈银武 王伟波绿色巴夫藻脂肪酸去饱和酶的克隆和初步研究 英文 --- 元冬娟 周克元 康景轩 江黎明铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响 --- 张清顺 侯建军 刘香江 罗洁璇 熊邦喜转基因斑马鱼分析胰岛Β-细胞发育情况 英文 --- 夏铭 潘雪 李敏燕 邓敏 张勇 金怡 陈漪 王和生 孔德明溴化1-己基-3-甲基咪唑对斜生栅藻谷胱甘肽及其代谢酶的影响 --- 马剑敏 蔡林林 胡灵卫 靳同霞 李效宇 王键吉新疆伊犁河鲫鱼遗传多样性初步研究 --- 周秋白 郑宇 周莉 桂建芳线粒体D-LOOP序列变异与东方鲀属鱼类系统发育 --- 张玉波 甘小妮 何舜平稀有鮈鲫近交系微卫星多态性分析 --- 邵燕 王剑伟 何勇凤 曹文宣 童金苟沉水植物菹草的人工种子技术 --- 安彦杰 张彦辉 杨劭ZN对荇菜叶片保护酶活性、渗透调节物质含量和CA~ 2+ 定位分布的影响 --- 徐勤松 施国新 计汪栋 杜开和 许晔硫酸铜控藻对浮游植物群落的影响 --- 赵小丽 宋立荣 张小明黑藻对水体和沉积物理化性质的改善和营养元素的去除作用 --- 吴娟 吴振斌 成水平MTT方法评价微生物细胞活性的探讨 --- 杨翠云 刘永定刺鳅X染色体DNA文库的构建 --- 陈戟 赵刚 臧亚婷 余其兴 刘江东
太湖蓝藻生长特征的非线性动力学分析 --- 周婕 曾诚 王玲玲中华鳖性腺的发生与发育研究 --- 朱道玉中国鱼腥藻属的八个新记录种 --- 杨丽 虞功亮 李仁辉蛭弧菌BDH5221株理化特性和16S RDNA序列分析 --- 梁思成 房文红 汪开毓 贾娴野生和养殖裂腹鱼血液学指标的比较研究 --- 陈永祥 肖玲远 严太明 赵海涛 沈诗军 周定刚不同季节升温条件下余氯对桡足类的毒性 --- 江志兵 曾江宁 陈全震 廖一波 徐晓群 寿鹿 刘晶晶 高爱根 赵永强 黄逸君铜绿微囊藻在不同供磷水平下对砷胁迫的响应 --- 龚艳 吴幸强 肖邦定 方涛 刘剑彤 宋立荣饲料中HUFA影响草鱼脂质代谢的研究 --- 吉红 曹艳姿 刘品 苏尚顺 林亚秋 曹福余 奥宏海 周继术 叶元土饲料蛋白水平对血鹦鹉幼鱼生长、体组成和肠道蛋白消化酶活性的影响 --- 石英 冷向军 李小勤 刘满仔 史少奕三峡库区消落带芦苇穗期光合生理特性研究 --- 冯大兰 刘芸 黄建国 杨娟 马菲 谢君溶藻细菌DC-L5的分离、鉴定及其溶藻特性 --- 卢兰兰 李根保 沈银武 胡明明 刘转日本新糠虾胚胎发育及母体大小与幼体关系研究 --- 王小艳 杨筱珍 王金锋 吴旭干 赵柳兰 成永旭马氏珠母贝DMRT5基因的克隆及时序表达模式分析 --- 于非非 桂建芳 周莉 王梅芳 余祥勇力竭性运动锻炼和饥饿对南方鲇运动后过量耗氧的影响 英文 --- 曹振东 付世建金藻吞噬微囊藻产生的无毒变异株与产毒原始株的比较 --- 欧丹云 刘媚 甘南琴 宋立荣高铁酸钾对几种常见鱼类病原菌的杀菌效果测定 --- 刘乾甫 汪建国 李明 凌飞 龚小宁电子废物污染地区水生生物体内多氯联苯的异构体分布特征和毒性 --- 张晓岭 杨方星 闻胜 金士威 惠阳 徐盈 长江江豚MHCD-RB基因第二外显子的分离鉴定 --- 杜合军 郑劲松 武敏 赵庆中 王丁草鱼RAGS的克隆及不同发育阶段的表达分析 --- 张琼宇 范嗣刚 罗琛鲫鱼RAG基因的克隆及表达分析 --- 范嗣刚 张琼宇 罗琛4龄中华鲟垂体的EST分析 英文 --- 曹宏 周莉 桂建芳阿部鲻鰕鯱P450 1A1克隆与分析 --- 程章 聂湘平 王芳 李凯彬稀有鮈鲫鳍细胞系的建立及其作为测定重金属毒性模型的探讨 --- 谭凤霞 杨方星 王卫民 王敏人工藻结皮技术及其在沙漠治理中的应用 --- 饶本强 刘永定 胡春香 李敦海 沈银武 王伟波绿色巴夫藻脂肪酸去饱和酶的克隆和初步研究 英文 --- 元冬娟 周克元 康景轩 