1.形态和培养特征观察 采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导 2.生长条件试验 (1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L) ; (2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7) ; (3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) 。 分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。 3.生理生化试验 ⑴过氧化氢酶测定 将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。⑵葡萄糖产酸产气实验 在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。⑶淀粉水解实验 接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。⑷明胶液化实验 将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应⑸甲基红（M.R）试验 接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。⑹乙酰甲基甲醇V-P实验 接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养2天后,取培养液1mL在其中 加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性⑺柠檬酸盐 取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性⑻酪素水解试验 牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固⑼厌氧生长测定 将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性(10)厌氧硝酸盐产气 接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。 观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。(11)石蕊牛奶的反应 牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况(12)糖发酵实验 将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中,按表分装含5mL培养基的试管.分别取0.2mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h,振荡培养。检测时取培养液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱. 附一些培养基： ①PY培养基（100mL）：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,无机盐溶液4.0mL[盐溶液成分:无水CaCl2 0.2g,MgSO4 20.0g ,K2HPO4 1.0g, ,KH2PO4 1.0g,NaHCO3 10.0g,NaCl 2.0g](将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中,再加500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类.继续搅拌直到全部溶解,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于4℃) ②PYG培养基:PY在基础培养液内加入1.0g葡萄糖 ③营养明胶 蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.0；加热溶解、校正至pH7.4～7.6，分装小管，121℃高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8～7.0 ④柠檬酸盐斜面培养基：柠檬酸钠 3g NH4H2PO4 1g MgSO4 0.2g K2HPO4 1g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000mL 加热溶解后，调pH至7，再加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10mL,培养基呈绿色，分装试管，每管5mL，121灭菌30min ⑤含硝酸钾的营养肉汤 加入2g硝酸钾入营养肉汤 4.16S rDNA 序列分析 5.生长曲线 活菌计数方法：采用涂布法,进行菌落计数，每隔一段时间（2-4小时）。
你可以查阅产蛋白酶菌株筛选方面的文献，里面都会对菌株的分解蛋白的能力进行测定，我做过几个着方面的实验，知道一些基本方法：方法一、水解圈法：将你的菌株涂布干酪素平板培养基（配方在网上或一般的微生物学教科书上都能找到），适宜的温度下培养至菌落周围有明显的水解圈出现（培养温度根据你的菌株而定）。测定水解圈直径（D）和菌落直径（d），计算HC值（HC=D/d），菌落的HC越大说明此菌落分解蛋白的能力越强。方法二、明胶穿刺培养法：用明胶在试管内配置半固体培养基（注意不能有气泡），穿刺接种你的菌株到里面，适宜温度下培养，直至可观察到明显的水解小泡。水解小泡大的说明水解蛋白的能力强。方法三、蛋白酶活力测定法：将你的菌株涂布平板，分离单菌落，摇瓶发酵（发酵的时间最好作个优化），然后直接取发酵液的测定酶活（可用 Follin法测）。此外还有好几种方法，不过以上几种比较常用。第一和第二中比较好操作，但只能是对菌株的蛋白酶分解能力进行粗略估计，第三种如果操作的好的话，得到结果相对比较精确。有关这些操作的具体步骤、试剂和各种所需培养基配方可在相关文献中查到。我的QQ是258612400，如果在具体的操作中遇到困难，可在QQ上交流。
具体我也没做过。不过可以提供你两个思路。第一是镜检，看形态。第二就是PCR，P它的16S亚基，可以很精确的分类。
太麻烦的，要有条件，把样品稀释后，例如估计含乳酸菌的量，稀释到每毫升大约30-300个左右，再用特殊的平板培养基，添加了1%碳酸钙的平板培养基，采用倾注法与呈液体状态的40度含碳酸钙的琼脂营养培养基混合，倒制于90毫米在小平皿中，培养后，长出菌落，同时，菌落周围有透明圈的，就是乳酸菌，还可以计数，再剩稀释倍数，还可得含量。
提供有氧环境霉菌和酵母菌可存活，提供无氧环境乳酸菌和酵母菌可存活。 1酵母菌富集培养基
酵母菌是真核单细胞生物，具有成行的细胞核,是用来发酵面粉或酿酒时的发酵的真菌乳酸菌是酸化食品保护自己的,但被人类利用, 是典型的原核生物，具有拟核与仅有的细胞器‘核糖体’的细菌,虽都是微生物,但菌种不同,生活地区不同,作用不同