江黎明铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响 --- 张清顺 侯建军 刘香江 罗洁璇 熊邦喜转基因斑马鱼分析胰岛Β-细胞发育情况 英文 --- 夏铭 潘雪 李敏燕 邓敏 张勇 金怡 陈漪 王和生 孔德明溴化1-己基-3-甲基咪唑对斜生栅藻谷胱甘肽及其代谢酶的影响 --- 马剑敏 蔡林林 胡灵卫 靳同霞 李效宇 王键吉新疆伊犁河鲫鱼遗传多样性初步研究 --- 周秋白 郑宇 周莉 桂建芳线粒体D-LOOP序列变异与东方鲀属鱼类系统发育 --- 张玉波 甘小妮 何舜平稀有鮈鲫近交系微卫星多态性分析 --- 邵燕 王剑伟 何勇凤 曹文宣 童金苟沉水植物菹草的人工种子技术 --- 安彦杰 张彦辉 杨劭ZN对荇菜叶片保护酶活性、渗透调节物质含量和CA~ 2+ 定位分布的影响 --- 徐勤松 施国新 计汪栋 杜开和 许晔硫酸铜控藻对浮游植物群落的影响 --- 赵小丽 宋立荣 张小明黑藻对水体和沉积物理化性质的改善和营养元素的去除作用 --- 吴娟 吴振斌 成水平MTT方法评价微生物细胞活性的探讨 --- 杨翠云 刘永定刺鳅X染色体DNA文库的构建 --- 陈戟 赵刚 臧亚婷 余其兴 刘江东
生物技术作为一门高新技术学科，必须经过长期培养才能在实际应用中显示出一定的效果，生物技术研究的范围也很广。生物技术专业的论文怎么写呢?下面我给大家带来生物技术专业论文选题题目_生物专业论文题目参考，希望能帮助到大家!
生物论文题目
[1]不同温度下制备的生物炭对水相Cu~(2+)的吸附表现
[2]新型冠状病毒肺炎疫情下治疗药物监测实验室的感染防控策略
[3]脱毒地黄试管苗的微扦插快繁技术研究
[4]水产蛋白源生物活性肽的研究进展
[5]杉木ClSAUR25基因5’侧翼序列的克隆与生物信息学分析
[6]芒果MiTFL1-4基因启动子克隆与生物信息学分析
[7]乳酸菌调控骨骼肌线粒体生物发生的机制研究进展
[8]基于模拟胃肠道消化的云南民族乳制品蛋白肽研究
[9]肠道派氏结M细胞在淋巴传递中的生物功能及靶向载体研究进展
[10]家禽肠道健康的生物标志物研究进展
[11]生物素对动物毛发生长的影响及其应用
[12]Bacillus asahii OM18菌剂载体筛选及其对玉米的促生效果
[13]江苏省湖泊水生植物优势种对氮、磷去除效果比较研究
[14]三维荧光分析评价腐殖酸高级氧化前处理效果的研究
[15]生物炭对铜污染土壤的修复及水稻Cu累积的影响
[16]基于鱼类需求的淮河上游息县枢纽工程闸下河段环境流量研究
[17]基于高通量测序探讨大宁河不同水华期真核浮游生物群落组成
[18]裂解温度对不同原材料生物炭理化特性的影响
[19]山楂鲨烯合酶CpSQS1，CpSQS2的基因克隆及原核表达分析
[20]甜菜素合成相关基因BvDDC1的克隆与表达分析
[21]“伞形集团”典型国家LULUCF林业碳评估模型比较研究
[22]小麦和苜蓿套作 种植 对土壤水分及作物水分利用效率的影响
[23]黄土高原刺槐人工林根际和非根际土壤磷酸酶活性对模拟降水变化的响应
[24]重庆都市区生态系统服务价值时空演变及其驱动力
[25]黄土高原降雨梯度对刺槐不同器官内源激素分布格局及生长的影响
[26]基于改进参数的长三角城市生态足迹分析及其可持续性评价
[27]黄土丘陵区退耕草地群落盖度与地上生物量关系
[28]模拟降雨量变化与CO_2浓度升高对小麦光合特性和碳氮特征的影响
[29]黑色地膜覆盖土壤水热效应及对玉米产量的影响
[30]生物土壤结皮生态修复功能研究及对石漠化治理的启示
[31]__核电厂邻近海域大型底栖动物群落变化和污染指数评价
[32]鸡和鸭对山苍子果渣养分和能量利用率的研究
[33]多级AO+潜流湿地对生活污水中的EDCs及常规污染物的去除试验研究
[34]人类生物医学干预是合法的政策监管手段吗?
[35]Rev-erbα在心血管疾病中的研究进展
[36]医用生物胶体分散剂在1064 nm Nd:YAG激光治疗婴幼儿血管瘤术后的应用
[37]茶黄素双没食子酸酯的生物活性及其作用机制
[38]化学动力学疗法:芬顿化学与生物医学的融合
[39]金银花和蒲公英对肉源性假单胞菌生物被膜的清除作用
[40]5.5亿年前动物“临终遗迹”的发现将分节动物的祖先推前了一千万年
[41]趋磁细菌磁小体合成的相关操纵子和基因
[42]霉菌毒素的生物脱除 方法 及机理研究进展
[43]内蒙古巴彦淖尔市畜禽寄生虫病调查
[44]基于O_2/Ar比值估算海洋混合层群落净生产力的研究进展
[45]海岸线的溢油环境敏感性评价研究进展
[46]海洋中挥发性卤代烃的研究进展
[47]海水养殖生境中硫化物污染及控制技术研究进展
[48]紫檀芪改善睡眠限制小鼠运动耐力的作用及其机制
[49]华癸中慢生根瘤菌多铜氧化酶基因mco的功能研究
[50]中南民族大学教师团队在自然指数期刊《Analytical Chemistry》发表研究成果
生物专业 毕业 论文题目
1、基于多元相场理论的细菌生物膜生长动力学建模及其数值模拟
2、血管紧张素II经酸性鞘磷脂酶/神经酰胺通路致动脉内皮功能障碍的作用
3、盐胁迫对鹅耳枥生长及生理生化特性的影响
4、2种应激诱导大鼠迷走复合体神经元的Fos表达
5、重组大肠杆菌SAHN和Lu_S蛋白表达及群感效应分析
6、基于线粒体控制区Dloop序列的长臀(鱼危)种群遗传结构分析
7、喉功能保留外科的喉功能解剖
8、褪黑素通过减轻内质网应激抗心肌缺血/再灌注损伤的作用及机制
9、生长分化因子-11促进小鼠诱导性多能干细胞向心肌细胞定向分化的研究
10、脂肪因子CTRP3的认识及研究现状
11、治疗性血管化策略研究进展
12、SD大鼠绝经后骨质疏松疾病动物模型的构建
13、牛血清在百日咳毒素CHO细胞簇聚试验中的影响
14、番茄黄化曲叶病毒的鉴定与群体进化分析
15、B细胞受体核心岩藻糖基化调节成熟B细胞的信号转导
16、NaHS对慢性间歇性低氧大鼠胸主动脉血管张力的影响
17、利用果蝇模型探讨SCA3/MJD与PD发病机制的相关性
18、纳米金属氧化物对耐药基因水平转移的影响
19、果胶酶液体发酵条件优化与酶学特性研究
20、丛枝菌根真菌根外菌丝形成时间及对牧草的促生长效应
21、左心耳形态和功能影像学评估的研究进展
22、金胺O荧光染色在结核病病理诊断中的应用价值
23、上海常绿树种固碳释氧和降温增湿效益研究
24、我国生态文明建设试点的问题与对策研究
25、城镇化对物流业碳排放变动影响研究
26、干扰素γ增强脂肪间充质干细胞对淋巴细胞的免疫调节作用
27、血脑屏障的研究进展
28、南北贸易、产权维护不对称与发展中国家生态资源贫瘠化
29、朱溪流域植被覆盖变化与居民点的空间关系
30、布氏田鼠秋季家群数量与捕食风险的关系
31、圆蟾舌蛙鸣声特征分析
32、大渡河流域黄石爬鮡的年龄与生长
33、雅砻江短须裂腹鱼胚胎和卵黄囊仔鱼的形态发育
34、基因序列的搜索与相似性比对
35、阿尔茨海默病早期生物标记物及其检测方法的研究进展
36、促红细胞生成素衍生肽抑制细胞自噬减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤
37、类风湿关节炎并发心血管损害的临床特点与相关因素
38、华卟啉钠的光漂白性质研究
39、采用蚕豆根尖细胞微核技术检测核设施周围水域的遗传毒性
40、鲤鱼墩遗址史前人类行为模式的骨骼生物力学分析
41、稳定微环境微流控细胞培养芯片的设计与制备
42、国产与进口心脏单腔起搏器临床应用比较
43、心房电极导线脱位到心室致反复心室安全起搏一例
44、谷氨酸受体在实验性青光眼视网膜细胞损伤中的作用
45、基于恢复动力学生态系统恢复建设的研究
46、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性
47、一株鸡源乳酸菌FCL67的鉴定及其生物学特性
48、人凝血/抗凝血因子类产品蛋白含量快速检测方法的建立及验证
49、肺孢子菌肺炎相关细胞因子的研究进展