酵母菌是真核单细胞生物，具有成型的细胞核，也具有如‘线粒体’‘核糖体’等真核生物才具有的细胞器，酵母菌的生殖方式分无性繁殖和有性繁殖，以无性繁殖为主，主要为出芽生殖。而乳酸菌则是典型的原核生物，具有拟核与仅有的细胞器‘核糖体’，是一类以糖为料发酵产生乳酸的细菌, 革兰氏染色呈阳性, 生殖方式为裂殖，即‘二分裂’. 一定记牢哦 1酵母菌富集培养基 葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05% 孟加拉红0.003% pH4.5 2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌 甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02% 二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5% 酵母菌在自然界中广泛分布，主要生长在偏酸性的含糖环境中，以水果、蔬菜的表面和果园的土壤中最为常见。酵母菌主要营腐生生活，在生态系统中属于分解者。酵母菌的用途相当广泛，涉及到工业、农业、畜牧业、医学和现代生物学技术等诸多领域。在现行的高中生物学教材中，常以酵母菌作为一种代表生物，在历届高考中也常以“酵母菌”为素材来命题。考查的知识面广，命题角度多样，并且与现实生活联系紧密。因此，应将高中生物教材中有关“酵母菌”的知识进行归纳、整理，构建知识结构体系，才能达到高三复习应有的广度和深度。下面就根据自己的教学体会来谈谈对酵母菌的复习，谨供老师和同学们在复习时参考。一、形态结构：酵母菌是典型的单细胞真核微生物，无鞭毛，不能运动。其细胞直径一般比细菌直径粗10倍。一般呈球形、卵圆形或柱形，大多数酵母菌菌落呈圆形，比细菌大而厚。菌落的色泽、质地、表面和边缘形状等特征，是酵母菌菌种鉴定的重要依据。细胞结构类似高等生物，由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核构成，在成熟的酵母菌细胞中，有一个大型的液泡，其内含有一些水解酶等物质。
具体我也没做过。不过可以提供你两个思路。第一是镜检，看形态。第二就是PCR，P它的16S亚基，可以很精确的分类。
我也在做这个，下面是我整理的，时间关系只能这样了，可以看看。都要求无菌操作 菌种的分离 取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀 释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C恒温下 培养48h。挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜 检，茵体一致)。结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。再分别转移 到试管斜面上进行保存。 分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2 ；保存用斜面培养基：酵母膏1％ ，碳酸钙2％ ，葡萄糖1％ ，琼脂2％ ，pH 7．0。 培养条件 将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上， 在30。【=恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。 测定方法 菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性 及含量测定依据食品检验技术 1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序 自然发酵酸奶---稀释---培养---挑起单菌落染色、镜检一挑 选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优 良菌株一试管穿刺低温保存。 1．2 1．2 乳酸菌的鉴定 用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。生理生化特征鉴定：产乳 酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应�6�8、明胶水解反应 、硫化氢反应 、乳酸菌 发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。 1．2．I．3 乳酸菌的保存�6�8 采用定期移植低温保藏法。培养基配方：葡萄糖1％ 、蛋白胨0 2％ 、 l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。c灭菌30min。将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺 培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。 1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验 1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度 计上，用最大吸收光波长 =6001RIifl测定。 1．2．2．2 生长周期的测定oD值(方法同上)；pH值：PHB一4pH计；可滴定酸(以乳酸计)：吸取ImL菌液 加入9Ⅱ1L蒸馏水，加入1～2滴酚酞，用0．1NNaOH滴定。 1．2 2．3 最适pH值的测试、最适盐浓度的测试。 供试样品及培养基 分离用样品：酸奶、酸奶及西红柿均为市售 分离用培养基：①BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0 04g，琼脂15g， 蒸槽水lO00ml，pH7 0；②MRS培养基见文献 。 菌种保藏用培养基：脱脂乳培养基：新鲜牛乳离心去掉上层乳脂，下层奶液分装试管，105℃ 灭菌20mln。 菌利 鉴定用培养基见文献 6。 1 2 方法 1 2 1 乳酸菌的分离纯化 取泡菜汁、酸奶、西红柿表面洗液进行梯度稀释，分别用倾注法、涂布 法和划线法在BCP和MRS培养基平板上进行菌种分离。挑取在BCP平板上有透明目的菌落，在 MRS平扳上有溶钙圈的菌落，反复纯化至纯种，挑菌至脱脂牛奶试管中保存 1．2 2 乳酸菌复筛对初筛菌株进行革兰氏染色，保留革兰氏阳性菌株．并对其所产乳酸能力进 行定性、定量分析，筛选出产酸高的菌株保存，再把产酸高的菌株经萝l、汁发酵 】，进一步选择产 酸高、_l】味纯正的菌株保存鉴定 1 2 3 乳酸定性测定果用纸层析法。溶剂系统为乙醇：浓氨水：水=80：5：15，显色剂为0 04％ 的溴甲酚紫酒精溶液。层析时将乳酸、柠檬酸配成1％ 的标准溶液，两种标准溶液 及乳酸发酵液 均点样3 ．上行层析，显色与标准样比较 1．2 4 乳酸的定量测定采用气相色谱法，利用苄酯化法制备乳酸衍生物，将待测乳酸菌株在产 酸培养基内37"C培养3d，离心。取上清液剃备衍生物，气相色谱分析含量。气相色谱工作条件为： EGS色谱柱，柱温160'C，气化温度180'17．，检测器温度l70"C，载气为N，。 1．2 5 菌种鉴定根据《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》 和《一般细菌常用鉴定手册》[6 对复筛 出的菌株的形态、生理生化、碳源利用等方面进行系统鉴定，并提取乳酸菌株DNA，采用熔链温度
国际会议特邀报告：1. 2009年8月，第7届中日韩反刍动物瘤胃生理与调控学术研讨会Keynote speech，韩国，首尔。2. 2008年9月，第13届亚澳动物科学代表大会 (13th AAAP Animal Science Congress)作动物营养专题报告（invited paper），越南，河内。3. 2007年9月，第七届国际草食动物营养研讨会，大会特邀报告(plenary paper)，北京；发表的主要论文 (* 为通讯作者)1) Dai ZL, Zhang J, Wu G, Zhu W-Y*, 2010. Utilization of amino acids by bacteria from the pig small intestine. Amino Acids, 39 (5): 1201-1215.2) Huang RH, Qiu XS, Shi FX, Hughes CL, Lu ZF, Zhu W Y*. 2010. Effects of dietary allicin on health and growth performance of weanling piglets and reduction in attractiveness of faeces to flies. Animal, (first view)3) Pei CX, Mao SY, Cheng YF, Zhu W-Y*, 2010. Diversity, abundance and novel 16S rRNA gene sequences of methanogens in rumen liquid, solid and epithelium fractions of Jinnan cattle. Animal, 4(1):20–294) Sun YZ, Mao SY, Zhu W-Y*. 2010. Rumen chemical and bacterial changes during stepwise adaptation to a high concentrate diet in goats. Animal, 4(2):210–2175) Cheng Y F, Edwards J E., Allison G G., Zhu W-Y* and Theodorou M K., 2009. Diversity and activity of enriched ruminal cultures of anaerobic fungi and methanogens grown together in consecutive batch culture. Bioresource Technology, 100 (2009) 4821–4828.6) Lu Y, Sarson AJ, Gong J, Zhou H, Zhu W-Y, Kang Z, Yu H, Sharif S, Han Y. Expression profiles of genes in Toll-like receptor-mediated signaling of broilers infected with Clostridium perfringens. Clinical and Vaccine Immunology, 2009, 16(11):1639-1647.7) Iqbal MF, Zhu W-Y*, 2009. Characterization of newly isolated Lactobacillus delbrueckii –like strain MF-07 isolated from chicken and its role in isoflavone biotransformation. FEMS Microbiology Letters, 291 (2): 180-187, FEB 20098) Iqbal MF, Zhu W-Y*, 2009. Bioactivation of flavonoid diglycosides by chicken cecal bacteria. FEMS Microbiology Letters, 2009, 295, 30-41.9) Cheng YF, Mao SY, Liu JX, Zhu WY*, 2009. Molecular diversity analysis of rumen methanogenic Archaea from goat in eastern China by DGGE methods using different primer pairs. Letters in Applied Microbiology, 2009, 48(5):585-592.10) Zhou, W, Wang, GJ, Han, ZK, Yao, W, Zhu, WY. 2009. Metabolism of flaxseed lignans in the rumen and its impact on ruminal metabolism and flora. Animal Feed Science and Technology, 150 (1-2): 18-26.11) Zhou, W, Han, ZK, Zhu, WY, 2009. The metabolism of linseed lignans in rumen and its impact on ruminal metabolism in male goats. Journal of Animal and Feed Science, 18 (1): 51-60 200912) Su Y, Yao W, Perez O, Smidt H, Zhu W-Y*, 2008. Changes in abundance of Lactobacillus spp. and Streptococcus suis in stomach, jejunum and ileum of piglets after weaning. FEMS Microbiology Ecology, 66:546-555.13) Yu ZT, Yao W, Zhu WY*, 2008. Isolation and identification of equol-producing bacterial strains from cultures of pig faeces. FEMS Microbiol Lett 2008, 282:73–80.14) Su Y, Yao W, Perez-Gutierrez ON, Smidt H, Zhu WY*.2008. 16S ribosomal RNA-based methods to monitor changes in the hindgut bacterial community of piglets after oral administration of Lactobacillus sobrius S1. Anaerobe, 14(2): 78-86.15) Mao SY, Zhang G, Zhu WY*, 2008. Effect of disodium fumarate on ruminal metabolism and rumen bacterial communities in goat as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA. Animal Feed Science and Technology, 140 (2008) 293–306.16) Mao SY, Zhang G, Zhu WY*, 2008. Effect of disodium fumarate on ruminal metabolism and rumen bacterial communities in goat as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA. Animal Feed Science and Technology, 2008, 140: 293–306.17) Iqbal MF, Cheng YF, Zhu WY*, Zeshan B, 2008. Mitigation of ruminant methane production: current strategies, constraints and future options. World J Microbiol Biotechnol, 24:2747-2755.18) Sun YZ, Mao SY, Yao W, Zhu WY*. 