50、气象因素与发热伴血小板减少综合征关联研究
生物技术毕业论文选题
[1]生物技术本科拔尖创新型人才培养模式的探索与实践
[2]禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达
[3]中间锦鸡儿CiNAC038启动子的克隆及对激素响应分析
[4]H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立
[5]单细胞测序相关技术及其在生物医学研究中的应用
[6]动物细胞工程在动物生物技术中的应用
[7]现代生物化工中酶工程技术研究与应用
[8]GIS在生物技术方面的应用概述
[9]现代生物技术中酶工程技术的研究与应用
[10]两种非洲猪瘟病毒检测试剂盒获批
[11]基因工程技术在生物燃料领域的应用进展
[12]基于CRISPR的生物分析化学技术
[13]生物信息技术在微生物研究中的应用
[14]高等工科院校创新型生物科技人才培养的探索与实践
[15]生物技术与信息技术的融合发展
[16]生物技术启发下的信息技术革新
[17]日本生物技术研究开发推进管理
[18]中国基因技术领域战略规划框架与研发现状分析及建议
[19]鸡细小病毒与H_9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立
[20]基于化学衍生-质谱技术的生物与临床样本中核酸修饰分析
[21]合成生物/技术的复杂性与相关伦理 政策法规 研究的科学性探析
[22]合成生物学技术发展带来的机遇与挑战
[23]应用型本科高校生物技术专业课程设置改革的思考
[24]知识可以改变对转基因食品的态度吗?——探究科技争议下的极化态度
[25]基因工程在石油微生物学中的研究进展
[26]干细胞技术或能延缓人类衰老速度
[27]生物技术复合应用型人才培养模式的探索与实践
[28]动物转基因高效表达策略研究进展
[29]合成生物学与专利微生物菌种保藏
[30]加强我国战略生物资源有效保护与可持续利用
[31]微生物与细胞资源的保存与发掘利用
[32]颠覆性农业生物技术的负责任创新
[33]生物技术推进蓝色经济——NOAA组学战略介绍
[34]人工智能与生物工程的应用及展望
[35]中国合成生物学发展回顾与展望
[36]桓聪聪.浅谈各学科领域中生物化学的发展与应用
[37]转基因成分功能核酸生物传感检测技术
[38]现代化技术在农业种植中的应用研究
[39]生物技术综合实验及其考核方式的改革
[40]生物技术处理船舶舱底含油污水
[41]校企合作以产学研为平台分析生物技术类人才培养
[42]生物技术专业“三位一体”深化创新创业 教育 改革
[43]基于环介导等温扩增技术的生物传感器研究进展
[44]分子生物学技术在环境工程中的应用
[45]生物有机化学课程的优化与改革
[46]地方农业高校生物技术专业“生物信息学”课程的教学模式探索
[47]不同育种技术在乙醇及丁醇高产菌株选育中的应用
[48]探秘生命的第三种形式——我国古菌研究之回顾与展望
[49]适应地方经济发展的生物技术专业应用型人才培养模式探索
[50]我国科研人员实现超高密度微藻异养培养
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脑内产生5%，其余的都在肠道里产生，科学方法从粪便中提取多巴胺，目前以有这方面的胶囊，应该可以起到缓解的作用，多巴胺控制情绪的这也是对抑郁症的治疗。人对多巴胺的用量过大会导致情绪上的负面影响，时间长了身体机能下降，对多巴胺产生会有很大影响，另外一个如果无欲无求那么多巴胺可以快速回复，还有就是多巴胺这方面欠缺的人可以多跑步锻炼也可以很有效果，猪是天生的无欲无求，多观察一下猪的习性，可以效仿。
（1）通过饮食增加多巴胺分泌。（2）增加抗氧化成分的摄入量。多巴胺很容易被氧化，抗氧化剂可能会减轻自由基对分泌多巴胺的脑细胞的损伤。很多水果和蔬菜都富含抗氧化成分：β胡萝卜素和类胡萝卜素： 绿黄蔬菜和水果、芦笋、绿花椰菜、甜菜。维生素C：辣椒、橙子、草莓、花椰菜、芽甘蓝。维生素E：坚果、葵花籽、野菜、花椰菜、胡萝卜。（3）经常运动锻炼。运动也增加血液中的钙质，可以刺激大脑内多巴胺的分泌和吸收。长达30到60分钟的散步，游泳既可以加速多巴胺的分泌。（4）保证充足的睡眠。人在睡眠状态时，大脑消耗很少量的多巴胺，这样第二天身体才有充足的多巴胺。每天至少保证8个小时的睡眠时间。