2008. DGGE and 16S rDNA analysis reveals a highly diverse and rapidly colonising bacterial community on different substrates in the rumen of goats. Animal, 2008, 2 (3): 391–39819) Guo, YQ, Liu, JX, Lu, Y, Zhu, WY, Denman, SE, McSweeney, CS, 2008. Effect of tea saponin on methanogenesis, microbial community structure and expression of mcrA gene, in cultures of rumen micro-organisms. Letters in Applied Microbiology, 47(5):421-426.20) Zhang, CM, Guo, YQ, Yuan, ZP, Wu, YM, Wang, JK, Liu, JX, Zhu, WY. 2008. Effect of octadeca carbon fatty acids on microbial fermentation, methanogenesis and microbial flora in vitro. Animal Feed Science and Technology, 146(3-4):59-269.21) Mao SY, Zhu WY*, Wang QJ, Yao W. 2007, Effect of daidzein on in vitro fermentation of micro-organisms from the goat rumen. Animal Feed Science and Technology, 136：154-163.22) Mao SY, Zhang G, Zhu WY*, 2007, Effect of disodium fumarate on in vitro rumen fermentation of different substrates and rumen bacterial communities as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA. Asia-Australian Journal of Animal Sciences, 20 (4): 543-549.23) Liu W, Mao SY, Zhu WY*, 2007. Impact of tiny miRNAs on cancers. World Journal of Gastroenterology, 13(4):497-502.24) Yu QH, Dong SM, Zhu WY, Yang Q, 2007. Use of green fluorescent protein to monitor Lactobacillus in the gastro-intestinal tract of chicken. FEMS Microbiology Letters, 275 (2): 207-213.25) Wang HF, Zhu WY, Yao W, Liu JX, 2007. DGGE and 16S rDNA sequencing analysis of bacterial communities in colon content and feces of pigs fed whole crop rice. Anaerobe 13: 127-133.26) Li MY, Zhou GH, Xu XL, Li CB, Zhu WY. Changes of bacterial diversity and main flora in chilled pork during storage using PCR-DGGE. Food Microbiology, 2006, 23: 601-611.27) Zhu WY*, Mao SY, Liu JX, Cheng YF, Iqbal MF, Wang JK, 2007. Diversity of methanogens and their interactions with other microorganisms in methanogenesis in the rumen. Plenary Paper, Proceedings of the 7th International Symposium on the Nutrition of Herbivores, pp 125-139, Beijing, September 17 – 22, 2007.28) Zhu WY*, Iqbal M F, Cheng YF, Liu JX, Mao SY, 2008. Rumen methanogenesis and nutritional approaches to the mitigation of ruminant methane. Invited paper, The 13th Animal Science Congress of the Asian – Australasian Association of Animal Production Societies, International Symposium: ”Recent Advances in Ruminant Nutrition”, pp 33-40, 2008/9/2229) Zhu WY*, Mao SY, Cheng YF, Liu JX, Wang JK, 2009. Rumen microbial communities involved in methanogenesis and nutritional strategies to mitigate. Invited Keynote Speech: The 7th Korea-Japan-China Joint symposium on Rumen Metabolism and Physiology, 2009/8/5.30) Han ZK, Wang GJ, Yao W, Zhu WY*. 2006. Isoflavonic phytoestrogens - new prebiotics for farm animals: a review on research in China. Current Issues in Intestinal Microbiology, 7:53-60.31) 毛胜勇，王新峰，朱伟云，2010. 体外法研究延胡索酸二钠对瘤胃微生物发酵活力及甲烷产量的影响。草业学报，19（2）：69-75。32) 毛胜勇，龙黎明，朱伟云，2010. 体外研究反刍兽新月形单胞菌及与酵母联用对瘤胃微生物发酵的影响。草业学报，19（8）：176-186。33) 陆扬，姚文，苏勇，朱伟云*, 2010. 大豆苷元对断奶仔猪胃肠道发育的影响. 南京农业大学学报，33(2):91-95.34) 成艳芬，朱伟云*，2009. ARISA方法研究产甲烷菌共存及去除条件下瘤胃真菌多样性变化。微生物学报，2009， 49（4）：504-511.35) 杭苏琴，戴兆来，朱伟云*，2009，甘露寡糖对纯培养和共培养的乳酸杆菌体外生长的影响。微生物学通报，2009，36（1）：51-56.36) 于卓腾，姚文，朱伟云*，2009，体外培养发现二花脸猪粪样菌群具有降解大豆黄酮产生雌马酚的能力。南京农业大学学报，2009，32（1）：164-167。37) 刘相玉，毛胜勇，朱伟云*，2009，高精料日粮条件下酵母培养物对瘤胃细菌体外发酵的影响。动物营养学报，2009，21（2）：199-204.38) 龙黎明，毛胜勇，苏勇，朱伟云，一株瘤胃源乳酸利用菌的分离鉴定及其体外代谢特性研究。微生物学报，2008，48（12）：1571-1577。39) 苏勇，姚文，朱伟云*，代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus 菌株。微生物学报，2008，48(5)：1~6。40) 戴兆来，董红军，林勇，黄瑞华，朱伟云*，合生元组合筛选及对仔猪生产性能和腹泻的影响。南京农业大学学报，2008，31（2）：81-85。41) 裴彩霞， 毛胜勇， 朱伟云*，晋南牛瘤胃中古菌分子多样性的研究。微生物学报，2008，48（1）：8-14。42) 俞晓辉，姚文，施学仕，朱伟云，大豆发酵蛋白替代鱼粉对断奶仔猪生产性能和肠道主要菌群的影响。动物营养学报，2008，20（1）：46-51。43) 罗玉衡，朱伟云*，2007，消化道微生物区系与肥胖关系的研究进展。微生物学报，47（6）：1115-1118。44) 刘威，朱伟云*，姚文，毛胜勇，2007，一株乳酸利用、丁酸产生菌的分离与鉴定及代谢特性的初步研究。微生物学报，47（3）：435-440。45) 张耿，朱伟云*，刘相玉，毛胜勇，2007，延胡索酸二钠对瘤胃微生物体外发酵不同饲料成分的影响。草业学报，16：112-117。46) 于卓腾 姚 文 毛胜勇 朱伟云*，2007，黄豆苷元对仔猪肠道微生物区系的影响。营养学报，29（1）：82-86。47) 姚光国，姚文，陆扬，朱伟云*，2007，乳酸菌肽聚糖部分免疫增强作用的研究。微生物学通报，34（1）：105-107。48) 成艳芬，毛胜勇，裴彩霞，刘建新，朱伟云*，共存于厌氧真菌分离培养液中瘤胃甲烷菌的检测及其多样性分析。微生物学报，2006，46（6）：879-883。49) 孙云章，毛胜勇，姚文，朱伟云*，2006，不同精粗比底物下瘤胃真菌和纤维降解细菌共培养发酵特性及菌群变化。微生物学报，46（3）：422-426。50) 姚文，朱伟云*, 毛胜勇，2006，16S rDNA技术跟踪分析新生腹泻仔猪粪样细菌区系的变化。微生物学报，45（1）：150-154。专利等成果1. 发明专利：一种芽孢乳杆菌及其生产的活菌制剂。（授权公开日：2007年6月20日）；2. 国家发明专利受理一项：绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法。3. 成果鉴定：仔猪肠道微生物区系研究及芽孢乳杆菌S1研制。苏科鉴字【2004】第1308号。鉴定形式：会议鉴定。组织鉴定单位：江苏省科技厅。鉴定日期：2005年1月29日。
xuè qīng rǔ suān tuō qīng méi
Lactic Dehydrogenase
乳酸脱氢酶（LDH或LD）是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酮酸与L乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α酮酸。LDH广泛存在于人体组织中，以心、肾、骨骼肌含量最高，肝、脾、胰和肺组织次之，各组织的细胞浆内该酶活力为血清的500～1000倍，红细胞内酶活性为血清的100倍。LDH测定方法主要有比色法和连续监测法。
血液生化检查 > 酶类测定
血液
（1）比色法：LDH以NAD＋作氢的受体，催化乳酸脱氢，生成丙酮酸，后者与2，4二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液呈红色，根据颜色深浅求出酶活性。
（2）连续监测法：LDH可催化L乳酸生成丙酮酸，同时NAD＋还原成NADH，在340nm处吸光度的增高速率与酶活力成正比。
（1）比色法：
①底物缓冲液（含0.3mol/L乳酸锂，pH8.8）：取乳酸锂2.88g，二乙醇胺2.1g，加蒸馏水约80ml溶解，以1mol/L HCl调pH8.8，加水至100ml。
②11.3mmol/L辅酶Ⅰ（NAD）溶液：称氧化型辅酶Ⅰ 15mg，溶于20ml蒸馏水中，冰箱保存可用2周。
③1mmol/L 2，4二硝基苯肼（DNPH）溶液：称取DNPH 200mg，加10mol/L HCl 100ml，溶后加水至1000ml，置棕色瓶内室温保存。
④0.4mol/L NaOH溶液。
⑤1mmol/L丙酮酸标准液：称取丙酮酸钠（AR级）11.0mg，以底物缓冲液溶解并稀释至100ml，临用前配制。
（2）连续监测法：
①55mmol/L乳酸锂Tris缓冲液：称取乳酸锂5.28g，Tris 6.68g，溶于800ml蒸馏水中，在37℃水浴箱中用1mol/L HCl调pH至8.9（约需46ml），加水至1000ml，冰箱保存。
②12mmol/L NAD溶液：称取NAD 79.6mg，溶于10ml蒸馏水中，冰箱保存可用2周。
③基质应用液（含NAD 6mmol/L）：根据当天用量将上述NAD溶液和乳酸钾Tris缓冲液等量混合即可。商品试剂盒按其说明溶解，恢复至室温25℃使用。
（1）比色法：按表1操作。
混匀，室温放置5min后，在440nm波长，比色杯光径1.0cm，蒸馏水调零点，读取各管吸光度，以AUAC之差值查标准曲线，求出LDH活力单位。
附注：
①乳酸钾、乳酸钠也可作为LDH底物，但因其为水溶液，含量不够准确，且保存不当易产生酮酸类物质，抑制酶促反应。而乳酸锂为固体，稳定，易于称量。
②除二乙醇胺缓冲液外，也可用Tris或焦磷酸缓冲液，避免了原金氏法中甘氨酸缓冲液对LDH的抑制作用，提高了阳性检出率。
③比色应在5～15min内完成，否则吸光度降低。
④结果＞2500U时，可用生理盐水稀释标本后再测，其结果乘以稀释倍数。
（2）连续监测法：各实验室可根据本室生化自动仪型号及说明书操作。主要参数为340nm波长，37℃，吸样量500μl，连续监测时间60s，标本与试剂体积之比为1∶50。
附注：
①标本勿溶血，当溶血达Hb 0.8g/L时，LDH活性可升高58%。
②标本于室温（25℃）保存，2天内酶活性稳定，冰箱保存酶活性降低，－20℃过夜LDH3、LDH4则全部失活。
③用血清或肝素抗凝血浆测定结果满意，草酸盐可抑制LDH活性。
④复溶后溶液变浊或初始吸光度＞0.5应弃去。
⑤利用正逆双向反应均可测定乳酸脱氢酶活性，但因反应温度、底物和缓冲液浓度不同，其参考区间也有差异。以乳酸和NAD为底物，在340nm监测吸光度增高速率为正向反应，以LDL表示；以丙酮酸和NADH为底物，监测340nm吸光度下降速率为逆向反应，以LDP表示。正逆反应两法相比，LDL法的主要优点是：A.正向反应底物液的稳定性比逆向反应的稳定性大，前者冰箱可保存6个月以上，而后者仅几天；B.速率反应的线性范围（吸光度对监测时间t作图）较宽；C.重复性比LDP好。由于逆向反应速度比正向反应速度快，其参考值约为LDL的2倍。
（1）比色法：150～450U/L。
（2）连续监测法：男80～280U/L
女100～230U/L
LDH测定常用诊断心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤。
（1）心肌梗死：发病10～12h升高，24～48h达高峰，8～9天后恢复正常。与CK相比，虽然酶活性出现较迟，阳性率较低，但持续时间长，且活性增高的程度与心肌梗死的病情密切相关，梗死范围越大，其酶活性越高。若LDH增高后恢复迟缓，或在病程中再次增高，提示梗死范围扩大，预后不良。
（2）肝脏疾病：急性肝炎或慢性活动性肝炎LDH常显著或中度升高。其敏感度略低于ALT。肝癌时LDH活性明显升高，尤其是转移性肝癌增高更显著。可达1000U/L。
（3）血液病：白血病、巨幼红细胞贫血、恶性淋巴瘤等LDH活性升高。
（4）其他：营养不良、横纹肌损伤、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也升高。
临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。一、转氨酶及其同工酶（一）生物化学特性转氨酶或称氨基转移酶是一组催化氨基在氨基酸与a-酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和（天）门冬氨酸氨基转移酶（AST）是其中最重要的两种，前者俗称为谷丙转氨酶（GPT），后者为谷草转氨酶（GOT）。（二）体内分布AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心、肝、骨骼肌和肾等，肝中70%存在于肝细胞线粒体中。AST有两种同工酶ASTs 和ASTm，分别存在于可溶性的细胞质和线粒体。细胞轻度损伤时ASTs 升高显著，而严重损伤时，则ASTm大量出现于血清中。正常血清所含AST的同工酶主要为ASTs，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中以ASTm为主。ALT大量存在于肝脏组织中，其次为肾、心、骨骼肌等。血清ALT活性升高，通常表示肝脏损伤。ALT有两种不同活性的同工酶a（ALTs）、b（ALTm），分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。肝细胞坏死血清中以ALTm为主。（三）测定方法转氨酶的测定方法有许多种，其中以赖氏法最常用，由于此法操作简便、经济，一些小型实验室仍在使用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。