一般情况下，产生多巴胺可以多吃些香蕉、山药、等一些苹果水果之类的。因为多巴胺在医学中是由人体在分泌多巴胺时，会使人的体内产生一种兴奋刺激的感觉，但是如果人的体内多巴胺少的情况下，会是自身的肌肉失去控制操作的能力。所以可以利用饮食的方面，来产生补充多巴胺。
多巴胺可以让人感到快乐。怎样提高多巴胺呢？可以从日常生活中饮食、运动、睡眠等方式提高。
从食物中获取酪氨酸。多巴胺是由一种叫做酪氨酸的氨基酸在体内产生的。酪氨酸被酶转化为多巴胺。如果没有足够的酪氨酸，多巴胺水平就会受到影响。杏仁、鳄梨、香蕉、低脂奶制品、芝麻和南瓜子有助于大脑产生更多的多巴胺。还有其他食物，如豆子（豆腐）、鱼、乳制品和禽肉，它们可以添加酪氨酸。增加饮食中富含酪氨酸的食物的摄入可以使大脑中的多巴胺水平正常化。当酪氨酸的来源较低时，多巴胺的水平就会下降。好好睡一觉。保持充足的睡眠，人体多巴胺在睡眠时会相对静止，消耗量低于每日。充足的睡眠后，它可以在白天保持较高水平的多巴胺，这也更快乐。
限制饱和脂肪的摄入。研究表明，高脂肪饮食，特别是饱和脂肪，会损害多巴胺，特别是当饱和脂肪被频繁大量食用时。虽然没有理论解释为什么饱和脂肪会破坏多巴胺，但饱和脂肪会增加一些炎症。从蔬菜和水果中获取抗氧化剂。吃富含抗氧化剂的食物也是很重要的，因为多巴胺很容易被氧化。富含天然抗氧化剂的饮食可以防止多巴胺受体受损，减少炎症。
所以，通过饮食、运动、睡眠等方式都可以提高多巴胺，快从生活中的小事做起让自己更加快乐吧！
中草药在水产养殖疾病防治上的应用前景概述萧峰西南大学11111111111 1111111摘要：用中草药防治鱼病具有价廉、绿色、环保、无残留等优点，符合无公害养殖要求。中草药的有效成分和作用机制。渔用中草药的水产养殖上存在的问题及未来的发展前景。关键词：中草药、无公害养殖、发展前景随着全球淡水资源和海洋水域环境的恶化，渔业资源量和质量持续下降，此外，水产养殖业也存在水体污染与滥用各种渔药与添加剂等情况，因而环境保护与鱼产品安全成为捆饶人类并亟待解决的问题。正如国际法院法官所说：“通观历史，人类由于经济的或其他的原因一直不断地干扰自然，由于我们的科学知识和日益认识到一欠考虑和未减缓的速度从事这种干扰对人类的危险，可持续发展概念充分表明经济发展与环境保护相协调的需要”。中国是渔业大国，水产品总量占世界总量的1/3，水产养殖量居世界首位，占全世界的2/3，2002年全国水产品总量达4570万吨，养殖量达2600多万吨，且养殖方式趋向于集约化、现代化，但是伴随经济腾飞的同时，各种弊病也接踵而至，如2006年的多宝鱼事件，鳜鱼体内的孔雀石绿残留超标等等问题的出现，让人们更重视食品的安全，自身的健康，不仅如此，抗生素等药物导致的一系列副作用也严重影响着我国水产品的出口，如1998年和1999年的中国出口日本的部分鳗鱼因药物残留超标而被退货，2002年中国出口给欧盟的小龙虾因检出氯霉素而被退货。水产品被拒事例既给国家带来了经济损失，同时也损害了中国水产品的国际形象。1、 中草药的发展随着绿色无公害养殖技术的推广，使水产养殖业健康、可持续发展，开发毒副作用小，无残留，病原体不易产生抗药性的中草药成为当前水产药物研究的重点，在养殖和饲料中使用中草药具有许多化学物质不能媲美的优点，既能改善水体环境，提高药效，控制病原微生物，从而减少疾病的发生，近年来，中草药制剂得到了日益广泛的应用，有望成为将来水产养殖病虫害防治的一个新方向。2、 中草药的有效成分和作用机制2.1 总草药的有效成分中草药是中药和草药的总称，重要是中医常用的药物，草药是指民间所应用的药物，是一种理想的天然、环保的绿色药物，其来源广，成本低，同时其疗效慢，作用时间长。中草药的化学成分极为复杂，一种中草药中往往含有多种化学成分，一般来说，除含有免疫物质外，还含有一些未知促生长活性物质及一定量的蛋白质、氨基酸、糖类、矿物质、维生素、脂肪、植物色素等。