ALT速率法测定中酶偶联反应式为： ALTL-丙氨酸 + a-酮戊二酸 L-谷氨酸 + L-丙酮酸 LD 丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ AST速率法测定中酶偶联反应式为： AST L-门冬氨酸 + a-酮戊二酸 草酰乙酸 + L-谷氨酸 MD 草酰乙酸 +NADH + H+ L-苹果酸 + NAD+ 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-DA/min)，计算出ALT、AST的活力单位。（四）临床意义ALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临床上主要用于肝脏疾病的诊断。各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起的急性肝损害时，血清ALT 水平可在临床症状（如黄疸）出现之前就急剧升高，且ALT＞AST。一般而言，急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如能同时测定AST，并计算DeRitis比值，即AST/ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断和鉴别诊断以及判断肝炎的转归也特别有价值。急性肝炎是时DeRitis比值＜1，肝硬化时DeRitis比值≥2，肝癌时DeRitis比值≥3。重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，血中ALT逐渐下降，而胆红素却进行性升高，出现所谓“酶胆分离”现象，常是肝坏死的前兆。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。AMI发病6～8h即升高，48～60h达到高峰，4d～5d恢复正常。但由于AST在AMI 时升高迟于CK，恢复早于LD，故诊断AMI价值不大。在急性肝炎时，AST虽亦显著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。胆道疾患时AST亦可升高。二、g-谷氨酰转移酶及其同工酶（一）生物化学特征g-谷氨酰转移酶（g-GT或GGT）又称g-谷氨酰转肽酶（g-GTP或GGTP），是一种含巯基的线粒体酶。组织分布以肾脏含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的g-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无g-GT，因此溶血对其测定影响不大。（二）测定方法目前国内外多采用连续监测法测定血清g-GT活性。IFCC参考方法采用L-g-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为g-谷氨酰基的受体。在pH7.7的条件下，g-GT催化底物生成g-谷氨酰双甘肽和黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与g-GT活性成正比关系。（三）临床意义g-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。g-GT 还可用于判断恶性肿瘤有无肝转移，肿瘤患者如有g-GT 的升高，常说明有肝转移。g-GT与乙醇的摄取量有关，对乙醇性中毒的判定有相当的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者常有g-GT升高。用醋纤膜电泳可将g-GT同工酶分为g-GT1、g-GT2、g-GT3和g-GT4四种，正常人只见g-GT2和g-GT3。重症肝胆疾病和肝癌时常有g-GT1出现，乙醇性肝坏死和胆总管结石时常有g-GT2增加，胆总管结石及胰腺炎时g-GT2也增加。g-GT4与胆红素增高密切相关。
修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
为了更好的提高微生物食品的安全性，对微生物的检验技术的发展就变得十分的重要。下面是我为大家整理的食品微生物论文，供大家参考。
【论文关键词】：食品微生物 实验教学 实验开放管理
【论文摘要】：食品微生物实验教学中,本文从精心选择实验内容,有效组织管理实验教学,引进综合考评机制并加强开放管理实验室方面进行思考和 总结 ,以期确保实验课安全、有序、成功的完成,达到教学目的。
实验教学是高等 教育 教学活动的重要环节。通过实验课不仅可以加深学生对课堂内容的理解,巩固已学到的理论知识,而且能够培养学生理论联系实际的能力、分析问题和解决问题的能力,对于活跃思维、提高创新能力起着积极的作用。
食品微生物学是食品专业学生必修的专业课,是普通微生物学的延伸。食品微生物学是一门实践性和应用性较强的学科,它要求学生在系统学习基础理论知识的基础上,掌握食品微生物学检测技术、分离纯化技术、鉴定技术、发酵食品的制备技术、食品加工与保鲜技术以及现代分子微生物学实验 方法 等。通过食品微生物实验教学培养出不仅具有丰富理论知识,而且能掌握现代生物技术并熟练操作的高技能人才。
如何加强食品微生物实践教学的组织指导,如何调动学生的积极性,提高实验教学效果一直是我们关注和探索的问题。下面简单谈一下我们在食品微生物实验教学中遇到的问题,解决的方法和对一些问题的思考。
1 精心选择实验内容,调动学习积极性
随着食品工业和微生物检测技术的迅速发展,食品微生物学及其实验课的内容也不断扩展,而实验课既受理论课内容进度的限制,又受课时及实验室等客观条件的限制。要在有限的课时内,系统、科学地完成食品微生物所有的实验项目是绝对不可能的,这就要求我们实验教师在掌握微生物学教学大纲的前提下,结合现代科技的发展和食品微生物的研究动态,精心设计实验课教学体系,合理选择实验项目。
选择实验内容,我们由浅入深,由感性到理性。首先要求学生对食品中常见细菌、酵母菌、霉菌、乳酸菌进行观察,掌握其性状特征和培养生长条件。学会识别哪些是有益菌,哪些是有害菌,利用有益菌的代谢活动制造更多的发酵产品,提高食品的质量,同时防止有害菌引起食品腐败变质以及食物中毒。其次选择有代表性的发酵食品作为实验内容,使学生了解利用微生物生产发酵食品的整个过程,通过这些实验使同学们对食品发酵有一个总体印象,并能举一反三。最后对不同的食品和发酵食品设计实验,让学生掌握食品微生物学检测技术、分离纯化技术、鉴定技术。并在课堂上结合自己的科研成果和食品研究 热点 介绍食品工业发展的前沿动态。
实验设计过程中,不仅有验证性实验,更多地引进了综合性和设计性实验,学生分成几人一组,让学生从实验设计,自己选择原材料,准备实验材料,试剂的配置,培养基的制备和灭菌等都由学生自己完成,最后写成规范的实验 报告 。学生对此积极性很高,甜酒酿、酸奶、腐乳等都是同学们喜欢并制作的发酵食品。在这个过程中学生将所学内容贯通,并熟悉掌握各个环节的操作步骤,这对学生将来步入社会,在工作岗位上独立开展工作都会有很大的帮助。
2 强化基础技能的训练,有效组织管理实验教学
食品微生物学是在掌握微生物的基本实验技能的基础上开展的,学生无菌操作观念的培养、正确使用、掌握微生物的实验仪器,如光学显微镜、灭菌消毒器械等都非常重要。但基于很多原因,学生的这些基础技能还是很薄弱,所以我们在进行食品微生物的每一个实验的每一个步骤中只要涉及这些基础性的知识,都会给予强调,亲自演示。
学生微生物基础技能培养和形成,不是一两堂课能完成,也不是单单有老师演示后学生就可以掌握,必须让学生每人亲自动手。但在实际教学过程中,由于学生人数的增加,硬件等条件限制,人手一套实验器材不现实,那么在有限人力、有限资源情况下,使每一位同学都能动手操作并熟悉实验过程,有效组织和管理实验教学过程就尤为重要。
(1)首先任课教师和实验技术人员充分做好预实验,对实验的关键步骤和关键操作点都做到心中有数,在授课过程中有重点地强调,并分析某步骤出现问题可能会出现的结果。
(2)每次实验之前任课教师和实验技术人员就实验进行积极的沟通,不仅对实验准备的物品和材料沟通,更要对实验的组织过程协商。
(3)在实验过程中则需要任课教师和实验技术人员相互协作,并充分发挥学生班干部和小组长的作用。课堂理论教学课和实验课最大的区别在于,实验课更注重学生的动手参与,以及实验过程出现问题发现问题的及时解决。 (4)教师要严于律已,教师要严格要求自己,实验过程中耐心指导,热情帮助,回答好学生提出的每个问题,并随时纠正不正确或不规范操作。