这些成分可增强食欲，促进机体代谢和消化酶的分泌，提高营养物质的利用率，从而加速水产动物的生长发育，增强其体质，进而提高机体的免疫力和抗应急能力，降低饲料系数，改善水产品品质。根据中草药添加剂饲喂黄颡鱼试验表明，黄颡鱼在在食用了中草药添加剂后，不仅增重效果明显，而且经济效益高，尤其是当党参，甘草等回味中草药的组成，不仅增重比例高出44.62%饲料系数降低了.0.37%，蛋白质效率也提高了0.4%。增重率=（试验终末重—初始重）/初始重*100%饲料系数=饲料摄食量/净增重蛋白质效率=（试验终末重—初始重）/（总投饲量*饲料中蛋白质的含量）*100%而且益气补血，保肝利胆，清热解毒的作用。2.2 中草药的作用机制中草药提取于自然并保存了其自然结构和生物活性的天然物质，已具有多种营养成分和生物活性物质，低残留、毒副作用小、多功能性、能全面调解机体的生理功能，兼具营养物质与药物的双重作用。其含有的免疫活性物质是多糖、有机酸、疳类，生物碱及其一些挥发性物质，但每一种有效成分对肌体的免役系统的调节方式都不一样，多糖具有刺激网状内及系统，诱导淋巴细胞，脾脏细胞再生，增加巨噬细胞的功能，提高从细胞杀伤活力，诱导产生干扰素等作用，能提高机体的免疫反映能力，有机酸能增强巨噬细胞的吞噬功能，增强机体的免疫功能。疳类可诱导细胞产生干扰素、白细胞介素-Ⅱ及淋巴毒素，增加体细胞的数量，提高巨噬细胞的吞噬功能，大多数清热解毒类中草药含有的生物碱、黄酮、香豆精等抑制或杀灭病原微生物，黄连素可与DNA形成复合物，抑制DNA合成，黄酮能影响细菌的呼吸，抑制起RNA的合成。金银花可作用于细菌的细胞壁，抑制细胞壁的合成，黄芪可刺激细胞产生干扰素，直接抑制或破坏病菌的繁殖能力。作为免疫增强剂，中草药在水产动物机制处于病理状态时还具有双向的调节作用，双向调节作用是指对同一器官组织的不同功能状态（促进和抑制）均衡调整，直至起正常为止，即时于亢进的状态，同时对其进行抑制直至降低至最低水平，既可使异常高的DNA合成亢进状态降低至生态状态，又可将DNA的合成抑制状态调至兴奋，直至处于正常状态，这是中草药的多功能性的独特表现之一，每种中草药均含有多种成分，其中有的含有对某一器官组织起兴奋的作用，又有对这一器官起抑制作用的成分，虽然有的中草药含有二种作用相反的成分，但有的成分对某器官组织的不同系统进行调节，起到反向的调节作用。.防治水产养殖疾病的几种常用的中草药3.1大黄。又名锦纹、黄良，别名将军、生军、马蹄黄等，系多年生草本植物，以根及根状茎入药。本品抗菌作用强，抗菌谱广，其有效成分为蒽醌衍生物，其中以大黄酸、大黄素及芦荟大黄素的抗菌作用最好，有收敛、泻下、增加血小板、促进血液凝固等作用。用于烂鳃病、出血病及白头白嘴病等。使用方法：全池泼洒，常用量为2.5～3.75ppm，临用前，先将池水需用的大黄量，用0.3%的氨水按1∶20比例，在室温浸泡下经12～24小时，取药液均匀洒入水中，可有效防治鱼粘细菌病。本品与硫酸铜合用，即大黄1～1.5ppm与0.5ppm浓度的硫酸铜联用，可提高疗效。内服，5～10克/公斤体重鱼，大黄碾成细粉末混入饲料内，每天1次，连用3天，可防治粘细菌病；连用7天，再泼洒硫酸铜(0.7ppm)，对草鱼出血病效佳。也可按每公斤鱼重用2.5g大黄、1.5克黄柏、1克黄芩、5克食盐与饵料混匀制成药饵投喂， 每天1次，连服3天。此外，肠炎病、细菌性烂鳃病、白头白嘴病也可用大黄治疗，有一定效果。3.2 大蒜。为百合科、葱属植物，以鳞茎入药，具特异的辛辣味和蒜臭，其有效成分为大蒜类。大蒜素具有广谱抑菌止痢、驱虫及健胃作用，常用于防治鱼类肠类病。使用方法：每100公斤鱼用大蒜0.5～1公斤拦入饲料中投喂，6天为一疗程，若加入等量食盐，可提高其作用，用于防治烂腮病、肠炎病；取大蒜晒干加水煎汁，以 10～30ppm浓度浸洗鱼体1小时，可杀死锚头鳋，防治鲤鱼竖鳞病。3.3.地锦草。红茎草，为大戟科一年生草本，折断茎杆后有乳白色奶汁状液体流出。地锦草含黄酮类化合物及没食子酸，有较强的抑菌作用，抑菌谱较宽，并有止血和中和毒素的作用。主治鱼类肠炎、烂腮病。使用方法：每100公斤鱼用干地锦草500克(或鲜地锦草2000～2500克)煮汁，连渣拦入饵料中投喂，一日二次，3天为一疗程。 