3 加强实验课考核,引进综合实验考评
实验课的成绩给定,往往包括实验课出勤率和实验报告成绩两方面综合。所以首先就要求教师认真考勤,只有学生的出勤率有保证才能有效地组织教学活动。其次,要求实验报告书写规范,详细完成实验报告,对实验结果进行讨论,实验失败要分析原因。同时教师也对实验报告认真批改,实验报告是对实验的总结,也是对实验课质量高低的检验。通过对实验报告的批改,可以发现学生的实验操作能力和观察分析问题的能力。
实际教学中,实验报告雷同和抄袭的现象比较多见,为综合考评学生实际动手能力和对实验技能的掌握,建议今后引进期末的综合实验考评:即将各个试验项目设计成不同的实验题目,让每个学生随机抽取并在有限的时间内独立完成操作,视完成的情况给予评分。比如:“食品中常见菌类的平板培养”考察了无菌操作、培养基的制备,对食品中常见菌类平板接菌技术;“食品中常见菌类的形态观察”考察了革兰氏染色,各真菌形态辨别等。在进行具体考核过程中,可把每个考核的内容进行量化定出详细的评分标准,根据学生的每一个操作环节现场打分,并对同学进行现场提问,让学生进行答辩。
4 有计划推进实验室的开放 加强实验室开放管理
微生物实验室的开放是对食品微生物实验课的有益补充,能强化、巩固、提升对食品微生物课程内容的理解,我们鼓励学生设计和开发自己的科研项目,而且学校有很优厚的资金加以支持。但是开放实验室不是无条件的,有时因实验操作不当引起的安全隐患是很严重和难以预料。因此实验室开放时管理须给予加强。
建立科学的管理机制,利用校园网建设实验网站,公布开放实验项目的题目、时间和地点,供学生选择和预约。
专人负责学生的科研队伍,对菌种、标准品、和学生用到的有毒有害物质要有专人负责,注意保管,不随意丢弃,做好无害化处理。对使用仪器学生做好使用登记,实验物品注意清洗、归还、交接。
总之,食品微生物实验课,只有提高对实验教学活动的认识,精心选择实验内容,合理有效组织和管理实验过程,并加强实验课的考核,在此基础上,推进实验室对学生的开放,加强开放实验室的管理,就能确保实验课安全、有序、成功的完成,达到教学目的,也使学生真正有所收获。
参考文献
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[论文关键词]：食品微生物 教学改革 多媒体课件
[论文摘要]：针对食品微生物学课程教学， 文章 从教学内容、教学手段、 教学方法 和成绩考核标准等几个方面进行了探讨，为食品微生物教学改革提供了新的思路。
食品微生物学是一门研究与食品有关的微生物的科学，通过对微生物的基本知识、基础理论和基本实验技能的教学，使学生能辨别有益的、腐败的和病原的微生物，从而在食品制造、保藏过程中，充分利用有益微生物，控制有害微生物的活动，以防止食品的变质[1]。该课程内容多，涉及面广，技术性实用性强，是食品专业的专业基础课程。在教学中，除重视基础理论知识、基本操作技能的传授外，也注重了培养学生分析问题、解决问题的能力，做法和体会如下：
一、变学生被动为主动，变换教学立场
教师的备课不是简单的“背课”[2]，是在对教学内容熟悉的基础上，优化内容，根据食品微生物学知识体系的要求合理分配教学时间，增加学生在课堂上的参与和主动，启发引导学生完成学习任务，充分发挥教为主导，学为主体的作用。要改以往课堂以教师讲为主，学生被强迫坐于课堂，不能也不敢出声的传统教学模式，做到让学生“动”起来，让学生自身主动地进入到学习状态，增加学习兴趣，提高学习效果。
如“食品微生物学”与“生物化学”等课程相互渗透、相互联系，在授课时间上有前有后，为了避免相近课程某些内容重复，我们进行了授课内容的优化。对于先修课程生物化学，已讲过“物质代谢”内容，则以学生为主角，让学生课下查阅资料丰富相关知识尤其是一些科研论文(这样可以启发学生发现更多问题)，然后课堂向教师提问的方式来完成这部分教学内容。教师要根据学生提问的难易做到由浅及深地回答，帮助学生回顾已忘或还未掌握的内容。学生在提问时，允许学生充分发挥想象;老师答疑时要尽可能多联系一些日常生活的实例和本学科当前研究的最新进展，用简练、幽默、易懂的语言回答相关问题，这样既丰富了学生知识，又调动了学生积极性和趣味性，让学生在课堂上能够感觉到自己是课堂主角，要发挥主角作用。
二、善于利用多媒体教学资源
传统的板书加挂图的食品微生物教学模式已远远不能满足当今学生的信息量。计算机辅助教学成为当今教育科学及教学手段的重要组成部分[3]。多媒体技术应用于食品微生物教学中，使教学效果前所未有的提高。首先，多媒体技术使直观教学成为可能。将微观世界在课堂上生动再现，其效果胜过任何语言的描述。其次，多媒体提供的信息量远远大于传统教学模式。课堂上学生可以观看多幅图片，阅读多篇教学材料，这个数量可以是传统教学的几倍。第三，多媒体将多种教学资源进行了整合，提供了多种教学方法，如课件、动画、相关网络声像资料及新闻报道等。
食品微生物学，不仅内容丰富，涉及面广，发展迅速，而且个体微小，学生对它的认识远不如对宏观事物，再加上其营养方式、遗传类型多种多样、代谢机制错综复杂，学生往往感觉其知识繁琐、抽象和难以理解。针对这种情况，将多媒体技术应用到微生物学课程的教学，受到了学生的普遍欢迎。通过flash动画、PPT课件、高清晰显微照片、动态显微录像等CAI教学软件，使微观世界宏观化、教学内容形象化[4]。例如，把细菌、真菌、病毒的显微世界以色彩丰富、直观清晰、生动形象的三维画面或科教电影形式展示给学生，以动画的形式表现出细菌鞭毛的运动、T偶噬菌体的增殖、主动吸收的方式、细胞的分裂过程等内容。不仅激发了学生的学习兴趣，有助于学生的理解与接受，而且可突破教学中的难点，加大教学的信息量，提高讲课的效率。
三、采取形象化教学形式
在实际教学过程中要注重知识的逻辑性和系统性，强化抽象理论与具体实例结合，增加学生对抽象理论的感性认识和接受能力。食品微生物学主要讲解了微生物在食品生产、贮运及销售过程的利害影响，但由于微生物的自身特性，我们很难就只有显微条件下才能观察到的细小生物让其形象化，宏观化。虽然多媒体已经在此方面有了很大改善，但要做到与具体实例联系更加紧密，更加强化学生的感性认识，我们必须借助实际生产、生活中的例子来实现形象化教学。如，上课时我们将一些常见的白酒、红酒、酸乳、面包、酱类等发酵食品带入课堂来讲授微生物在发酵食品中的应用，并且通过与实验紧密结合，开展发酵酸乳来增强学生对微生物利用的认知，让学生自已亲自动手制作酸乳，品评自已的劳动成果，便于理解和掌握教学内容重点。再如讲到微生物对食品的危害时，我们选用了一些发霉的粮食、发霉的马铃薯以及发臭的肉和罐头等进入课堂，这样在理论讲解时有现实的例子，无论从教师的讲授还是学生掌握都因有了宏观感性认识而变得轻松容易。
四、调动学生兴趣，培养创新能力
兴趣是学习的动力，也是创新的动力，创新的过程需要兴趣来维持。教育学家乌申斯基说：“没有丝毫兴趣的强制学习，将会扼杀学生探求真理的欲望。”[5]食品微生物课堂教学中要注重培养学生的学习兴趣，养成学生良好的学习习惯，为学生创造性学习奠定基础。那么如何在微生物教学过程中做到调动学生兴趣，培养创新能力呢?我们主要从三方面来做起。第一，因材施教。学生的个性差异和智力发展情况各不相同，因材施教，对不同层次的学生实施不同程度的思维能力和创造能力，对不同层次的学生要有不同的评价标准和不同的目标要求。第二，以“新”为轴，调动学生学习兴趣。教学中突出“新”的理念(即运用新思想，联系新理论，列举新课题等)，在激发学生的学习热情，培养提出问题，解决问题的能力，积极参加各种学术讨论会，大胆提问等方面都无疑会起重要作用，同时还赋予学生宝贵的 创新思维 。第三，多样化传授知识。改传统课堂教学模式，引入食品中微生物变化的课外观察，自行了解微生物的生长变化;鼓励学生课堂提问，学生课外查阅资料课堂以报告会形式进行教学内容讨论;积极开展相关实验，引入校园河水中微生物检测实验，培养学生自行设计安排和完成实验的能力。
五、强化实验教学，重视动手能力
食品微生物学是一门实验性、技能性很强的专业基础课，这一学科的在校大学生踏上工作岗位前，普遍存在动手能力较差、实验技能欠缺的问题。充分利用现有的力所能及的各种条件,加强实验技能培训，是最快捷有效的弥补方法。
(一)课堂实验