在投药前，用20ppm石灰乳全池泼洒，疗效更佳。3.4.水菖蒲。名水敛草、石菖蒲、石蜈蚣、 白菖蒲，系多年生草本。 本品含芳香挥发油1.5～3.0%，油中主要为油辛醇、细辛酸、甲基丁香酚、倍丰萜烯类等，含有非结晶性苦味。可防治肠炎、赤皮、烂腮、水霉病等。使用方法：每亩水深1米，用切碎的菖蒲4～5公斤，用蓖麻叶4～5公斤，裹在10公斤左右的松树叶上，扎成 2～3捆，放置于食场及上风口进水处， 浸没在水中，每天翻动一次，促使其腐烂。每亩水深1米的水体用菖蒲1.3～2.5公斤，加食盐0.5～1公斤，全池遍洒，可治愈水霉病。3.5.苦楝。名楝树，为楝科落叶乔木，高15～20米。喜野生于田野、林边等处，本品含川楝树、生物碱、岩藻糖、萘酚等，有杀虫、杀菌作用，用于防治寄生虫性鳃病，以及锚头鳋、中华鳋、毛细线虫、车轮虫、隐鞭虫病等。使用方法：每亩水深1米用马尾松、苦楝树叶、皮或果各10～12.5公斤，切碎熬汁成12～25公斤，全池遍洒，每日一次，连用2～3天。 取苦楝树枝叶30～40公斤，直接在池中堆沤，5～7天后捞出残渣，能有效防治上述各病。3. 6.五倍子。又名倍子、百药煎、百虫仓等，为漆科植物盐肤本的叶上的干燥虫瘿， 由五倍子的蚜虫寄生而成，含大量鞣酸，能凝固蛋白质，有较强的杀菌能力，对革兰氏阳性和阴性细菌均有抑制作用，用于防治白头白嘴病、粘细菌病、气单胞菌病、假单胞菌病、白皮病、赤皮病、疖疮病等。使用方法：先将五倍子捣碎，用开水冲溶，全部溶解后，用池水稀释全池泼洒，常用量为2～4ppm。3.7.乌桕。名油子树、白乌桕、木梓树等，为落叶乔木。其果、叶有拔毒消肿和杀菌作用，常用于防治细菌性烂腮病、白头白嘴病等。使用方法：每50公斤鱼，用乌桕叶干粉250克混入饵料中制成药饵投喂，连喂3～6天，可防治鱼烂腮病；也可用干叶粉按4ppm计算药量，兑20倍饱和的石灰水液，浸泡6～12小时后，全池泼洒。3.8.黄芩。为唇形科植物黄芩的根，有粘毛黄芩、滇黄芩、川黄芩、丽江黄芩、甘肃黄芩等，含黄芩素、黄芩甙、汉黄芩素、黄芩新素等5种黄酮成分。此外，尚含β-谷甾醇、苯甲酸、黄芩酶等。黄芩有抗炎、镇静、抗菌性病毒的作用。主要用于防治烂腮、疖疮、打印病、出血性败血症、肠炎病、尾柄病等。使用方法：取黄芩粉碎成细粉，按5%的比例加入饵料中自由投喂，5天为一疗程；或将黄芩切细加水浸泡24小时后，煎煮三次，使水溶液浓度为1%，全池泼洒，一日一次，连用3天。3.9、黄连。又名鸡爪连、川连、味连、土黄连，多年生草本植物。以根状茎入药，有抑菌、消炎、解毒功能，主要用于防治细菌性肠炎。3.10、黄柏。又名案木、聚皮、元柏，落叶乔木。以树皮入药，有抑菌、解毒、消肿、止痛等功能，可防治草鱼出血病和细菌性鱼病。用法是将干的黄柏、黄苓、黄连、板蓝根和大黄（合用和单用均可），每千克鱼五克，打成粉后拌盐五克，投喂或制成药饵，每天一次，连喂7天。3.11 生姜。姜科， 多年生草本，高40到100cm，含姜醇、姜烯等挥发油，性微温，味辛，具有杀菌、解毒、杀虫和消炎的作用。将姜汁涂抹于鱼体伤口处即可。3.11 芦苇。 多年高大草本，有清热、利尿、消炎的功效，可防治草鱼肠炎病，按每万尾鱼种用芦苇根5千克，加大蒜0.25千克和食盐0.25千克。打成浆。拌喂或制成药饵，每天2次，连喂4-6天。4、中草药在养殖上存在的问题4.1 中草药本身含有多种有效成分，它对水生动物的免疫增强效果是多种成分综合作用的结果，且不同地区，不同季节和不同时期采集的中草药，其有效成分相差很大，而且对其产品难以进行准确的药萧评价和质量控制。目前尚无严格的质量控制标准。很难保证生产出质量稳定的定型产品，4.2 科技含量低 目前绝大多数中草药，无论是单味还是复味，仍停留在原始的散剂和煎剂上，精制品少，因此产品科技含量不高制约了他向更高层次的发展。4.3 中草药的作用机理的研究大多用传统的中医理论，远远不能解释真正的作用机理，因而有研究一般只限于对中草药饲料效果进行评价，探讨其对水产动物的增重，抗病等方面的影响，而没有深入到其对水产品品质的研究，这还有待于进一步的研究。5.