食品微生物实验课开始时，讲明实验目的、要求、步骤和注意事项，努力使实验成功的要求变成学生头脑中的指令，使每位同学都全神贯注地投入到实验当中去。从最基本的操作技术做起，抓住实验课上一切可以利用的机会，采取多种形式强化基本技能。具体如下：
最初，教师进行实验目的、要求、步骤和注意事项的详细讲解。
其次，以多媒体的形式将预先录制的实验过程向学生播放。这样既可以回顾理论教学内容加深实验印象，又可使学生初步了解实验过程、实验步骤及实验中的关键操作，帮助掌握实验技能。
再次，教师与学生同时进行实验操作。这样进行实验，学生在观看了录像后对部分仍不明白或是记忆不清楚的地方可以通过教师演示与他们实验的同步，进行实验信息交换，从而让学生能够最短最及时最迅速地掌握正确的实验技能。
最后，进行实验总结，认真完成实验报告的写作和批阅，从中找出问题并进行集中答疑，进一步修正学生实验中的错误。
(二)课外实验
不定期安排学生在课外做些简单实验或集中安排学生课外进行实验技能训练。如在讲微生物腐败变质时安排学生课外取一空矿泉水瓶内装入校园河流中比较清澈的水，然后进行封口存放，直至水质变化产生腥臭。让学生通过这种现象来强化课堂所学内容，起到了良好教学效果。再如集中学生利用课余时间进行校园河水中微生物检测实验，让学生以小组为单位独立完成从实验设计到完成检测报告一系列工作，并且最后进行结果评比。这样不但丰富了学生课余生活，而且还调动了学生的学习积极性，提高了学生的实际动手和综合运用知识的能力。
六、建立适合当代大学生的考核机制[6]，正确评定学生成绩
实行理论和实验考试分离，突出实验，综合评定的考试模式。改以往教师授课内容为蓝本，学生考前背，考后忘的非正常态考试模式。将理论考查内容面放宽加大，强调与实际食品生产的联系，将知识点以命题形式溶入现实生活，做到“学以致用”。实验考试采用笔试和操作各占一半的命题形式，做到实验理论和实验操作并行，要求学生在规定时间内完成两部分命题，达到理论、操作都掌握的目的。实验笔试以实验基本原理和关键操作步骤为主要命题范围，实验操作以抽签形式定，内容均为食品微生物必须掌握的实验内容，如显微镜观察、细菌染色、细菌计数等。最后学生成绩由理论和实验两部成绩再结合平时的课堂提问及实验情况进行综合评定，给出学生一个公平公正科学的考核成绩。通过这种模式考试既要求学生掌握了食品微生物的相关理论知识，又培养了学生的实验操作技能，为以后的实际工作打下了坚实基础。
实践证明，我们进行的食品微生物课程教学改革的大胆尝试是成功的。教学内容的丰富更新、教学手段的现代化，考核机制的客观化，不仅提高了教学质量和教学效果，而且激发了学生的学习兴趣，拓宽了学生的知识面，增强了学生的动手能力，适应了现代社会对人才培养的要求。
参考文献
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[5]叶丹玲，如何在微生物教学中培养学生的创新意识[J]，宁波工程学院学报
摘要： 随着人类社会的进步，食品安全已经成为世界性的公共卫生问题，不仅影响到人类的健康，而且关系到国家的安全及稳定，大力发展科学技术，研究新检验方法，快速推广普及有效检测技术越显重要。本文介绍了免疫检测技术、分子生物学方法、快速测试片法、电阻电导测定法四方面的检测方法，并评述了他们的特点。随着生物等新技术新方法在食品微生物检验领域应用，文章对近几年食品微生物检测技术和方法进行介绍，这样做有效的提高了检测效率和检验速度。
关键词： 检测方法;微生物
0 引言
随着人们现代科学技术的发展，“细菌门”、“福寿螺”、“毒饺子”等名词的出现，食品安全问题越来越受到人们的重视，根据WHO统计，全球每年有近15亿人感染食源性疾病，其中70%是食品中致病微生物污染引起的。各个环节中都有污染微生物的可能，包括食品生产、加工、储存、运输、销售等，目前，微生物对食品的污染问题成为人们关注领域。
1 食品微生物分类及命名
微生物并不是生物学分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚至没有细胞结构的低等生物的统称。其群体非常庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物。细胞型微生物按细胞结构又分为原核微生物和真核微生物。
2 食品微生物检测技术及方法
2.1 免疫检测技术———酶联免疫吸附剂测定法 (ELIsA)[1]
免疫学是研究生物体对抗原物质免疫应答性及其方法的生物-医学科学。免疫应答是机体对抗原刺激的反应，也是对抗原物质进行识别和排除的一种生物学过程。现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。
酶联免疫分析法(ELIsA)是食品检验中应用的主要免疫检测技术。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。具体说就是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，即与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例。加入酶反应底物，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
2.2 分子生物学方法
2.2.1 核酸探针法[2] 核酸探针是将已知核苷酸序列
DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。与免疫学方法相似，探针也需要附加适当标记。以往研究的探针技术要使用放射性同位素，只在专门的实验室使用，而现在较热门的技术是以核酸杂交为基础的第二代技术一—比色计。该方法依赖核糖体RNA(tRNA)发育中储存的核酸成分进行检测。这种天然富含rRNA标靶序列的使用使得无辐射检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或者更高的灵敏度。总体说，核酸探针技术是一种较为理想的技术，特点是敏感、特异、简便、快速，缺点是一种菌就需要一种探针，目前尚未建立所有菌种探针，该技术还有待进一步发展，再者就是检验费用比较昂贵。
2.2.2 聚合酶链反应法(PcR方法)[2] 聚合酶链反应 (PCR)PCR是美国科学家Mllllis于1983年发明的体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。又称为基因体外扩增法，是一种体外选择性扩增DNA或RNA的技术。该方法通过对人工难以培养的微生物相应RNA或DNA片段扩增，检测扩增的产物含量，从而快速对饲料中致病菌的含量进行检测。PCR技术可直接检测样品中痢疾杆菌，大肠杆菌、乳酸杆菌、肉毒梭菌等。
2.2.3 快速测试片法 快速测试片法是利用无毒的纸膜、纸片、胶片为培养基载体，快速、定性和定量检测试纸和胶片的食品微生物检测方法，它是一种集现代化学、高分子科学、微生物学于一体的检测方法。对有些项目的测定，其准确度和精确度高，几乎与标准方法相媲美。其优点：第一，常规法需要时间较长，而且温度要求严格，而测试片操作简单，大大缩短了测试时间，以往许多实验室不能实施，不能达到及时检测的目的。第二，快速测试片可以在取样时同时接种，防止延长接种时间时由于细菌繁殖造成的数量增多，结果更能反映当时样本中真实的细菌数。第三，测定少量样品，不需配试剂，价格低廉，可随时进行，便于运输，携带方便，易于消毒保存，操作简便快速。
2.2.4 电阻电导测定法 电阻电导测定法原理是：在细菌生长繁殖期间，将大分子物质(蛋白质、糖类等)分解成有机酸、氨基酸等带电荷的小分子物质，改变其培养液的导电度。这样，通过电阻和导电度的数值变化，就可推算出样品含菌数。目前已开发出来的电阻电导检测器有：美国Vitek公司生产的Bactometer可适用于检测肉品、乳制品等含菌量;英国推出的Mathus系统，可用来检测牛乳、酿造液、鱼及海产品的含菌量[3]。
3 结束语
随着人们生活质量的不断提高，食品安全问题已逐渐成为世界性公共卫生问题，直接关系到人类的健康。本文中罗列了几个方面的食品中微生物的检测技术，虽然很多技术依然存在一定的问题，有的属于世界前沿，有的还处于发展阶段，但其应用价值日显突出。
参考文献：
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