中草药的水产养殖上的应用前景随着水产养殖业的迅速发展，特别是名、特、优水产品的养殖日益增加，中草药也符合人们的安全和环保要求，所以中草药运用也越来越多，今后运用中草药应针对适应水生动物特点，研究药物的离子通道、作用机制、运转规律、转化过程及药物结构和药效关系等，尽快搞清鱼药和中草药的水生动物作用中的吸收、分布很转化和排泄规律及药物对环境规律的影响，提出在重要养殖水产品体内的掺留期及残留量，制定水产品上市前的保留期，研究制定使用方法，随着绿色无公害水产品养殖的推广，对防治有效的绿色中草药的研究必然会越来越多，中草药成为中国的传统魂宝将会成为防治鱼病的主要药物，也必然会走向世界。参考文献1. 李登来 水产动物疾病学 中国农业出版社 2004（5）31-442. 魏清和 水生动物营养和饲料学 中国农业出版社 2004（5）3. 王权 谢献胜 中草药在水产养殖疾病防治上的运用 水产科技情报 2006（4）163-1684. 胡梦红 抗生素在水产养殖上的运用 水产科技情报2006（5） 217-2215. 刘玉林 周永奎 诱食剂在水产饲料中的运用 淡水洋鱼2006（7）62-636. 褚小林 渔业生态标签制度及其启示 水利渔业 2006（5）60-627. 田海军 郑阳 渔用中草药复方疗效等研究概述 水利渔业 2006（6）78-1008. 孙克年 用林产重中药防治鱼吓鱼病 养殖与饲料 2006（9）22-249. 韩庆 马雨林 不同中草药添加剂饲喂黄颡鱼试验 养殖与饲料 2006（12）54-5610. 曹克驹 名特优水产动物养殖学 中国农业出版社 2003（12）
1，宏基因组提取；提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，除需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA 片段的完整和纯度。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集，常用的富集方法有稳定同位素探针、抑制性消减杂交、差异显示、噬菌体展示、 亲和捕获及DNA微阵列等技术。2，测序分析：采用Solexa进行宏基因组 DNA测序，首先对特定环境微生物种群全基因组DNA进行提取。在提取微生物种群的DNA后制备DNA文库，具体步骤如下：（1）将DNA随机打断成200-500bp的片段；（2）对DNA末端进行修复；（3）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；（4）在DNA片段的末端加上接头；（5）纯化连接产物；（6）PCR扩增连上接头的DNA片段；（7）检测测序文库。
学术堂整理了十个关于大肠杆菌的论文题目,供大家参考:1、大肠杆菌表达系统的研究进展2、重组大肠杆菌高密度发酵研究进展3、山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定4、大肠杆菌mtID基因和gutD基因的克隆,全序列测定和高效表达5、我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定6、中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究7、大肠杆菌毒力因子研究概况8、致病性大肠杆菌的耐药性监测9、动物大肠杆菌耐药性的变化趋势10、纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制
分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在E.eoli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，etal.Basieloealalign- mentsearehtool . 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修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时